基于Notch信號通路探討外用中藥在慢性難愈性創面中的應用*

陳思琪,黃子慧

南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院,江蘇 南京 210021

慢性難愈性創面是指經1個月以上臨床規范治療仍未愈合也無愈合傾向的創面[1]。在各種病理因素的影響下,創面自我修復機制紊亂,無法按照正常愈合階段達到解剖和功能上的完整性,就形成了慢性難愈性創面[2],其類別主要包括靜脈性潰瘍、缺血性潰瘍、壓力性潰瘍、代謝性潰瘍及感染性潰瘍等[3]。該病治療難度大、時間長、費用高,且并發癥多、病死率高,嚴重損害患者的身心健康和生活質量[4]。隨著社會人口老齡化,該病發病人數日益增加,給社會帶來巨大經濟負擔,已成為外科臨床研究的難點和熱點。

慢性難愈性創面的形成機制十分復雜,一方面是當機體受損后,免疫系統激活,大量細胞因子、趨化因子、蛋白水解酶和活性氧被免疫細胞釋放,免疫細胞的過度增長和炎癥反應時間的延長使傷口修復過程失調[5-6];另一方面則是血管新生減少,創面血氧供應不足導致膠原蛋白合成不足,成纖維細胞、表皮細胞的增殖和遷移受限,也導致創面愈合延遲[7]。

Notch信號通路是一個在進化上非常保守的跨膜受體蛋白家族,能夠調控多種細胞的生長、發育、分化和凋亡,在組織重塑過程中發揮重要作用[8]。該通路由4種受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和5種配體(DLL1、DLL3、DLL4,JAG1、JAG2)組成[9]。大多數情況下,相鄰細胞膜上的Notch受體與配體結合后,γ-分泌酶復合物水解被激活的受體,水解的Notch細胞內結構域(notch intracellular domain,NICD)通過其核定位信號易位至細胞核,結合并激活DNA結合重組信號結合蛋白Jκ(RBP-Jκ)影響Notch靶基因轉錄,從而促進Hes和Hey在內的一系列下游靶基因的表達,發揮其生物學作用[10-11]。

研究表明,Notch信號通路在多種慢性難愈性創面修復中發揮重要作用,主要與其參與調控上皮巨噬細胞和血管內皮細胞再生等傷口愈合階段、促進血管生成、參與細胞遷移及上皮化形成等作用相關[12-15]。

1 Notch信號通路參與慢性難愈性創面的發展與修復

1.1 Notch信號與巨噬細胞極化巨噬細胞是一群具有高度可塑性和異質性的免疫細胞,貫穿了整個創面修復過程。巨噬細胞的表型和功能在不同刺激因子作用下可發生改變,極化為M1型和M2型[16]。M1型是經典活化型巨噬細胞,可分泌大量炎性細胞因子和趨化因子,促進免疫應答,在創面修復早期——炎癥階段發揮重要作用[17]。M2型是交替活化型巨噬細胞,可分泌大量抑炎細胞因子發揮抗炎效應,并促進組織修復與再上皮化[18]。由于巨噬細胞極化是動態可逆的,因此促進巨噬細胞由M1向M2型轉換是創面由炎癥反應轉為修復性反應的關鍵[19]。

巨噬細胞上的Notch信號能促進巨噬細胞向M1型極化,并激活巨噬細胞促進炎癥反應的發生[20]。研究表明,DLL4/Notch1軸在促進巨噬細胞M1型極化方面起關鍵作用,同時能夠阻斷巨噬細胞M2型極化[21]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)通過激活巨噬細胞Notch1/核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路誘導M1型巨噬細胞極化,特異性敲除巨噬細胞Notch1可以減少LPS誘導的M1型巨噬細胞極化,減少炎癥因子分泌[22]。此外,還有研究發現Notch信號通路可通過激活下游信號分子Hes1調節巨噬細胞表面的 SIRP-α蛋白從而使巨噬細胞的表型向M1極化[23]。

Notch通路對巨噬細胞表型的調控作用與其他多條信號通路存在相互協調作用。研究發現,Notch1通過NF-κB轉錄途徑促進M1型巨噬細胞極化[20]。NF-κB通路還是TLRs和Notch通路的交集通路。在誘導M1型巨噬細胞極化的過程中,Notch通路與TLR通路之間存在相互作用,是通過上調NF-κB促進IRF8蛋白合成實現的[24]。NF-κB蛋白還可通過直接與NICD結合獨立于RBP-J而起作用,激活非經典Notch信號通路[25]。研究發現,紅景天苷在抑制M1巨噬細胞活化的同時下調了Notch1、Hes1的蛋白表達,其作用機制可能是通過抑制NF-κB通路的活性實現的[26]。

1.2 Notch信號與炎癥反應創面炎癥反應可刺激產生細胞因子并募集中性粒細胞和巨噬細胞,吞噬并能夠清除創面細菌和其他異物,促進創面愈合。然而,創面炎癥過度表達則會導致創面組織的穩態失衡和愈合延遲[27]。創面炎癥反應受到炎癥因子、趨化因子、生長因子等多種細胞因子的調控。

研究表明,在創面愈合過程中,Notch信號缺失能夠降低炎癥細胞因子的表達,導致創面早期愈合延遲;而在創面愈合晚期,巨噬細胞中Notch信號的激活有可能會導致創面過度炎癥反應,抑制Notch信號可以降低炎癥因子的表達,促進創面修復[28]。

白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等是重要的炎癥因子,對早期創面愈合有重要作用。TNF-α可通過誘發多種炎癥因子的表達、調節免疫功能和促進角質細胞的遷移與增殖等方式促進創面的愈合[29]。IL-1能夠增強白細胞與內皮細胞的黏附、促進成纖維細胞增殖[30]。IL-6能夠激活機體的防御機制,參與炎癥反應和免疫應答,以防機體進一步受損[31]。研究表明,高水平的炎癥因子伴隨著Notch信號的激活,抑制Notch信號通路則能夠抑制炎癥因子的過度表達[32-33]。

炎癥早期釋放的炎性介質能夠促進金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的表達。MMPs是一組內在Zn2+外在Ca2+依賴性酶家族,高水平的MMPs一方面可引起細胞外基質廣泛水解,基膜破壞,進一步加重炎性細胞浸潤;另一方面可通過降解血管管壁細胞外基質結構骨架抑制血管重塑,最終導致潰瘍不易愈合[34-35]。許多研究證明,MMPs的異常表達是糖尿病足潰瘍、慢性下肢潰瘍等多種慢性難愈性創面愈合受損的關鍵因素[36-37]。在糖尿病動物模型中,抑制Notch信號通路能夠降低 MMP-9 的過表達,從而維持細胞外基質穩態,改善膠原的累積,加速創面的愈合[38]。在燒傷家兔模型中,阻斷Notch通路后,MMP-2、MMP-9生成增多,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth tactor,VEGF)和VEGFR-2生成減少,血管生成被抑制,創面愈合受阻[39]。

1.3 Notch信號與新生血管生成新生血管是創面血氧供應和營養的保證,其形成過程主要包括內皮細胞芽生、尖端細胞遷移、莖細胞增殖等[40]。VEGF家族是血管新生和修復的關鍵因素,主要通過與其家族受體VEGFR相結合來調節血管內皮細胞的遷移、增殖和募集,并促進血管通透性增加[41]。VEGF通路及其下游Notch信號是新生血管形成的關鍵調控因子,尖端細胞和莖細胞的生成過程受其調節[42-43]。

DLL4作為Notch信號通路的配體之一,當血管生成時,主要表達在血管出芽最前端的內皮尖端細胞,它與VEGF一起相互作用共同調控莖細胞與尖端細胞的分化、遷移和增殖等過程[10,44]。VEGF作為DLL4上游的信號調節因子,能增加DLL4的表達,而DLL4是通過上調VEGFR1、下調VEGFR2來抑制血管內皮細胞的過度增殖[45]。即VEGF對DLL4/Notch信號通路具有正向調控作用,而DLL4/Notch信號通路能夠對VEGF進行負反饋調節。在血管內皮細胞中,DLL4/Notch信號通路的主要作用是抑制新生血管過量芽生,避免血管生成不良,改善血管灌注,促進功能血管網的形成[46]。有研究報道,消腫止痛合劑可以通過抑制 Dll4/Notch 信號轉導促進新生血管生成,增加大鼠皮瓣微血管數量、密度,進而提高皮瓣成活率[47]。

JAG1是正常血管新生的關鍵調節因子,廣泛表達于內皮細胞的尖端細胞中。JAG1的表達上調,能促進血管出芽、分支,是加快內皮損傷修復的重要途徑[48],而內皮細胞上JAG1的缺失可導致血管平滑肌和血管出現致命缺陷[49]。JAG1能夠拮抗DLL4介導的Notch信號通路的抑制血管芽生作用[50],還可以直接傳遞JAG1/Notch信號給尖端細胞來調節VEGFR3的表達,以促進血管生成[51],截斷Notch1/JAG1信號通路[46]。有學者建立小鼠遺傳模型,觀察JAG1在傷口愈合動力學和血管生成中的作用,發現血管內皮細胞JAG1的過度表達增加了血管密度、成熟度和功能性,從而加速了傷口愈合[52]。

1.4 Notch信號通路與細胞增殖、遷移與上皮化成纖維細胞在組織修復過程中起到重要作用,當組織受損時,成纖維細胞能夠分化為肌成纖維細胞并產生豐富的細胞外基質和膠原纖維,提供結構支架,與新生毛細血管等共同形成肉芽組織填補傷口缺損,為表皮細胞的覆蓋創造條件[53]。在慢性創面愈合過程中,成纖維細胞向肌成纖維細胞分化受阻,傷口無法通有序愈合[54],其作用機制可能與Notch通路的調控作用有關。有學者觀察到DAPT阻斷或抑制Notch信號后成纖維細胞增殖明顯減少,分化能力也逐漸減弱[55-56]。激活成纖維細胞上的Notch信號通路能夠促進α-平滑肌肌動蛋白(α-smoot muscle actin,α-SMA)分泌,而α-SMA是成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化過程中的特征性表達[57]。用JAG1處理的角化細胞上清液培養成纖維細胞可促進成纖維細胞增殖以及I型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白分泌[58]。

人角質形成細胞(human normol keratinocyte,HNK)占上皮細胞的80%,在分化過程中可合成角蛋白構成皮膚角質層。當創面受損時,HNK通過改變自身表型降解與鄰近細胞間的連接,從損傷邊緣遷移至損傷局部并增殖[59-60]。HNK的適當遷移和增殖是創面再上皮化的保障[61]。反之,HNK增殖受阻則會導致慢性難愈性創面的發生。研究表明,激活Notch信號通路能夠提升人永生化角質形成細胞(human keratinocytes,HaCaT)的增殖和遷移能力[62]。有學者構建Notch信號通路激活的HaCaT與成纖維細胞共培養系統,發現用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路后,角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 的分泌會明顯下降[55]。敲低HaCaT細胞中NCSTN基因可以降低γ-分泌酶活性,削弱其對Notch信號通路的抑制,促進HaCaT細胞增殖[63]。王義等[62]報道人脂肪干細胞通過Notch信號通路促進裸鼠創面上皮再生與愈合,其機制可能與促進HNK的增殖與遷移有關。在兔耳創傷模型研究中,通過激活與阻斷JAG1/Notch信號通路比較發現,Notch信號通路通過改變HNK表型影響其增殖、分化及分泌特性[58]。

表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)是廣泛存在于人體多種組織的一種多肽因子,與其受體EGFR結合后可激活調控細胞增殖的調節生長基因,具有刺激HNK增生、分化,加快創傷愈合的作用[64-65]。Notch1通路也是HNK增殖的關鍵因素。然而,Roy等[66]研究發現,EGF能夠對Notch1的表達產生負面影響,并猜測這可能是因為HNK的最佳增殖狀態需要一個適合的Notch1表達水平,而EGF通過調節Notch1的表達來維持這種平衡。研究發現,EGF與Notch1信號通路存在著交互作用,其受體EGFR能夠負向調節Notch1,維持細胞的增殖,并抑制細胞的分化[67]。王建峰等[68]研究發現,黃芩苷抑制HNK的活性的機制可能與抑制Notch信號通路活性有關,這也從另一方面驗證了Roy的猜想。

表皮干細胞(epidermal stem cells,ESCs)通過免疫調節、表皮再生、血管再生和膠原沉積等作用參與創面修復的全過程[69]。機體損傷后,ESCs遷移到損傷部位參與受損組織的再生,刺激駐留祖細胞的增殖和分化,通過分泌生長因子和重塑基質促進損傷細胞的修復[70-71]。施彥等[72]研究發現,大鼠慢性潰瘍模型中創面組織免疫組化染色BrdU/Hes1雙染陽性細胞率上升,JAG1、Notch1表達上調,并據此推測JAG1與Notch1結合后激活Hes1通路,參與并促進ESCs的增殖,加速創面愈合。Yang等[73]研究表明,下調Notch信號通路的JAG1配體能夠顯著降低ESCs的體外遷移。此外,在糖尿病小鼠創面模型中,過度表達的JAG1能夠促進皮膚善創面愈合,其機制可能與JAG1促進ESCs的遷移有關。還有報道稱Notch信號高度激活能夠促使ESCs分化為角質形成細胞[74]。

2 外用中藥靶向Notch信號通路干預慢性難愈性創面

慢性難愈性創面在傳統醫學中尚未發現明確病名記載,根據其臨床表現可歸為“瘡瘍”范疇,病因病機多為臟腑虧虛、濕熱互結、氣血瘀滯,日久臟腑功能失司,營衛阻滯,肌膚失養,久而創面潰爛,纏綿難愈[75]。《醫學源流論》云:“外科之法,最重外治。”外治之法可使藥力直達病所,提高臨床療效。中藥及其復方制劑外用治療慢性難愈性瘡面療效顯著,種類繁多,然而其中大部分作用機制尚不明確。

2.1 中藥單體外用中藥能夠多靶點干預慢性難愈性創面的發展與轉歸,但中藥復方成分復雜,作用機制尚不明確。目前,直接使用中藥單體外用治療慢性難愈性創面的研究相對較少,能夠靶向Notch信號通路作用的主要有紫草素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)。紫草具有清熱解毒、活血消腫的功效,現代藥理學研究發現,從紫草中萃取的紫草素是茶醌類天然色素,以紫草醌及其衍生物為主要成分,具有抗炎、殺菌等作用,對皮膚潰瘍愈合有重要作用[76]。研究發現,紫草素外用可降低糖尿病大鼠慢性潰瘍創面炎癥指標,提高創面肉芽組織中羥脯氨酸含量,促進膠原合成,上調VEGF,下調Notch1蛋白表達,促進新生血管形成。謝軍等[77]認為,紫草素可能通過協調VEGF通路與DLL4/Notch1通路之間的負反饋機制來促進新生血管的形成及創面愈合。陳微等[78]通過體外研究發現,紫草素呈劑量依賴性地抑制HaCaT細胞的增殖,并誘導細胞凋亡,Notch-1信號通路在其中起了重要作用。EGCG是從茶葉中分離出的兒茶素類單體,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[79]。EGCG能夠通過抑制Notch1信號通路的活化調節早期炎癥效應[80-81]。研究表明[82],EGCG可直接與小鼠巨噬細胞中Notch1特異性結合,降低糖尿病小鼠創面Notch1表達水平,進而下調炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達,減輕巨噬細胞介導的炎癥反應,促進創面愈合,其作用機制可能與促M1型巨噬細胞向M2型極化有關。

2.2 中藥復方外用中藥復方制劑以其安全有效的優勢被廣泛應用于慢性難愈性創面的治療中,目前報道靶向Notch通路治療慢性難愈性創面的主要藥物有生肌橡皮膏、紫朱軟膏及肛癰方。其中生肌橡皮膏應用較為廣泛,由當歸、生血余、橡皮粉、生地黃、生石膏、龜甲、爐甘石等組成,主要功效為生肌斂瘡,能止癢收斂,吸收創面分泌物,起到防腐收斂,保護創面的作用[83]。朱朝軍等[84]觀察到生肌橡皮膏在促進糖尿病大鼠潰瘍早中期愈合的過程中,隨著瘡面面積的縮小,組織內VEGF的表達先升高后降低,而Notch1在組織內的表達趨勢與VEGF相反,這表明生肌橡皮膏在促進創面愈合的過程中Notch信號起到一定干預作用,其作用機制可能與促進血管新生相關。李博文等[85]應用生肌橡皮膏治療糖尿病大鼠足潰瘍,發現創面Notch1的表達被抑制,同時炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達下降,創面炎癥反應減輕,愈合速度加快。羅澤琴等[86]將自制生肌膏運用于肛周膿腫術后,發現其可促進大鼠肛周膿腫術后創面愈合,其作用機制也與抑制創面Notch1表達,下調炎癥因子水平相關。紫朱軟膏主要由紫草、朱砂、阿膠、龍血竭、冰片、黃芪制成。方中紫草活血涼血,朱砂解毒祛腐,二者同為君藥,共奏清熱解毒祛腐之效;黃芪補氣生肌,阿膠補血滋陰,血竭活血定痛、生肌斂瘡,為治療潰瘍不斂的主要藥物,共為臣藥;冰片為佐藥,能夠通透肌膚、鎮靜止痛。諸藥合用,共奏清熱解毒、祛腐生肌、補氣益血之功效[87]。韓強等[88]報道紫朱軟膏可能是通過抑制Notch信號通路來降低糖尿病足潰瘍大鼠創面炎癥因子和炎癥趨化因子水平,減輕創面炎癥反應強度,并提高生長因子TGF-α、TGF-β表達,促進創面愈合。肛癰方主要由當歸、黃柏、延胡索、乳香、珍珠粉和冰片組成。方中水牛角清熱涼血、解毒定驚,牡丹皮清熱涼血、活血化瘀,兩藥配伍活血化瘀,能夠促進創面血液循環,增加血管通透性,有效緩解創面水腫及滲液;黃芪升陽舉陷、托毒生肌;穿山甲與皂角刺二藥相須為用,具有消腫散結、托毒透膿之效。研究發現[89],肛癰方能夠通過下調創面炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α水平,有效抑制大鼠肛周膿腫創面炎癥反應,促進創面愈合,其機制可能與下調Notch1、TGF-β1的表達有關。

3 小結

Notch信號通路作為人體內重要的信號轉導途徑,參與多種生理活動,可以通過調節巨噬細胞極化、促進炎癥反應、促進血管新生、加速創面再上皮化等多種途徑參與慢性難愈性創面的修復。目前,關于Notch信號通路在慢性難愈性創面中的研究仍存在以下問題:(1)有關Notch信號通路在慢性難愈性創面中的研究不統一,通過激活或是抑制該信號通路從而達到治療目的仍有爭議,這可能與研究所使用的動物模型、創面類型與分期、具體作用機制有關;(2)通過該信號通路治療慢性難愈性創面作用的靶點尚不清晰,僅以少數幾個經典靶點蛋白做支撐,無法系統判斷該通路在慢性創面愈合中的參與程度,與其他信號通路之間的交互作用同樣缺乏系統研究;(3)大部分中藥復方制劑調控Notch信號通路發揮作用的具體機制尚不明朗,多是以某一下游或上游關鍵靶點蛋白表達水平做支撐佐證相應的觀點,少有對多個靶點蛋白進行系統的研究。今后,還需進一步明確各靶點間的相互作用,對中藥靶向Notch通路治療慢性難愈性創面進行更為系統的研究,有助于該病特異性治療藥物的研發。