血小板功能檢測在血栓性疾病診斷中的研究進展

張帆 閆本純 李琪 路瑤 李晨 李春燕 馬思琦 閆海潤

血栓性疾病包括靜脈血栓性疾病及動脈血栓性疾病，嚴重損害人體健康，其是凝血和纖溶系統功能失調，以及凝血- 抗凝系統不平衡所致[1]。而血小板在原發性止血和血栓形成過程中起著關鍵作用，監測其異常活化對了解血栓的發生、發展至關重要。既往一些實驗室指標，如D-二聚體（D-Dimer，DD）、纖維蛋白原降解產物（Fibrin degradation products，FDP）等對血栓性疾病的預測與評估已得到了較好的應用。隨著對血小板功能了解的不斷深入，通過對其部分檢驗指標如膜蛋白、血小板微粒、血小板釋放活性物質、外泌體、特異性血小板標志物等的檢測，對血栓性疾病的分型、診斷、機制等研究有了更具針對性的觀點。隨著檢測手段的不斷提高，血小板功能檢測出現許多新方法，為血栓性疾病早期診斷、治療、監測及機制的研究提供準確的實驗依據。現對近年來血小板功能檢測在血栓性疾病診斷中的研究進展進行綜述，并介紹一些診斷血栓性疾病的方法學應用。

1 血小板功能與靜脈血栓性疾病

靜脈血栓栓塞癥（Venous thromboembolism，VTE），包括深靜脈血栓栓塞（Deep venous thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞（Pulmonary thromboembolism，PTE）[2]。在靜脈血栓形成過程中，其機制主要包括局部炎癥反應和血液高凝狀態兩個方面。局部炎癥以內皮細胞活化為特征，內皮細胞活化后釋放Webel-palade小體，并含有血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）以及與膜結合的P 選擇素。這兩種蛋白都可與血管內皮細胞表面發生黏附，分別通過與白細胞表面的P 選擇素糖蛋白配體1（PSG-1）和整合素αMβ2結合而激活白細胞。局部炎癥與血栓相互促進，加速靜脈血栓形成[3]。血小板功能中的血小板微粒、P 選擇素、硫醇異構酶等指標對VTE具有潛在的預測能力。

1.1 血小板微粒微粒最初被認為與血栓性疾病有關是因其表面具有促凝作用的磷脂，尤其是磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS），增加了凝血因子Ⅷ與凝血因子Ⅸ、凝血因子V 與凝血因子Ⅹ結合的親和性，因此使因子凝血酶原酶復合物與X 酶復合物的生成效率更高[4]。在血液循環中，大部分微粒是由血小板產生的，也就是血小板微粒（Platelet microparticle，PMP）。PMP 水平增高表明患者處于高凝狀態，有較高的VTE 風險。另外，研究顯示，心房顫動患者發生血栓風險是竇性心律患者的4～5倍[5，6]。Siwaponanan 等[7]研究發現，房顫患者總循環微粒水平顯著增加，其中以血小板源性微粒及內皮源性微粒增加尤為顯著。Mavroudis 等[8]檢測了將要進行冠狀動脈介入治療的急性冠狀動脈綜合征（Acute coronary syndrome，ACS）患者冠狀動脈和右心房處的微粒含量，結果顯示，病變部位的冠狀動脈微粒含量相對于右心房處較高。與CT、MRI等影像學檢查相比，冠心病等心腦血管疾病中PMP的變化會出現的更早[9]。因此，PMP 可以被認為是預測血栓性疾病的敏感指標，是出現明顯臨床癥狀前的特異性生物標志物，對疾病的病情監測、診療及轉歸評估具有重要作用。

1.2 P 選擇素P 選擇素具有顯著提高血管通透性的能力，刺激病變區域的炎癥反應，并使血管痙攣明顯增加，血小板水平逐漸升高[10]。血小板膜糖蛋白GPIba 受體、P 選擇素與早期炎癥細胞發生協同反應，從而使白細胞的聚集加速。例如，白細胞整合素αMβ2 通過GPIb a 受體來調節血栓形成和DVT 的發展[11]。Mosevoll 等[12]評估43 種潛在的深靜脈血栓生物標志物，發現P 選擇素是對深靜脈血栓診斷良好的潛在生物標志物之一。P 選擇素高水平表達時可增加血栓形成的發生率，P 選擇素是DVT 的危險因素，可作為預測DVT 的檢測指標[13]。林毅秋等[14]對創傷性骨折深靜脈血栓形成的研究發現，P 選擇素會顯著升高。因此，P 選擇素作為血小板的特異性活化指標，通過檢測其水平可分析其與患者血栓形成風險及血栓病情演變的關系，提高對血栓栓塞風險預測及病情評估的能力。

1.3 蛋白質二硫鍵異構酶蛋白質二硫鍵異構酶（Protein disulfide isomerase，PDI）是一種在蛋白質合成中促進二硫鍵氧化、還原和異構化作用的細胞內酶[15]。從血小板和內皮細胞分泌的PDI 是所有血栓形成事件的重要因子[16]。因此，PDI 的血漿水平也可作為血栓性疾病的潛在生物標志物。血小板表面PDI 有望成為一種血栓治療的靶點。

VTE 的實驗診斷尚未達成一致，隨著對血栓性疾病的了解和檢驗技術的改進，通過為臨床提供早期、快速、經濟、高效的實驗室檢測手段，檢測血小板功能中的特異性生物標志物可指導臨床對高危人群早期明確診斷，監測治療效果，降低患者死亡率，提高患者生存質量。

2 血小板功能與動脈血栓性疾病

動脈血栓是致命性心腦血管事件的一種重要病理變化，早期發現血栓是降低死亡率的關鍵因素，但目前尚無有效的早期預警手段，凝血篩查暫且只應用于低風險人群，無法準確評判血栓風險、血栓形成以及由各種因素引起的血液高凝狀態[17]。ACS 是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發血栓形成的一組臨床綜合征。在ACS 的發生發展中，微粒的促凝活性會起到促進作用[18]。研究發現，動脈粥樣硬化的發生、血栓形成和血管痙攣是急性缺血性腦卒中（Artery ischemic stroke，AIS）發病的重要病理機制，血管受損、斑塊破裂、血流動力學紊亂引起血小板的活化，是AIS 發病的重要原因[19]。

2.1 基質金屬蛋白酶血小板包含并釋放多種基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs），MMPs是一類具有特定降解能力的鋅依賴性蛋白水解酶。MMPs 參與血管重塑、斑塊破裂、血栓形成等，并且有可能導致急性冠心病，如心肌梗死。MMP-2 和MMP-9 在血管病變中的表達增高[20，21]。MMPs 和肌鈣蛋白等標志物可共同用于ACS 的早期診斷檢測研究[21]。所以，檢測MMPs 和肌鈣蛋白水平對心血管疾病早期診斷具有重要意義，可加強臨床評估，并進一步減少對診斷成像研究的需求。

2.2 外泌體外泌體是由細胞分泌的一種膜囊泡，包含蛋白質、脂質和microRNA 等[22，23]。相較于其他血液成分，血小板分泌外泌體的量最多，內容物種類也最為豐富[24]。血小板不僅是血栓的組成成分，也可以通過分泌外泌體來抑制血栓的形成。Srikanthan 等[25]研究顯示，在血栓形成之初，血小板分泌外泌體攜帶的泛素化蛋白（Poly-ubiquitin）可泛素化降解巨噬細胞中CD36 蛋白，抑制巨噬細胞的載脂過程，并通過泛素化血小板表面CD36 蛋白抑制血小板自身的再活化和動脈血栓形成。因此，外泌體作為一種可預測血栓的血液診斷標記物，可對血栓性疾病提供輔助性診斷。

2.3 特異性血小板標志物CD62p 和CD63 是最有特異性意義的血小板活化分子標志物。CD63 通過與中性粒細胞接觸，遞送活化信息，從而使中性粒細胞變形、趨化、黏附，導致局部缺血病變的血管發炎，從而加劇局部組織缺血。CD63 在預測腦卒中事件和抗血小板治療方面有一定的作用。循環CD62p 在各種缺血性腦卒中患者中也有明顯升高。CD62p 在急性腦梗死中的表達水平可以評判病變區域血小板活化情況，對其病情及預后的判斷具有重要意義[26～28]。研究顯示[29]，AIS 患者CD62p 和CD63 的異常表達與AIS 的發生、嚴重程度等有關，CD62p、CD63 的動態變化特點對于確定最佳監測點具有重要價值。

通過檢測血小板的各項特異性指標，對動脈血栓性疾病進行早期預警、早期診斷、病情監測和針對性治療，在提高患者生存率、改善遠期預后及降低疾病致死率、致殘率方面具有重要價值。

3 血小板功能檢測方法

3.1 常用血小板功能檢測方法

3.1.1 光學比濁法（Light transmission aggregometry，LTA）LTA 作為一種檢測血小板聚集功能的方法，至今仍被視為檢測血小板功能的金標準。檢測原理：將血液通過離心方法分離出富含血小板血漿（PRP），在特定的連續攪拌條件下，加入誘導劑，隨著血小板聚集率增高，其透光度增加，用比濁儀檢測透光度的變化來評估血小板的聚集功能。其優點為操作簡單，應用廣泛；缺點為步驟較多，影響因素較多，需要規范的操作規程。

3.1.2 血栓彈力圖（Thromboelastography，TEG） TEG利用全血直接對血小板聚集功能進行檢測。檢測原理：模擬人體內環境下凝血-纖溶整個過程，聯合應用血流剪切力與不同誘導劑評價血塊形成。其優點為操作簡便，反映直觀的凝血過程；缺點為與LTA 法檢測結果的相關性上仍有爭議，價格昂貴，存在一定局限性。

3.1.3 快速血小板功能分析儀（VerifyNow） VerifyNow是目前歐美國家應用較多的血小板功能檢測方法。檢測原理：在抗纖維蛋白原包被顆粒介導下血小板聚集，在比濁法下，展示出透光性。其優點為用血量少，可床旁檢測，操作簡便；缺點為儀器試劑昂貴，成本高。

3.1.4 電阻抗法（Impedance platelet aggregometry，IPA）IPA 原理為血樣本中加入誘導劑使血小板活化，隨著血小板聚集率增高，全血電阻增高。其優點在于使用全血樣本，所需血樣少，操作簡便；缺點為耗時長，檢測結果受紅細胞比容和血小板計數影響。

3.1.5 血小板功能分析儀 通過計量全血在剪切流動下形成血小板栓子的時間，來反映血小板的黏附聚集功能。其優點在于檢測標準化的體外出血時間，可應用于嚴重血小板功能異常評價；缺點為缺乏公認的參考范圍和療效評估標準，標準化差[30]。

3.2 基因測序高通量測序（High-throughput sequencing，HTS）技術即第二代測序技術，通過構建一個文庫，將文庫與載體進行交聯擴增，在載體上進行基因的合成與測序，以獲得DNA 序列數據[31]。當抗凝蛋白基因出現功能缺失性突變時，會促進血栓發生。凝血因子的功能獲得性突變，會使血液凝固程度升高，導致血栓的形成。研究發現一例靜脈血栓患者FⅨ基因1151G/A 突變導致FⅨ氨基酸替換，即FⅨArg384Gln FⅨR384Q（含信號肽編碼）或FⅨR338Q（經典編碼）[32]。祁亞楠等[33]研究顯示，α-纖維蛋白原rs6050（Thr312Ala）基因位點攜帶C 等位基因的人群，更容易出現VTE。因此，C 等位基因檢測作為對VTE 高危人群的篩查是一種行之有效的手段，可以為VTE 的預防、診斷和治療提供參考。以上研究結果表明，基因檢測技術擴展了對血小板疾病的認識，具有很好的臨床應用效果，為未來的精準化基因治療奠定了基礎，值得在臨床上推廣。其不僅大大提高了疾病的診治水平，也為深入探討疾病的發病機制提供一個新方向。

3.3 人工智能近年來，研究表明人工智能（Artificial intelligence，AI）具有良好的診斷和預測靜脈血栓形成的能力，具有高靈敏度、特異性和ROC 曲線下面積值。基于AI 的VTE 質量控制系統實現了自動化、動態的過程防治模式，用新技術評估患者的風險，以增強預防意識，增加高危患者的預防比例，降低院內VTE 的發病率。隨著AI 在靜脈血栓研究領域的發展和應用，未來可以進行更深入、更準確的分析，從而開發出適用性強、便捷的AI 模型，在臨床實踐中廣泛應用[34，35]。

4 總結與展望

血小板是血栓性疾病形成過程中的重要組成部分，其過度活化加速了血栓性疾病的進程。目前，臨床上常用DD 作為預測指標，但其特異性較差。通過對血小板功能的各項特異性標志物進行檢測，在出現明顯臨床癥狀之前，進行風險預測、早期診斷、及時干預，對于提高患者的生存率和改善預后非常重要。常規的血小板測定方法有通過LTA 和TEG 檢測血小板聚集功能；血小板功能分析儀在剪應力下檢測血小板黏附聚集功能；流式細胞術測定血小板表面的抗原以測定血小板活化狀態等。常規血小板功能檢測有各自的優勢與不足，國內研制血小板功能快檢技術方面尚屬空白，一些血栓性疾病的實驗室檢測尚不具備金標準，對血栓性疾病的診斷有所滯后。血小板功能檢測對血栓性疾病的重要價值還有待進一步得到重視，逐步開展實驗室檢測項目應用于臨床。

近年來，基因測序作為一種重要的分子生物學技術，已在血栓與止血領域得到應用。檢測血栓性疾病的相關基因具有較好的篩選價值，也是臨床診療的重要手段。基因測序作為一種精準的檢測方法，使疾病的早期診斷有了更加可靠的依據，雖然目前尚未廣泛應用于臨床，卻是未來精準醫療的大勢所趨。AI 作為新興科技力量，具有良好的應用效能，有望在臨床大規模應用。