表觀遺傳調控植物葉片衰老的研究進展

陳 燁,劉平麗

(北京林業大學 生物科學與技術學院,北京 100083)

葉片是植物進行光合作用的主要器官,是植物生長發育過程中能量和營養物質的主要來源,葉片衰老是整個植物體衰老的重要部分。葉片衰老過程中,葉色由綠色變成黃色或紅色,細胞內細胞器發生解體、生理代謝和基因表達發生明顯變化[1-4]。葉片衰老涉及葉綠素和蛋白質等大分子物質的分解,營養物質從葉片供應給正在生長發育中的種子或者果實或者木本植物的根和莖。過早衰老會降低作物的產量和質量,限制花卉瓜果的觀賞和保存,也會影響多年生植物如樹木次年春天葉芽和花芽的生長發育[3-4]。因此,有序的葉片衰老是確保植物產生優良后代和更好生存的關鍵過程。

葉片衰老具有年齡依賴性,主要受發育調控,但同時也受內部和外部環境因素如激素、光照、溫度及脅迫因子的影響。它們相互作用形成一個復雜且環境敏感的調控網絡在時空上精確調節葉片的衰老過程[4-6],引起衰老相關基因表達模式的變化[7]。植物衰老過程中,表達上調的基因,被稱為衰老相關基因(senescence associated genes,SAGs)。目前在擬南芥、玉米、小麥、番茄和木本植物楊樹等多種植物中已經分離出數千種SAGs,并且對數百個SAGs進行了功能鑒定[8-10]。這些SAGs基因表達的水平主要由轉錄因子調控,目前NAC、WRKY、AP2/EREBP、MYB、bHLH、bZIP等轉錄因子家族中的成員已被證實在植物葉片衰老過程中對SAGs基因的表達有重要的調控作用[10-13]。其中,NAC轉錄因子和WRKY轉錄因子被認為在葉片衰老中起到了核心調控作用[14-15]。

葉片衰老涉及到多層次復雜的調控,可以在轉錄、轉錄后、翻譯和翻譯后等多個水平整合內外信號進行精細的調控[3]。最近的研究表明表觀遺傳調控也在植物葉片衰老過程中發揮著重要作用[5,16-17]。表觀遺傳是不改變DNA序列的情況下,使基因表達發生可遺傳和可逆改變的一種調控方式,主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化、ATP依賴的染色質重塑和非編碼RNA介導的調控[18]。目前研究主要關注于組蛋白甲基化、乙酰化和DNA胞嘧啶的甲基化如何調控基因的表達從而影響植物生長發育的進程。此外,隨著測序技術的發展,越來越多的非編碼RNA被發現,其在葉片衰老過程中的調控作用逐漸引起人們的重視。非編碼RNA(ncRNAs)是一類不翻譯成蛋白質的RNA,主要包括非編碼小RNAs(small non-coding RNAs,sncRNAs)、微小RNAs(miRNAs,microRNAs)和反式小干擾RNAs(trans-acting small interfering RNAs,ta-siRNAs)、長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)、環狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)和piRNAs(Piwi-interacting RNAs)等。它們在植物生長發育、抵御脅迫以及衰老調控方面有重要作用。本文綜述了表觀遺傳在植物葉片衰老過程中調控的研究進展,以期進一步促進植物葉片衰老的表觀遺傳調控研究。

1 組蛋白修飾調控植物葉片衰老

組蛋白(Histone)是一種可以和DNA結合的堿性蛋白,在真核生物細胞核中,組蛋白和DNA共同組成染色質的基本單位核小體,H2A、H2B、H3和H4 4種組蛋白組成了核小體的蛋白質八聚體。組蛋白尾部的蛋白結構域延伸在核小體表面,具有多個修飾位點,可以在不同酶的作用下進行甲基化、磷酸化、乙酰化和泛素化等組蛋白修飾,改變核小體構象,調控基因轉錄活性[19-20]。

1.1 組蛋白甲基化

在擬南芥中,組蛋白甲基化可發生在組蛋白H3的賴氨酸殘基4 (K4)、9 (K9)、27 (K27)和36 (K36)位點。通常情況下,組蛋白H3K4和H3K36甲基化與基因的轉錄活化相關,而組蛋白H3K9及H3K27甲基化則與基因的沉默相關[21]。多項研究表明,H3K4me3可以激活SAGs表達從而在葉片的自然衰老過程中起重要的調控作用,H3K27me3則以相反的方式來調控SAGs的表達。WRKY53是調控葉片衰老的關鍵轉錄因子。Ay等[22]的研究表明了組蛋白甲基化修飾與植物葉片衰老相關,他們發現隨著擬南芥葉片衰老,轉錄因子WRKY53基因編碼區5′端,組蛋白甲基化H3K4me2和H3K4me3信號有明顯增加,WRKY53基因轉錄被活化。Brusslan等[23]也對成熟和衰老的擬南芥葉片中組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3與基因表達水平的關系進行了探究,發現衰老葉片中衰老上調基因的H3K4me3標記增加,下調基因的H3K4me3標記減少。而失去H3K27me3標記的基因在衰老時出現了上調,少數H3K27me3標記增加的基因在衰老葉片中表達水平下調。Yan等[24]利用了ChIP-Seq及RNA-Seq研究了黑暗脅迫下擬南芥葉片中基因組范圍內H3K4me3的分布,以及H3K4me3與基因表達的關系。他們發現經黑暗處理后葉片中H3K4me3標記數量整體上增加,H3K4me3標記增加的基因主要參與葉片衰老。這些基因包括衰老相關基因WRKY6、SAG113和SAG101,以及與黑暗誘導衰老相關的基因ABI5、EIN3和ORE1。研究結果說明H3K4me3在SAGs的轉錄調控中起到了重要的作用,并且黑暗誘導和年齡引起的葉片衰老之間存在著相互應答(cross-talk)。

組蛋白甲基化狀態主要由組蛋白甲基轉移酶(histone methyltransferases,HMTs)和組蛋白去甲基化酶(histone demethylases,HDMs)共同維持,多個研究表明HMTs和HDMs參與了葉片衰老的調控。SUVH2屬于HMTs,其過表達導致H3K9、H3K27異染色質甲基化標記增加[25]。Ay等[22]發現SUVH2過表達植株中WRKY53基因的H3K27me2和H3K27me3標記水平升高,導致WRKY53及其下游的衰老相關基因SIRK、SAG101、ANAC083、SAG12和SAG24的轉錄受到抑制,葉片出現衰老延遲。Ay等[26]通過qRT-PCR分析發現過表達SUVH2影響50%衰老相關調控基因的表達,其中,衰老相關轉錄因子家族AP2-EREBP、C2H2、NAC和WRKY受到的影響尤為顯著。組蛋白去甲基化酶HDMs可以分成2種類型:JMJs(JmjC domain-containing proteins)和LSD1(lysine-specific demethylase 1)。Wang等[21]在擬南芥中發現組蛋白H3K27me3去甲基化酶REF6/JMJ12,可以通過去甲基化激活衰老調控基因和結構基因如EIN2、ORE1、NAP、PPDK、LOX1和NTL9等的表達,正向調控葉片衰老。Liu等[27]發現組蛋白去甲基化酶JMJ16在擬南芥中通過移除WRKY53和SAG201位點的H3K4me3水平,抑制這些基因的提前表達,對葉片衰老有負調控作用。Ding等[28]證明了番茄組蛋白去甲基化酶SIJMJ4的過表達促進黑暗和ABA誘導的番茄葉片衰老。在黑暗中,SIJMJ4通過去除H3K27me3促進轉錄因子SlORE1、SlNAP2和衰老相關基因SlSAG113、SlSAG12的表達促進衰老。響應ABA時,SIJMJ4可以降低上述基因和SlABI5、SlNCED3等衰老相關基因的H3K27me3水平,激活它們表達,介導ABA誘導的葉片衰老。

這些研究結果都表明植物葉片衰老受組蛋白甲基化和去甲基化的調控,此外Yan等[24]和Ding等[28]的結果表明除年齡誘導的葉片衰老外,組蛋白甲基化在黑暗和ABA誘導的葉片衰老過程中也有參與,對于組蛋白甲基化修飾在其他因素誘導的葉片衰老調控過程中的作用值得更加深入研究。

1.2 組蛋白乙酰化

除了組蛋白甲基化修飾,乙酰化也是一種重要的組蛋白修飾方式。組蛋白乙酰化與基因轉錄激活有關,去乙酰化與基因沉默有關。同樣受酶的作用,由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)共同作用參與調控植物葉片衰老[29]。

Brusslan等[30]利用ChIP-Seq及RNA-Seq研究了擬南芥發育衰老過程中不同時間點葉片中H3K9ac和H3K4me3的豐度,他們發現大部分衰老上調相關基因都有H3K9ac和H3K4me3標記。他們還發現SAGs周圍的H3K9ac水平在衰老早期較高,隨著衰老的進行逐漸降低。這與H3K4me3水平的情況相反,H3K4me3水平通常在衰老的早期階段很低,在衰老階段結束時急劇增加。組蛋白標記在整個衰老過程中高度收斂。然而,SAGs周圍H3K4me3標記覆蓋的基因區域的平均數量幾乎是H3K9ac標記覆蓋的2倍。植物中的去乙酰化酶可分成3個家族:RPD3/HDA1、HD2和SIR2[31]。AtHD1是一種組蛋白去乙酰化酶。Tian等[32]研究發現,AtHD1的組成型反義抑制轉基因植株CASH中的H4組蛋白高度乙酰化,植株表現出早衰現象。AtHD1的T-DNA插入突變體也出現乙酰化水平的增加和相似的早衰表型[33]。HDA6是組蛋白去乙酰化酶的一種,根據Wu等[34]的研究,擬南芥HDA6缺失突變體組蛋白H3乙酰化水平高于野生型,衰老相關基因SAG12和SEN4的表達下調,葉片衰老延遲,表明HDA6參與了擬南芥葉片衰老的調控。HDA9是組蛋白去乙酰化酶,擬南芥hda9和pwr突變體自然條件和黑暗誘導下衰老延遲,Chen等[35]的研究表明HDA9、蛋白質PWR和轉錄因子WRKY53一起通過去除多條衰老調控途徑負調控基因的H3K27ac標記,從而抑制它們的表達,這反過來又誘導它們下游靶基因解除抑制來促進葉片衰老。Huang等[36]研究發現HDA15與單鏈DNA結合蛋白WHIRLY1互作,去除營養循環基因和衰老相關基因WRKY53啟動子區的H3K9ac,從而抑制它的表達,進而抑制葉片衰老。

擬南芥CBP/p300 HAT家族具有組蛋白乙酰轉移酶活性, 基因家族成員包括HAC1、HAC2、HAC4、HAC5和HAC12。Li等[37]研究發現,乙酰轉移酶AtHAC1的T-DNA插入突變體葉片具有黑暗遲綠的表型;所有AtHAC突變體對乙烯高度敏感,影響葉片衰老的乙烯響應因子(ethylene response factors,ERFs)的表達水平上調,說明AtHAC1與植物葉片衰老相關。Hinckley等[38]利用ChIP-seq鑒定出43個組蛋白乙酰轉移酶HAC1的可能靶標,其中靶標ERF022是葉片衰老的正調控因子。以上結果均表明了組蛋白乙酰化這一表觀遺傳機制在葉片衰老調控中有重要作用。

除了對擬南芥中組蛋白乙酰化在葉片衰老中作用的研究,其他常見植物葉片衰老時組蛋白乙酰化作用也值得關注。Zhang等[39]利用ChlP分析了水稻旗葉衰老不同階段H3K9ac的全基因組富集情況。隨著水稻旗葉的衰老,全基因組H3K9ac出現明顯增加。通過對與H3K9ac相關的差異表達基因分析發現,衰老相關基因的表達情況和H3K9ac水平有明顯的正相關關系,并且H3K9ac相關的基因主要參與了衰老相關激素信號通路。因此對于更多植物葉片衰老時組蛋白乙酰化的調控作用地研究,可以作為未來研究方向,更全面地了解葉片衰老調控中表觀遺傳機制的作用。

1.3 其他組蛋白修飾

除了組蛋白甲基化、乙酰化,組蛋白的其他共價修飾方式如磷酸化和泛素化也可能參與了植物葉片衰老的調控。組蛋白的磷酸化位點有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,它們在蛋白激酶的作用下磷酸化,并被磷酸酶去磷酸化[40-41]。雖然目前還沒有證據表明組蛋白磷酸化參與了植物葉片衰老的調控,但多種蛋白激酶和磷酸化酶被證實在葉片衰老過程中具有重要作用調控的研究[42-43],說明組蛋白磷酸化可能參與了植物葉片衰老的表觀遺傳調控。

H2A是第一個被發現的可以被泛素化修飾的組蛋白。組蛋白泛素化修飾涉及E1泛素激活酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶。擬南芥中只有2個基因編碼E1酶,而編碼E2和E3酶的基因分別有41和1 300多個[44]。Polycomb蛋白復合體(Polycomb group proteins)通過組蛋白修飾,在表觀遺傳方面調控靶基因[45],該蛋白復合體亞型PRC1復合物具有H2A泛素化E3連接酶活性,可以催化H2A泛素化[46],BMI1A是該復合體的成員之一。研究表明組蛋白H2A的泛素化修飾參與了植物葉片衰老調控。Chen等[47]在高粱中研究發現,乙烯信號途徑的關鍵轉錄因子EIN3的下游靶基因SbWRKY50通過與SbBMI1A互作,進而招募PRC1引起葉綠素降解途徑關鍵基因上的組蛋白H2Aub富集,抑制了葉綠素的降解,延緩了高粱葉片的衰老。雖然目前關于組蛋白泛素化參與植物葉片衰老調控的直接證據較少,但擬南芥葉片衰老過程中E3泛素連接酶與去泛素化酶(deubiquitination enzymes,DUB)都起到了一定的調控作用[48-51],說明泛素化參與了植物葉片衰老調控,但組蛋白泛素化修飾的機制和在調控葉片衰老過程中的具體作用還值得進一步研究。另外組蛋白泛素化與其他組蛋白修飾間具有相互作用[48],通過組蛋白其他共價修飾,也可能是組蛋白泛素化調控植物葉片衰老的一種間接方式。

2 DNA甲基化調控植物葉片衰老

DNA甲基化(DNA methylation)在植物體中廣泛存在,由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DMT)催化。DNA序列上CG、CHG、CHH(H是A、T或C)3類位點上的胞嘧啶可以發生甲基化。參與調控的甲基化轉移酶主要包括:MET1、CMT3和DMRs[52]。DNA甲基化可以發生在轉座子(TFs)等重復序列上,使重復序列沉默來維持異染色質結構穩定。DNA甲基化可以改變基因啟動子或編碼區的甲基化水平,進而影響基因與轉錄因子的結合能力[53]。目前研究表明,DNA甲基化影響著植物葉片衰老過程。

Ogneva等[54]研究了擬南芥與年齡相關的DNA甲基轉移酶基因(AtMETI、AtDRM1和AtDRM2)和去甲基化酶基因(AtROS1、AtDME、AtDML2和AtDML3)的表達情況,隨著葉片衰老,DNA去甲基化酶基因的表達量明顯高于幼葉時期,而DNA甲基轉移酶基因呈現出相反的表達模式,說明在擬南芥葉片衰老過程中有DNA去甲基化的參與。Dou等[55]對棉花幼葉和衰老葉全基因組DNA甲基化水平進行了比對分析,衰老葉DNA甲基化水平低于幼葉,并且研究的9個DNA甲基轉移酶相關基因和2個DNA去甲基轉移酶相關基因的表達均在衰老過程中被下調。表明DNA甲基化活性降低調控了葉片的衰老。在超砷積累的鳳尾蕨中發現,砷的積累導致葉片中DNA甲基化水平的降低,同時葉綠素的積累和Fv/Fm也有所減少。說明在砷積累的情況下,DNA甲基化影響了葉片光合過程和色素積累[56]。越來越多的研究表明DNA甲基化與衰老相關基因之間存在一定的聯系。He等[57]鑒定出擬南芥中的一個轉座子NMR19,根據其在基因組中的位置不同分為NMR19-4和NMR19-16,其中NMR19-4的甲基化抑制了調控葉片衰老的PPH的表達,影響了葉片中葉綠素的含量,葉片出現延遲衰老。Yuan等[58]的研究顯示DNA去甲基化酶基因DML3調控擬南芥葉片衰老,因為他們發現dml3敲除突變體植株很多SAGs啟動子的高度甲基化導致其轉錄水平降低,葉片出現衰老延遲現象。Li等[59]研究了油菜葉片衰老時DNA甲基化的變化,發現DNA甲基化轉移酶基因BcMET1、BcSUVH4、BcDRM2、BcRDR2和BcCMT3的表達隨儲藏時間延長而逐漸下降,而DNA去甲基化相關基因(BcROS1)的表達保持不變。經甲基化抑制劑5-Aza處理后的葉片中與葉綠素降解相關的酶活性逐漸升高,葉片變黃。衰老相關基因BcSAG12、BcNYC1、BcSGR1、BcSGR2等的表達也出現上調。同時衰老葉片BcSGR2和BcSAG12啟動子區域出現了明顯的DNA去甲基化,表明了油菜葉采后的葉片衰老相關基因的表達與DNA去甲基化有關。以上實驗結果都證明了DNA甲基化影響著植物葉片衰老,但除了甲基化酶和去甲基化酶的作用,發生在TEs的DNA甲基化對葉片衰老表型變化的作用值得進一步研究。

我應承下，把鍋碗洗了，就去給二丫洗澡。我脫下二丫的衣裳，她身上密麻麻的新傷舊疤嚇了我一大跳。我問二丫：“東洋人弄的？”

值得注意的是,DNA甲基化與組蛋白修飾并不是完全相互獨立的表觀遺傳調控方式。例如擬南芥met1-1突變體中組蛋白H3K9me信號明顯減弱,這一結果同樣出現在met1-3突變體中,證明DNA甲基化影響了組蛋白H3K9me的水平[60-61]。另外擬南芥組蛋白去乙酰化酶HDA6有維持CHG位點DNA甲基化的作用,在擬南芥Athda6突變體中,CHG甲基化水平明顯降低[62],說明DNA甲基化的維持依賴于HDA6,與組蛋白乙酰化水平降低共同使基因沉默。植物DNA甲基化與組蛋白修飾間關系密切,因此深入研究植物葉片衰老中DNA甲基化和組蛋白修飾的共同調控機制,是全面了解植物葉片衰老表觀遺傳調控的重要研究方向之一。

3 ATP依賴的染色質重塑調控植物葉片衰老

染色質結構的高度重疊成為轉錄因子與DNA結合的障礙,因此真核生物在進化過程中進化出改變染色質DNA局部可接近性的機制,除了上述提到的組蛋白共價修飾、DNA甲基化以外,還可以通過ATP依賴的染色質重塑(chromatin remodeling)實現[5]。ATP依賴的染色質重塑由ATP水解提供能量,在染色質重塑復合物的參與下,以核小體在DNA上滑動、與DNA解離、去除染色質上的組蛋白八聚體以及組蛋白變異體與經典組蛋白置換的非共價方式,調控染色質結構,從而增加或減弱轉錄因子在其染色質DNA局部的可接近性,進而激活或抑制相關基因的轉錄[63]。染色質重塑復合物最早在酵母中被發現,由ATP酶核心亞基和其他亞基組成,根據主要起催化作用的ATP酶核心亞基將染色質重塑復合物分為SWI/SNF、ISWI、Ino80和CHD 4個家族[64-65]。SWI/SNF家族由SWI2/SNF2蛋白與SNF5、SWP73和SWI3亞基組成,其起催化作用的ATP酶核心亞基為SWI2/SNF2亞基[66]。目前在擬南芥中鑒定出了41個含有ATP酶結構域的基因,分為Snf2-like、Swr1-like、Rad54-like等不同家族,其中Snf2-like家族又被分為SWI2/SNF2、Lsh、Iswi、Chd1和Mi-2亞家族[67]。對SWI2 /SNF2亞家族成員有一定研究,包括SYD、BRM、CHR12、CHR2、DDM1、DRM1等染色質重塑因子[68]。轉錄因子CIN-TCP促進植物葉片衰老,Efroni等[69]研究指出,擬南芥SWI2/SNF2家族成員BRM影響了轉錄因子CIN-TCP對細胞分裂素的響應,在BRM功能缺失的擬南芥突變體中,觀察到了葉片衰老加速的現象。Li等[70]的研究中,發現BRM直接靶向作用于衰老相關基因SAG21、SAG101、SAUL1等,另外H3K27去甲基酶REF6促進BRM的募集,降低H3K27me3水平激活轉錄,且BRM與REF6共定位衰老依賴基因,因此REF6可能與含BRM的SWI/SNF復合體一起通過控制SAGs基因的染色質結構,進而在表觀遺傳上調控葉片衰老。另外該家族成員DRD1和DDM1經研究表明參與葉片衰老調控。Cho等[71]研究發現擬南芥drd1-6、ddm1-2突變體葉片均出現衰老延遲現象,并且SAGs表達受到明顯抑制,因此他們認為SWI2/SNF2染色質重塑復合物通過表觀遺傳調控參與葉片衰老過程。AT-hook motif也是組成SWI/SNF的一個非催化活性亞基[67],Lim等[72]發現擬南芥ORE7/ESC過表達使植株出現衰老延遲,ORE7/ESC基因可編碼具有AT-hook motif的蛋白質,改變了染色質構象,同樣也影響了衰老相關基因的表達水平,因此他們認為ORE7/ESC通過編碼具有AT-hook motif的蛋白質,使染色質重塑,進而調控了植物葉片衰老。ATP依賴的染色質重塑在植物葉片衰老調控中有重要作用,根據已有研究可以看出,染色質重塑復合物與組蛋白共價修飾在調控植物葉片衰老方面密不可分,一方面組蛋白共價修飾影響染色質重塑復合物活性,另一方面參與染色質重塑復合物的招募和穩定[64]。雖然實驗表明了BRM、DRD1和DDM1等染色質重塑因子在葉片衰老表觀遺傳的調控作用,但具體的作用方式以及更多亞家族成員的作用仍需要進一步研究。

4 非編碼RNA介導調控植物葉片衰老

4.1 非編碼小RNAs與葉片衰老調控

非編碼小RNAs(small non-coding RNAs,sncRNAs)在植物基因表達調控中有重要作用,通過使mRNA失活或翻譯抑制在轉錄或轉錄后水平調控基因表達,進而從不同的生物過程參與對植物生長發育起到了調控作用,目前在葉片衰老調控方面研究較多的sncRNAs是miRNAs和ta-siRNAs。

4.1.1 miRNAs參與調控植物葉片衰老MicroRNAs(miRNAs)是在動物、植物中廣泛存在的內源性小RNA,長度為18～24個核苷酸[73]。最早于1993年由Wightman等[74]和Lee等[75]在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發現。隨后2002年Reinhart等[76]在擬南芥中證明了miRNAs同樣存在于植物中。miRNAs序列在動物和植物中均高度保守,通過切割靶基因mRNA在轉錄后水平調控基因表達。隨著小RNA克隆和高通量測序等生物學技術發展,陸續在更多植物中篩選出大量miRNAs[77-78]。不僅在擬南芥中篩選鑒定出大量miRNAs,Xu等[79]在水稻衰老葉片中新鑒定出162個候選miRNAs,并鑒定分析出其靶基因功能與葉片衰老相關;Wu等[80]在玉米葉片中鑒定出81個miRNAs,其中16個miRNAs差異表達與葉片衰老相關。

通過組學分析,人們推測很多的miRNAs可能都參與葉片衰老的調控,但是進行深入的功能分析的miRNAs并不多。miR164、miR319、miR840和miR396是植物中研究得較為深入的被證實參與植物葉片衰老調控的miRNAs。miR164已在擬南芥中被證實靶向調控NAC轉錄因子家族。Kim等[81]研究了由ORE1、miR164和EIN2組成的網絡調控葉片衰老的機制,他們發現衰老早期miR164結合到ORE1/AtNAC2的mRNA上,抑制衰老正向調控因子NAC2的表達。隨著葉片衰老,EIN2表達上調,EIN2負調控miR164使其表達量降低,同時NAC2的表達增加從而促進了擬南芥葉片的衰老。Li等[82]研究發現,葉片衰老時,EIN2下游關鍵轉錄因子EIN3的轉錄水平增高,EIN3蛋白能夠與miR164啟動子結合抑制其轉錄,同時上調miR164靶基因NAC2的表達而促進衰老,EIN2-EIN3-miR164-NAC2共同構成了調節葉片衰老的信號通路。Wen等[83]利用微列陣技術對幼葉和衰老葉保守miRNAs表達情況進行分析,結果顯示衰老相關miR164在幼葉中出現高表達。通過瞬時過表達實驗,發現LfNAC1和LfNAC100是lfomiR164b的靶基因,并且LfNAC1可以促進葉片衰老相關基因LfSGR的表達。實驗結果說明,miR164在幼葉時期抑制LfNAC1的表達,隨著季節的變化miR164逐漸下降,LfNAC1激活葉片衰老相關基因導致葉片衰老,證實了“miR164-NAC”對楓香秋葉衰老的調控作用。這些實驗結果證明miR164對葉片衰老的正向調控作用。

miR319也是研究較為深入的參與植物葉片衰老調控的miRNAs之一。研究表明擬南芥miR319靶向作用于與植物生長發育相關的TCPs轉錄因子家族[84-85]。Schommer等[86]通過微列陣技術鑒定出了5個受miR319靶向調控的TCPs家族成員,其中TCP4正調控茉莉素(jasmonates,JA)生物合成關鍵基因LOX2,促進JA的生物合成,進而調控植物葉片衰老。Koyama等[87]同樣研究了miR319和TCPs轉錄因子在葉片衰老過程中的作用。研究發現擬南芥TCP3、TCP4基因過表達以及mir319a/b突變體植株的葉片表現出早熟現象,而tcp3/4/10和tcp3/4/5/10/13/17突變體表現出延遲的葉片黃化,說明miR319和TCP基因突變引起的TCPs表達差異調控了葉片衰老。除了在擬南芥這種模式植物中證實了miR319調控葉片衰老的作用,Zhu等[88]發現,雞爪槭黃葉突變體葉片中miR319轉錄水平高,而野生型植株中則ApTCP2轉錄水平更高;ApmTCP2和ApTCP2與miR319序列互補性低,將雞爪槭ApTCP2和ApmTCP2分別在擬南芥野生型和jaw-d突變體植株中過表達后,jaw-d突變體中由miR319過表達引起的衰老抑制被解除,JA生物合成的相關基因表達增加,葉片出現了衰老現象。以上實驗結果充分證實了miR319調控TCPs的機制在葉片衰老中發揮作用。

生長調節因子(growth-regulating factors,GRFs)是植物中特異性轉錄因子,與相互作用因子(GRF-interacting factors,GIFs)形成復合物,GRFs表達模式受miR396調控。擬南芥GRF3對miR396不敏感,GIF1表達水平增加葉片衰老延遲,miR396過表達可明顯誘導衰老相關基因SEN1和SEN4的表達,miR396-GRF-GIF網絡影響了葉片衰老進程[92]。植物中的miRNAs數量龐大,更多miRNAs在葉片衰老中的調控作用值得更深入的研究。

4.1.2 ta-siRNA參與調控植物葉片衰老反式小干擾RNAs(trans-acting small interfering RNAs,ta-siRNAs),是長度為21個核苷酸的內源性siRNA。ta-siRNAs的形成與miRNAs有關,ta-siRNAs由TAS基因產生,ta-siRNA基因座(TAS)從核基因轉錄,被含有RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)的Argonaute(AGO)識別并切割后與特定的miRNA結合,在RNA依賴型RNA聚合酶(RDR6)的作用下產生雙鏈RNAs(dsRNAs),在被DCL蛋白裂解后生成ta-siRNAs[93]。ta-siRNAs和miRNAs一樣通過靶向結合含有互補位點的mRNA調控基因的表達。目前已經在植物中鑒定出了4個編碼ta-siRNAs的基因家族:TAS1、TAS2、TAS3和TAS4。其中TAS3可以被miRNA390靶向作用產生TAS3-ta-siRNA,而TAS3-ta-siRNA的靶基因包括生長素反應因子ARF2、ARF3和ARF4,可以引起相應基因的mRNA降解抑制其表達[94-95]。ta-siRNAs可以和miRNAs同時靶向調控同一基因家族的多個基因表達,在調控植物葉片衰老過程中與miRNAs有相互協調的作用[96]。

4.2 長鏈非編碼RNA與葉片衰老調控

長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類轉錄本長度大于200核苷酸的ncRNA,位于細胞核或細胞質中充當“核蛋白調節劑”[97-98],根據其在基因組中相對位置可分為正義lncRNAs(sense lncRNAs)、反義lncRNAs(antisense lncRNAs)、雙向lncRNAs(bidirectional lncRNAs)、基因間lncRNAs(intergenic lncRNAs)和內含子lncRNAs(introic lncRNAs)5類[99]。此前對lncRNAs的研究主要集中在哺乳動物的生長發育、器官生長發育以及癌癥相關研究等方面[100-102],發現lncRNAs能夠通過順式或反式作用模式調節蛋白質編碼基因的表達[103]。近年來隨著高通量測序技術快速發展,植物中lncRNAs的功能和作用機制也逐漸被探知,發現了lncRNAs在植物葉片衰老過程中的調控作用。Huang等[104]通過全基因組高通量測序,對水稻旗葉衰老過程中的lncRNAs進行了鑒定。在水稻從正常到衰老的5個發育階段的旗葉中共鑒定出3 953個lncRNAs,其中與葉片衰老正負相關的差異表達lncRNAs分別為22個和48個。這些差異表達的lncRNAs靶向mRNA中,一部分編碼了調控葉片衰老的轉錄因子,另一部分則編碼衰老相關基因(SAGs)。表明了衰老相關的lncRNAs通過調控大量衰老相關mRNA轉錄在葉片衰老過程中發揮重要作用。Li等[105]在番茄葉片中鑒定出160個衰老過程中差異表達的lncRNAs,這些lncRNAs靶向調控的mRNAs大多富集在光合作用、轉運蛋白等參與葉片衰老調控的通路上。此外研究發現了2個正向調控葉片衰老的lncRNA:MSTRG.16920和MSTRG.7613。通過病毒誘導使這2個lncRNA沉默,再經黑暗處理后,沉默番茄植株葉片較野生型植株葉片衰老延遲,衰老相關基因SlSAG12的表達也明顯下調;他們還發現MSTRG.16920沉默植株中NAC轉錄因子Solyc02g069960、MSTRG.7613沉默的植株中過氧化物酶基因Solyc06g050440的表達水平都明顯下降,表明了lncRNAs可能通過靶向調控轉錄因子和過氧化物酶基因的表達,調控植物葉片衰老。

lncRNAs還參與了RNA間相互作用的調控機制,Leonardo等[106]提出了競爭性內源RNAs(competing endogenous RNAs,ceRNAs)假說,mRNAs、lncRNAs和circRNAs作為ceRNAs競爭性的與miRNAs結合,降低miRNAs的抑制作用,上調靶基因的表達水平,構成了一個基因表達調控互作網絡,lncRNA-miRNA-mRNA就是互作網絡形式之一。lncRNA-miRNA-mRNA網絡參與了植物葉片衰老的調控,Huang等[104]分析了調控水稻旗葉衰老的lncRNA-miRNA-mRNA網絡,篩選出的差異表達的lncRNAs中,6個低表達的lncRNAs可能通過15個miRNAs調控51個共表達的mRNAs,14個高表達的lncRNAs可能通過21個miRNAs調控117個共表達的mRNAs;發現鑒定出的lncRNAMSTRG.62092.1能與miR164a和miR164e結合,提高編碼轉錄因子NAC家族和MYB家族的mRNA的表達水平,證明了lncRNA-miRNA-mRNA網絡調控水稻旗葉衰老。Sun等[107]通過對水稻早衰突變體的研究驗證了lncRNA-miRNA-mRNA對葉片早衰的調控作用。利用轉錄組分析水稻ZJ正常表型植株和zj-es早衰突變體表型植株葉片基因表達情況,最終在差異表達的lncRNAs、miRNAs、mRNAs中共獲得共表達的190對mRNA-lncRNA和3 391對mRNA-miRNA。通過對這些mRNAs進行功能分析,lncRNA-miRNA-mRNA網絡與葉片早衰相關的多個分子代謝途徑相關,也證實了lncRNAs作為ceRNAs調控網絡的一部分,參與水稻zj-es突變體的衰老調控。

4.3 環狀RNAs與葉片衰老調控

環狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)也是非編碼RNA中的一類,是由前體mRNA經反向剪切得到呈封閉環狀結構的RNA分子[108]。circRNAs最早在20世紀70年代就已經被發現,但當時只被認為是病毒的遺傳物質[109]。circRNAs在動植物中廣泛存在,具有較高的穩定性、進化保守性和組織特異性表達的特點,在高通量測序技術發展的支持下,越來越多的circRNAs及其功能被人們發現和研究,circRNAs具有miRNAs海綿、與RNA結合蛋白互作、翻譯成蛋白質、調控轉錄和衍生出假基因等功能[110-112]。

circRNAs也是一種ceRNAs,通過circRNA-miRNA-mRNA網絡調控植物葉片衰老[113]。Liu[114]研究了擬南芥生長和衰老過程中circRNA的功能。他們共鑒定出了168個circRNAs,分別有6個和35個circRNAs在G-M(生長-成熟)和M-S(成熟-衰老)階段差異表達。通過對circRNA-miRNA-mRNA網絡中的mRNAs功能分析,這些circRNAs靶向的mRANs與激素響應、脅迫相應等各種生物過程相關,說明circRNA-miRNA-mRNA網絡通過參與不同的生物過程調控葉片衰老。基于擬南芥葉片轉錄組數據,Meng等[115]從中鑒定出了11 490個circRNAs,在對轉錄本的miRNA結合位點進行鑒定時,總共獲得1 045個miRNA-circRNA結合位點,以及75個circRNAs相關共表達網絡;在對鑒定出的擬南芥所有ceRNAs進行表達模式分析后,發現了1個包括25個circRNAs的ceRNAs聚類,隨葉片衰老表達水平不斷提高,也證明了circRNAs以ceRNAs的形式參與了葉片衰老的調控過程。另外,Huang等[116]驗證了circRNAs調控水稻旗葉的衰老。他們在水稻旗葉5個發育時期的轉錄組數據中篩選出6 612個circRNAs,得到113個差異表達circRNAs。在對這113個差異表達circRNAs親本基因進行基因功能注釋后發現,其中部分親本基因集中在“蛋白質水解”“葉綠體組織”“淀粉生物合成”等與葉片衰老相關的GO terms。通過WGCNA方法研究了差異表達circRNAs和差異表達mRNA的共表達網絡,并進一步推斷了circRNAs的潛在生物學功能。他們的研究發現circRNA:34、220472|34220、857mRNA的豐度與TALE轉錄因子BGIOSGA13510(Os03g0732100)的表達水平呈現出正相關關系,這表明該circRNA可能通過調節轉錄因子在葉片衰老中發揮重要作用。除此之外,差異表達的circRNAs的親本基因還在蛋白質翻譯后修飾、氧化還原過程以及活性氧信號通路與葉片衰老相關的生物過程中起作用,這表明circRNAs在多個方面參與了水稻葉片衰老調控。

5 展 望

植物衰老是植物生長發育的一個重要過程。植物葉片有多方面的利用價值,因此對調控葉片衰老的機制的研究,不僅能更加深入地了解植物衰老的調控機制,對于經濟和生態方面也有重要意義。植物葉片衰老過程涉及了多個方面的動態調節,表觀遺傳調控對植物生長發育過程中基因表達水平的改變有重要的調控作用。近年來,組蛋白修飾、DNA甲基化、ATP依賴的染色質重塑以及ncRNAs介導的表觀遺傳修飾對葉片衰老的調控作用受到了廣泛關注。本研究綜述了表觀遺傳在植物葉片衰老過程中的調控作用,包括組蛋白修飾、DNA甲基化、ATP依賴的染色質重塑和ncRNAs參與葉片衰老調控的研究進展及作用機制。

越來越多的研究發現了衰老過程中DNA甲基化和組蛋白修飾程度調控SAGs的表達水平。目前組蛋白甲基化和乙酰化對植物葉片衰老的調控作用研究較為深入,但組蛋白泛素化和磷酸化參與植物葉片衰老調控的直接證據還有待進一步發掘。組蛋白修飾與DNA甲基化的調控因子相互作用,它們對組蛋白修飾和DNA甲基化的調控是否直接作用于調控植物葉片衰老還有待驗證。染色質重塑通過共價和非共價方式實現,ATP依賴的染色質重塑復合物通過其他表觀遺傳方式間接調控植物葉片衰老的作用機制有待研究。此外,除了年齡依賴性衰老,黑暗等脅迫以及植物內源性激素也影響葉片的衰老,DNA甲基化和組蛋白修飾對不同方式誘導的葉片衰老的調控機制是否相同也是未來研究值得關注的問題。葉片衰老時葉片內營養物質的分解對農作物的經濟價值有重要影響,因此經濟作物葉片的早衰對農業有重要影響,目前組蛋白修飾和DNA甲基化調控葉片衰老的研究對象多是模式植物擬南芥,因此對植物中DNA甲基化和組蛋白修飾調控葉片衰老機制的保守性值得進一步探究。

另外,得益于組學技術的發展,人們發現了更多可能參與了植物葉片衰老的調控的ncRNAs種類,但只有miRNAs是目前研究得比較多也比較深入的一類與葉片衰老有關的ncRNAs,如miRNA164對葉片衰老的調控機理研究已相當深入,其他ncRNAs具體如何調控葉片衰老則知之甚少。其他ncRNAs,如lncRNAs和circRNAs,與葉片衰老的相關性大多是通過葉片衰老過程中ncRNAs的組學分析得到,有關它們具體的調控機理還需要進一步深入研究。ceRNAs競爭性機制作為一種RNA間相互作用機制調節著基因表達,對miRNA-lncRNA-circRNA-mRNA這一更復雜網絡在葉片衰老中的調控作用也是值得研究的一方面。因此,多組學數據的聯合分析仍然是未來解析ncRNAs有關葉片衰老調控網絡的重要研究手段。總之,對不同的表觀遺傳修飾方式之間相關性、表觀遺傳修飾和衰老轉錄因子之間整體的網絡研究的深入,有助于更加全面地了解植物葉片衰老的調控機制。