受體酪氨酸激酶對子宮內膜異位癥患者哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的影響

易金玲, 吐比克孜·依比力, 古麗胡馬爾·艾尼瓦爾, 臘曉琳

(1. 新疆醫科大學第一附屬醫院 生殖助孕中心, 新疆 烏魯木齊, 830053; 2. 新疆醫科大學第五附屬醫院 婦科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

子宮內膜異位癥(EMS)是一種具有惡性腫瘤細胞侵襲、轉移特點的常見婦科疾病[1], 在全球育齡期女性中的患病率為5%～10%[2]。EMS的臨床表現包括盆腔疼痛、痛經和不孕癥等，近期研究[3]表明EMS是一種全身性慢性疾病，發病機制涉及多種因素，目前尚無早期診斷的標志物，藥物治療以激素治療為主，但個體療效差異大，長期管理較為困難。研究[4]證實卵巢透明細胞癌和卵巢子宮內膜樣癌在組織學方面與EMS密切相關。受體酪氨酸激酶(Axl)參與細胞生長、增殖、分化、黏附和遷移等過程的調節，而生長停滯特異性蛋白6(Gas6)作為Axl的配體，則具有高度結合親和力[5]。當Axl與Gas6A結合觸發下游PI3K/AKT信號通路，則能促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，因此Axl作為癌癥治療的新靶點而受到廣泛關注[6]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是多種信號通路的樞紐，可調節細胞生長、細胞周期和營養代謝過程[7]，是PI3K/AKT信號通路的下游激酶之一[8]。研究[9]發現EMS患者異位內膜Gas6表達上調，但Axl在EMS患者中的表達水平卻鮮有報道。本研究探討Axl對EMS患者mTOR信號通路的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月—2021年12月新疆醫科大學第五附屬醫院確診卵巢子宮內膜異位囊腫患者5例為研究對象，年齡35～50歲，中位年齡38.9歲，術中切除卵巢EMS病灶取得異位子宮內膜組織，同時刮宮取得患者在位子宮內膜組織。對照組為5例健康者，年齡23～45歲，中位年齡31.4歲，也獲得正常子宮內膜組織。所有患者均有規律的月經周期(27～35 d)。納入標準: 明確診斷為卵巢EMS者，且術后病理學確診為EMS。排除標準: ① 不明原因的不孕癥者; ② 合并惡性腫瘤者; ③ 6個月內使用類固醇激素者; ④ 合并自身免疫性疾病者; ⑤ 孕婦和哺乳期婦女; ⑥ 病理標本采集不全者。本研究已通過新疆醫科大學第五附屬醫院倫理委員會審核 (倫理審批號: XYDWFYLSK-2022-17), 所有患者入組前均被明確告知其臨床信息的使用情況、標本采集的過程、實驗的目的及個人信息的風險保護等，并簽署知情同意書。

1.2 樣本的采集與保存

手術切除即刻收集5例異位子宮內膜組織最典型部位組織以及在位內膜組織，刮取5例正常子宮內膜組織，并立即投入4 ℃滅菌盛有含青霉素、鏈霉素及兩性霉素B的Ham′s F12/DMEM培養液的離心管中，置于干冰壺, 2 h內送入實驗室進行細胞培養。

1.3 分離和培養

將收集的新鮮異位子宮內膜組織、在位子宮內膜組織和正常子宮內膜組織切碎，并分別在含有HEPES(25 mmol/mL)、1%青霉素/鏈霉素、膠原酶(1 g/L，酶活單位15 U/mg)和DNAse(0.1 g/L, 酶活單位1 500 U/mg)的Hank平衡鹽溶液中消化。混合物在37 ℃下搖晃60 min。采用40 μm細胞過濾器過濾溶液并分離細胞，然后接種在培養瓶中，并置于含10%FBS和抗生素(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和0.25 μg/mL兩性霉素B)的Ham′s F12/DMEM培養基中，細胞在37 ℃、5%CO2環境中培養。后續實驗步驟使用第3～5代培養細胞。

1.4 免疫組化法鑒定細胞

將細胞用4%多聚甲醛(PFA)固定在黏合玻璃載玻片中20 min, 采用0.5%Txition-100處理5 min, 然后用3%H2O2處理15 min, 再用5%正常山羊血清封閉1 min作為一級抗體; 將波形蛋白(1∶100，ab92547, Abcam)和CK19(1∶100)孵育過夜，然后將酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物在室溫下孵育20 min, 再次用PBS洗滌。加入新制備的DAB顯色溶液，將載玻片在室溫下孵育5 min, 然后用自來水洗滌。細胞用蘇木精染色20 s, 然后在光學顯微鏡下觀察。

1.5 Axl-siRNA細胞轉染及雷帕霉素干預mTOR

Axl的siRNA購自GeneChem Corporation. Si-Axl, 序列為5′-GCGGTCTGCATGAAGGAATTT-3′。使用Lipo8000TM(Beyotime Biotechnology, 上海，中國)進行細胞轉染。雷帕霉素干預子宮內膜異位細胞濃度為1 mmol/L, 干預時間為4 h, 用DMSO溶解。

1.6 細胞實驗分組

選擇融合率高達90%的異位子宮內膜間質細胞，分為以下4組: ① 異位子宮內膜間質細胞組(空白對照)，細胞正常培養48 h; ② 異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組，細胞正常培養44 h后，采用1 mmol/L雷帕霉素干預4 h; ③ 異位子宮內膜間質細胞+陰性對照組，細胞轉染siRNA NC (0.1 μmol/L) 48 h; ④ 異位子宮內膜間質細胞+AXL-siRNA組，細胞轉染siRNA-AXL (0.1 μmol/L) 48 h。

1.7 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)進行基因表達分析

根據制造商的說明，采用TRIzol(Thermo Fisher Scientific)從細胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix(日本Shija Takara Biotechnology Co. Ltd.)將提取的RNA反向轉錄為互補DNA(cDNA)。根據制造商(Takara)的說明，使用TB Green Premix Ex Taq進行實時PCR。使用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達倍數的變化。購自上海生物工程公司的引物序列見表1。

表1 PCR的引物序列

1.8 蛋白質印跡法(Western blot)檢測蛋白質表達

使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液分離細胞中的總蛋白。Western blot方法參考文獻[7]?？笰xl抗體(1∶1 000, ab219652)、抗p-mTOR抗體(1∶11 000, ab109268)、抗mTOR(1∶1 000, ab32028)和抗CyclinD1抗體(1∶100，ab16663)購自Abcam Biotechnology。

1.9 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS 25.0軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布時采用均數±標準差描述，比較采用t檢驗，不服從正態分布時采用中位數描述，組間分析采用Kruskal-Wallis秩和檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 子宮內膜間質細胞的培養及鑒定結果

顯微鏡下觀察到子宮內膜間質細胞的大小不一，形態不規則，多為圓形或多邊形。培養24 h后，橢圓形子宮內膜間質細胞基本黏附在培養板壁上，有些細胞變為紡錘形; 培養第7天后，細胞增殖速度加快(圖1A); 傳代3代后，細胞呈紡錘形，均勻健康; 培養至第5代后，細胞增殖率降低，成簇生長形狀變為細長的紡錘形(圖1B)。選擇第3代細胞進行免疫組化鑒定，染色結果顯示，波形蛋白在細胞漿呈深淺不一的棕褐色，表示其呈陽性(陽性率為100%); 細胞呈角蛋白(CK19)陰性，細胞質中未觀察到棕色顆粒，顯示出間充質細胞的特征(圖1C)。

A: 第3、7、10天的細胞形態; B: P3的細胞形態; C: 通過免疫組化法檢測波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(CK19)的表達(放大40倍)。圖1 子宮內膜間質細胞的分離、培養和鑒定

2.2 3組內膜細胞中Axl mRNA、mTOR mRNA的表達

采用qRT-PCR進行檢測，與正常子宮內膜間質細胞比較，在位子宮內膜間質細胞、異位子宮內膜間質細胞中AxlmRNA、mTORmRNA的表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組內膜細胞中Axl mRNA、mTOR mRNA表達水平比較

2.3 異位子宮內膜間質細胞最佳轉染條件

選擇生長狀態良好、匯合率保持90%的子宮內膜異位間質細胞，按照90%灰褐綠分析異位子宮內膜間質細胞，在充分的胰蛋白酶消化下，單細胞懸浮液可以在無抗生素情況下進行培養，并接種至24孔板中, 500 μL/孔，隨后在細胞培養箱中培養24 h, 條件為37 ℃、飽和濕度、5%CO2。配制siRNA/lipofectamin RNAiMAX復合物，混合后的復合物加入細胞培養板，置于細胞培養箱中培養(37 ℃、飽和濕度、5%CO2), 最佳轉染時間為48 h。見圖2。

圖2 轉染熒光圖片(放大100倍)

2.4 調控Axl對異位子宮內膜間質細胞中mTOR通路及凋亡的影響

2.4.1 4組細胞中AxlmRNA、mTORmRNA、CyclinD1mRNA比較: 與異位子宮內膜間質細胞組比較，異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組、異位子宮內膜間質細胞+Axl-siRNA組AxlmRNA、CyclinD1mRNA表達水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組比較，異位子宮內膜間質細胞+Axl-siRNA組AxlmRNA表達水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內膜間質細胞+陰性對照組比較，異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組AxlmRNA、CyclinD1mRNA表達水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內膜間質細胞+陰性對照組比較，異位子宮內膜間質細胞+Axl-siRNA組中AxlmRNA、CyclinD1mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內膜間質細胞組比較，異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組中mTORmRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3A。

表3 4組細胞中Axl mRNA、mTOR mRNA、CyclinD1 mRNA比較

A: 采用qRT-PCR檢測Axl mRNA、mTOR mRNA、CyclinD1 mRNA表達; B: Western blot檢測Axl、mTOR、p-mTOR、CyclinD1的蛋白表達; C: 灰度值的定量分析。圖3 調控Axl對異位子宮內膜間質細胞中mTOR通路及凋亡的影響

2.4.2 4組細胞中Axl、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、CyclinD1蛋白比較: 與異位子宮內膜間質細胞組比較，異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組p-mTOR、CyclinD1蛋白表達顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內膜間質細胞組比較，異位子宮內膜間質細胞+Axl-siRNA組Axl、p-mTOR、CyclinD1蛋白表達顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內膜間質細胞+陰性對照組比較，異位子宮內膜間質細胞+Axl-siRNA組Axl、p-mTOR、CyclinD1蛋白表達顯著降低(P<0.05); 4組細胞中mTOR蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。見表4、圖3B及圖3C。

表4 4組細胞中Axl、mTOR、p-mTOR、CyclinD1蛋白比較

3 討 論

EMS是一種常見的雌激素依賴性慢性炎性疾病，約50%不孕癥及50%～80%盆腔痛患者最終會確診EMS。目前國內外學者認為應從全身疾病的角度出發，研究EMS的發病機制[3], 其中異位子宮內膜間質細胞的增殖、侵襲和黏附以及新血管的形成特性與惡性腫瘤的生物學行為相似[10]。Axl是TAM家族的成員, Axl蛋白位于PI3K/AKT/mTOR信號通路的上游，該通路被認為是調節一系列生理活動如細胞增殖、存活和凋亡的經典信號通路[11]。EMS小鼠模型的體外和體內研究[12]表明, AKT/mTOR抑制劑可減少異位子宮內膜細胞的增殖。因此，研究[13]認為PI3K/AKT/mTOR信號通路可能在EMS的發生和發展中起作用。Axl是一種具有獨特結構的跨膜蛋白，由Gas6編碼[14]。Axl具有黏附分子的性質和酪氨酸激酶的活性，而酪氨酸激酶通常在正常人體組織中表達。在Gas6誘導下Axl二聚化后, Axl受體自身發生磷酸化，激活的Ax1受體本身具有催化下游分子的酪氨酸蛋白酶活性，從而誘導相關信號轉導。在Axl受體的作用下, PI3K被激活，其產物在蛋白激酶的參與下進一步激活AKT, 從而影響下游因子的激活，其中一些下游因子參與細胞凋亡的調節[15]。AKT活化后，由于結構域的改變, PI3K與AKT結合, AKT產生催化活性并轉導途徑中的下一個分子。催化活性AKT從細胞膜轉移到細胞質或細胞核，而后繼續靶向調節下游信號分子，如mTOR、Bad、細胞周期蛋白D1和核轉錄因子κB(NF-κB)[16], 而mTOR是調節細胞生長、細胞周期和營養代謝的多種信號通路匯聚的中樞。

本研究結果表明，與正常子宮內膜間質細胞相比，在位子宮內膜間質細胞和異位子宮內膜間質細胞之間的Axl和mTOR基因表達差異有統計學意義(P<0.05), 這可能表明EMS患者的異位子宮內膜和在位子宮內膜具有一定相似的生物學特征，并且可能在組織學上相關，這支持了“在位內膜決定論”理論。本研究結果還表明，在分子水平上，子宮內膜異位間質細胞中Axl和mTOR基因表達水平增加，這可能與該疾病的炎癥和激素依賴性特征有關。這種過度表達也可能導致異位子宮內膜間質細胞在子宮腔外持續增殖，參與子宮內膜異位病灶的形成。本研究結果還表明，異位子宮內膜間質細胞組中Axl、mTOR和CyclinD1基因表達無顯著差異; 與異位子宮內膜間質細胞組相比，異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組中Axl、mTOR和CyclinD1基因的表達存在顯著差異; 與異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組相比，異位子宮內膜間質細胞+陰性對照組的mTOR基因表達無顯著差異; 與異位子宮內膜間質細胞組相比，異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組中p-mTOR和CyclinD1基因的表達顯著不同，這也證實了mTOR是Axl信號通路下游的關鍵因子。Axl被激活后，繼續靶向調節下游信號分子mTOR, 從而最終調節細胞周期及其營養代謝。本研究還發現，與異位子宮內膜間質細胞+雷帕霉素組相比，異位子宮內膜間質細胞+Axl siRNA組中Axl、p-mTOR和CyclinD1基因表達水平顯著不同，同時證實了mTOR信號的作用是通過PI3K/AKT/mTOR通路激活而發揮生物學效應，進一步調節下游蛋白的表達，從而調節細胞生長、增殖、自噬和凋亡等生理功能[17]。這一結果也支持了PI3K/AKT/mTOR信號通路可能在EMS的發生和發展中發揮作用的結論?？傊?Axl和mTOR基因在異位內膜間質細胞中高度表達，使用雷帕霉素破壞調節細胞周期的mTOR可促進細胞凋亡，從而對異位子宮內膜細胞產生抑制作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路和其他相關信號網絡參與EMS的發病機制。Axl通過介導PI3K/AKT信號通路參與了異位子宮內膜間質細胞的活化與增殖, mTOR可能通過PI3K/AKT信號通路以外的其他機制與Axl共同參與EMS的發生。調控Axl、mTOR可促進異位子宮內膜間質細胞凋亡, Axl、mTOR激酶可成為非激素靶點藥物的研究思路之一，需開展更深入的體內研究驗證。

總之, EMS的發病機制涉及許多方面，例如異常的信號網絡、自噬、氧化應激、新生血管和細胞凋亡。深入研究EMS發病機制涉及的完整信號網絡，并更準確地在分子水平上篩選出有研究價值的治療靶點，是非激素靶點藥物的研究思路之一。