乳腺癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as及miR-483-5p表達特點及臨床意義

沈蓉 陳淼

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，且有發(fā)病率逐年升高和年輕化的趨勢。盡管早期發(fā)現(xiàn)和放療可以顯著降低乳腺癌的病死率，但是乳腺癌的高轉移性和高擴散性使患者的預后較差[1，2]。環(huán)狀 RNA CDR1as 和miR-483-5p 是一類非編碼RNA，不僅參與細胞的增殖、遷移和凋亡，還參與先天免疫等，而且在多種疾病的發(fā)病中起著至關重要的作用[3，4]。Ren 等[5]證實miR-483-5p 基因在乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達存在差異，miR-483-5p 在正常組織中的表達水平較低，但是其與乳腺癌的關系以及是否可以作為乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關鍵因子尚不清楚。基于此，本研究通過探討乳腺癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達特點，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月～2021年3月我院50 例乳腺癌患者的病理腫瘤樣本作為實驗組，配對的癌旁3cm 正常乳腺組織樣本作為對照組。本研究經過我院倫理委員會批準，并在患者知情同意的情況下使用臨床樣本，記錄患者生存情況以及臨床病理學資料，包括患者的TNM 分期、腫瘤分化程度、年齡、腫瘤大小及淋巴結轉移等，同時對患者進行術后隨訪。

納入標準：①組織樣本總長度超過1.5cm；②樣本符合診斷標準和免疫處理，且不屬于疑難病例；③所有樣本均經病理學證實，患者術前未接受過任何治療，且無其他惡性病史；④臨床資料保存完整，收集的組織凍存于液氮中。排除標準：①樣本來源患者不同意該實驗措施且未簽訂知情同意書；②未經倫理委員會批準同意的樣本。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 原位雜交檢測試劑盒（MK1030，武漢博士德公司）；寡核苷酸探針稀釋液（武漢博士德公司）；DEPC（Sigma 公司，美國）；DAB 顯色試劑盒（北京中杉公司）。HT-1 組織芯片制備儀（遼寧恒泰公司）。環(huán)狀RNA CDR1as 正向引物：5′-GAAA ATCCACATCTTCCAGACAA-3′，反向引物：5′-GAAG ACATGGATATTGAGCCAGT-3′。miR-483-5p 正向引物：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反向引物：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.2.2 組織芯片制備 采用定位儀對典型部位進行標記，并進行 HE 染色。在每個樣品中選取3 個基因位點，利用HT-1 組織芯片制備機制造芯片，以1mm 為中心，以4μm 為基準，連續(xù)切片，然后進行HE 染色。

1.2.3 原位分子雜交 嚴格按原位雜交試驗試劑盒中的說明書進行。具體操作步驟：將探針滴入薄片，按1:400 的比例，42℃恒溫雜交16h。用37℃溫水浴對抗體進行1h 的免疫反應，然后用 DAB 顯色儀對其進行染色。將其與建立的陽性組織作對照，建立一個負對照：用探針稀釋法代替探針。

1.3 觀察指標①對所收集到的染色強度進行半定量的綜合評價。陽性染色：乳腺上皮及細胞胞質均有顯著的黃褐色。染色強度等級：弱或不帶顏色為1 分，中度染色為2 分，強染色為3 分。陽性細胞計數(shù)：＜10%的細胞計數(shù)為1 分；10%～50%的細胞計數(shù)為2 分；＞50%的細胞計數(shù)為3 分。染色強度分數(shù)乘以陽性細胞計數(shù)分數(shù)為最終的統(tǒng)計分數(shù)，＞3分表示強陽性（高表達），1～3 分表示弱陽性（低表達）。②采用門診、電話或微信的方式隨訪記錄50例患者1年生存率及預后，患者死亡視為預后不良。

1.4 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件分析，計量資料用±s描述，行t檢驗；計數(shù)資料用百分率描述，行χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 分析，相關變量通過Logistic 回歸方程分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達水平比較實驗組環(huán)狀RNA CDR1as 表達水平高于對照組，miR-483-5p 表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

1 兩組環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達水平比較（±s）

1 兩組環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達水平比較（±s）

分組n環(huán)狀RNA CDR1asmiR-483-5p實驗組501.24±0.522.31±0.41對照組500.70±0.534.37±0.48 t 5.14223.193 P 0.0000.000

2.2 影響環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達水平的單因素分析飲食、體重和遺傳對環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達水平影響較小。腫瘤大小、TNM 分期和淋巴結轉移是影響環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p在乳腺癌組織中表達水平的重要因素（P＜0.05），見表2。

表2 單因素分析

2.3 多因素分析多因素分析結果顯示，腫瘤＞5cm、TNM 分期為Ⅲ期、淋巴結轉移陽性是影響環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達水平的重要因素（P＜0.05），見表3。

表3 多因素分析

2.4 乳腺癌患者1年生存率及預后50 例乳腺癌患者中RNA CDR1as 高表達、miR-483-5p 低表達共13例，死亡7 例，生存率為46.15%；兩者均低表達37例，死亡5 例，生存率為86.49%；Kaplan-Meier 分析顯示環(huán)狀RNA CDR1as 高表達、miR-483-5p 低表達是患者預后不良的危險因素（Log Rank Cox=5.307，P=0.021）。

3 討論

隨著腫瘤分子技術的發(fā)展和臨床經驗的積累，乳腺癌的治療手段也在不斷改進，但更高水平的早期診斷及高危患者識別，是先進治療手段發(fā)揮作用的前提。腫瘤的發(fā)生是由多個基因共同作用的，因此，利用分子生物技術可以為腫瘤的診斷和預測提供更好的方法，從而為腫瘤的治療提供依據(jù)[6]。miR-483-5p 是一種內源性非編碼RNA，其長度為22 個核苷酸，能直接切斷目標mRNA，或與目標mRNA 的3′末端互補或不完全互補，從而阻斷靶基因的mRNA 轉錄，在生命活動中起關鍵作用，甚至參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。環(huán)狀RNA CDR1as 是一類非編碼RNA，其作用機制主要是利用海綿對微小RNA 進行吸收。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA CDR1as 在很多實體腫瘤中均異常表達，而環(huán)狀RNA CDR1as的異常表達可以調節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移[8]。劉曉康等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p 可通過調節(jié)腎上腺皮質癌下游的基因家族成員而抑制其侵襲性，表明miR-483-5p 可能是一種惡性腫瘤早期診斷和預后指標。有研究表明，miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 可作為一種新的腫瘤診斷及預后指標[10]，然而，miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 在乳腺癌發(fā)病過程中的作用機制尚不清楚。

本研究通過檢測50 例乳腺癌患者的癌組織和50 例癌旁正常組織中環(huán)狀RNA CDR1as 的表達，發(fā)現(xiàn)癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as 表達水平明顯高于正常組織，miR-483-5p 表達水平低于正常組織，為進一步證實miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供了依據(jù)。張俊峰等[11]研究表明，miR-483-5p 基因的表達增加，對腫瘤細胞 EMT 有抑制作用，從而抑制了腫瘤細胞的浸潤和轉移。為進一步證實miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，本研究分析了環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達水平與患者預后的相關性，結果顯示環(huán)狀RNA CDR1as 高表達及miR-483-5p 低表達的乳腺癌患者生存率低，環(huán)狀RNA CDR1as 高表達、miR-483-5p 低表達是乳腺癌患者預后不良的危險因素（P＜0.05），分析其可能原因為：環(huán)狀RNA CDR1as 的過度表達能促進腫瘤的生長，而CDR1as 的表達可以促進腫瘤細胞的凋亡。抑制環(huán)狀RNA CDR1as對腫瘤細胞的浸潤、轉移有顯著的抑制作用，并能促進其凋亡，進而影響患者腫瘤分級及淋巴結轉移情況。Ulsh?fer 等[12]研究也表明，環(huán)狀RNA CDR1as 在癌組織中表達增高，并與腫瘤的大小、T分期、淋巴結轉移和預后有關。此外，RNA 沉默引起的環(huán)狀RNA CDR1as 高表達，可通過調節(jié)miR-7的表達，降低 REG-γ 基因的表達，增加了對抗藥性乳腺癌的抗藥性，進而影響患者預后。miR-483-5p 是一種具有潛在抑癌作用的miRNA，可抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。Rahmati 等[13]利用在線生物信息技術對miR-483-5p 進行了初步探索，證實DAPK1 為miR-483-5p 的直接靶向靶點，通過miR-483-5p 靶向DAPK1 抑制DAPK1 作用，進而降低乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并證實miR-483-5p在乳腺癌患者中高表達與其預后相關。表明miR-483-5p 有望作為一種新的乳腺癌治療生物目標，為乳腺癌患者提供新的療法[14]。

本研究顯示，環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達水平與腫瘤＞5cm、TNM 分期Ⅲ期、淋巴結轉移陽性相關，但其具體影響機制有待于更多的研究證實。與正常乳腺組織比較，乳腺癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as 的表達升高。環(huán)狀RNA CDR1as 基因的表達與其臨床病理特點之間具有相關性。Belter 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA CDR1as 在癌組織中的表達水平明顯增高，而環(huán)狀RNA CDR1as 通過調節(jié)細胞基因，誘導其腫瘤細胞增殖分化，可能解釋了環(huán)狀RNA CDR1as 以及miR-483-5p 在乳腺癌組織中的表達水平與腫瘤＞5cm、TNM 分期Ⅲ期、淋巴結轉移陽性間的關系。

綜上所述，乳腺癌組織中RNA CDR1as 高表達及miR-483-5p 低表達與乳腺癌的不良預后相關，檢測環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 的表達水平，有利于診斷乳腺癌以及評估預后。