假性蛋白激酶3及微小RNA-1827在結直腸癌中的表達及意義

盧 平, 周大剛, 張萬飛, 黃宇珮, 胡 婕

(1. 成都市郫都區中醫醫院/成都中醫藥大學附屬第三醫院 病理科, 四川 成都, 611730; 2. 成都醫學院第二附屬醫院·成都核工業四一六醫院 病理科, 四川 成都, 611730)

結直腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發病率及致死率逐年增高[1]。研究[2]表明，結直腸腺瘤性息肉是結直腸癌的癌前病變。早期發現、早期阻斷腺瘤的惡性病變，對降低結直腸癌的發病率有重要意義。假性蛋白激酶3(Trib3)廣泛參與癌癥、代謝性疾病、心血管疾病等疾病的發生發展過程[3]。SNEZHKINA A V等[4]研究結果顯示, Trib3在結直腸癌中表達上調。本研究課題組前期通過生物信息學預測網站(http://www.mirbase.org/index.shtml)發現微小RNA-1827(miR-1827)與Trib3存在靶向結合位點，推測Trib3、miR-1827可能通過相互作用影響結直腸癌的發生發展。然而，目前仍缺乏Trib3、miR-1827與結腸息肉的進一步相關性研究。本研究通過檢測正常結直腸組織、結直腸息肉組織及結直腸癌組織中Trib3、miR-1827表達水平的變化，探討Trib3、miR-1827在癌變過程中的意義，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月—2021年3月住院的97例結直腸癌患者癌組織作為結直腸癌組，年齡40～71歲，平均(50.08±9.33)歲，男53例，女44例。選取同期86例結直腸息肉患者息肉組織作為息肉組，年齡41～75歲，平均(50.13±10.02)歲，男46例，女40例。選取同期行結直腸鏡檢查的92例健康體檢者正常結直腸黏膜組織作為對照組，年齡41～74歲，平均(50.26±10.31)歲，男49例，女43例。收集并整理所有受試者臨床資料，包括性別、年齡，結直腸息肉患者黏膜狀態、分葉、蒂形態、息肉直徑、組織病理學分型、息肉數目，以及結直腸癌患者大體類型、浸潤程度、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移、分化程度。

納入標準: ① 結直腸癌及結直腸息肉經病理確診者，符合診療規范[5-6]; ② 受試者臨床資料及組織標本保存完整; ③ 入組前未進行過放化療、細胞分子靶向治療等治療者; ④ 經本院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試者均為自愿參加。排除標準: ① 有炎癥性腸病、家族性息肉病者; ② 有嚴重心、肝、腎等臟器病變者; ③ 孕期、哺乳期婦女; ④ 有其他惡性腫瘤或惡性腫瘤史者。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存: 采集健康體檢者結腸鏡檢查時的正常結直腸黏膜組織以及結直腸息肉患者、結直腸癌患者手術時切除的息肉組織、癌組織，液氮中速凍，保存待測。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測各組織miR-1827表達水平: 采用試劑盒(RNA提取試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司，反轉錄試劑盒購自?；锟萍加邢薰?提取組織總RNA并反轉錄為cDNA, 采用7700型qRT-PCR儀(美國Applied Biosystems公司)擴增miR-1827及其內參U6。反應體系為: cDNA模板(50 ng/μL)1 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μL, Rox reference dye(50×)(南京北魚生物科技有限公司)0.2 μL, ddH2O 3.0 μL, 重復3次。采用2-△△CT法計算正常結直腸黏膜組織、結直腸息肉組織、結直腸癌組織中miR-1827的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 免疫組織化學法檢測各組織Trib3表達水平: 將采集的組織進行10%中性多聚甲醛固定、切片等一系列操作。采用免疫組織化學法(試劑盒購自德國羅氏公司)檢測組織Trib3表達水平，操作步驟參考試劑盒說明。染色結束后每張切片選取癌細胞多的5個視野，每個視野計數100個細胞，判定Trib3陽性表達率。按照染色強度評分: 無著色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分。按照陽性細胞百分率評分: 無陽性細胞為0分，陽性細胞數<25%為1分，陽性細胞數為25%～50%為2分，陽性細胞數>50%為3分。總分為兩項評分相乘，總分≤2分為Trib3低表達，總分>2分為Trib3高表達。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 對照組、息肉組和結直腸癌組Trib3、miR-1827表達水平比較

結直腸癌組Trib3高表達比率高于息肉組和對照組, miR-1827水平低于息肉組和對照組，差異有統計學意義(P<0.01); 息肉組Trib3高表達比率高于對照組, miR-1827水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表2 對照組、息肉組和結直腸癌組Trib3、miR-1827表達水平比較

A: 正常結直腸黏膜組織; B: 結直腸息肉組織; C: 結直腸癌組織。圖1 不同組織中Trib3陽性表達(免疫組化法,放大400倍)

2.2 Trib3、miR-1827表達水平與結直腸息肉患者臨床病理特征的關系

根據結直腸息肉患者息肉組織Trib3高表達情況及miR-1827表達水平均值(0.69), 將患者分為Trib3高表達組41例和Trib3低表達組45例, miR-1827高表達組43例和miR-1827低表達組43例。結果顯示，Trib3、miR-1827表達水平與結直腸息肉患者性別、年齡、黏膜狀態、分葉、蒂形態無相關性(P>0.05), 與息肉直徑、組織病理學分型、息肉數目有相關性(P<0.01)。見表3。

表3 Trib3、miR-1827表達水平與結直腸息肉患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 Trib3、miR-1827表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

根據結直腸癌患者癌組織Trib3高表達情況及miR-1827表達水平均值(0.39), 將患者分為Trib3高表達組84例和Trib3低表達組13例, miR-1827高表達組48例和miR-1827低表達組49例。結果顯示, Trib3、miR-1827表達水平與結直腸癌患者性別、年齡、大體類型、浸潤程度無相關性(P>0.05), 與結直腸癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有相關性(P<0.05)。見表4。

表4 Trib3、miR-1827表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 Trib3、miR-1827在結直腸息肉組織及結直腸癌組織中的相關性

經Spearman等級相關分析顯示，Trib3、miR-1827在結直腸息肉組織及結直腸癌組織中均呈負相關(r=-0.349、-0.397,P<0.05)。見表5、表6。

表5 Trib3、miR-1827在結直腸息肉組織中的相關性

表6 Trib3、miR-1827在結直腸癌組織中的相關性

2.5 影響結直腸息肉患者和結直腸癌患者預后的多因素回歸分析

以結直腸息肉患者治療后是否無效為因變量，以Trib3、miR-1827、息肉直徑、組織病理學分型、息肉數目為自變量，進行多因素COX回歸分析，結果顯示Trib3是結直腸息肉患者治療無效的獨立危險因素(P<0.05), miR-1827是結直腸息肉患者治療無效的保護因素(P<0.05)。見表7。

表7 影響結直腸息肉患者治療效果的多因素COX回歸分析

以結直腸癌患者治療后是否死亡為因變量，以Trib3、miR-1827、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移、分化程度為自變量，進行多因素COX回歸分析，結果顯示Trib3、臨床分期是結直腸癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05), miR-1827是結直腸癌患者死亡的保護因素(P<0.05)。見表8。

表8 影響結直腸癌患者死亡的多因素COX回歸分析

3 討 論

結直腸癌是指直腸和結腸黏膜上皮或腺體發生的惡性腫瘤，其發病機制仍無定論，原癌基因激活、抑癌基因失活以及基因轉錄翻譯后修飾異常均可能與結直腸癌發生發展有關[7-9]。結直腸息肉作為一種極易惡變的消化系統疾病，可能與炎癥刺激、遺傳等因素有關[10]。結直腸息肉病變早期缺乏特異性體征，極易被忽視，使得部分患者就診時已出現微小病灶惡變[11]。因此，探索與結直腸息肉癌變相關的分子標志物對結直腸癌早期干預具有重要意義。

Trib3是假性蛋白激酶家族中的重要成員，可參與多種信號通路，與脂肪細胞分化、細胞凋亡、腫瘤血管密度等有著密切聯系[12]。研究[13]表明，內質網應激、氧化應激、缺氧等多種應激反應均可促使Trib3蛋白表達上調。miRNA是一類非編碼RNA, 可通過與靶基因mRNA的3′非編碼區結合來調控蛋白翻譯過程[14]。miR-1827是一種新興的miRNA, 可通過調控c-Myc而參與肺腺癌、甲狀腺乳頭狀癌的發生進展[15-16]。本研究前期生物信息學分析顯示, Trib3、miR-1827間可能存在靶向關系，且相關性結果同樣顯示結直腸息肉組織及結直腸癌組織中Trib3與miR-1827均呈負相關。本研究比較了不同結直腸組織中Trib3、miR-1827的表達水平，結果顯示在正常結直腸黏膜組織、結直腸息肉組織、結直腸癌組織中, Trib3水平逐漸升高, miR-1827表達水平逐漸降低, Trib3表達趨勢與蔡曼妮等[17]研究結果一致，提示Trib3、miR-1827可能分別是結直腸息肉發生發展及癌變進程中的重要促進因子和抑制因子。

本研究推測，從正常結直腸黏膜到結直腸息肉的病理狀態下, miR-1827表達下調，并通過靶向調控Trib3使其表達水平升高, Trib3蛋白進一步通過介導血管生成促進結直腸息肉向結直腸癌的轉變進程，但具體作用機制有待結合基礎實驗進一步證實。此外，本研究中Trib3、miR-1827表達水平與結直腸息肉患者息肉直徑、組織病理學分型、息肉數目以及結直腸癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關，且分別是結直腸息肉患者和結直腸癌患者預后不良的危險因素和保護因素，提示可能是由于結直腸息肉發展為結直腸癌是一個復雜、多階段的漫長進程, Trib3、miR-1827在此過程中參與息肉的發生發展，同時在癌變發生發展過程中發揮重要作用。

綜上所述, Trib3、miR-1827表達水平在結直腸黏膜組織癌變進程中分別呈升高和降低趨勢，且二者均與結直腸癌腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關, Trib3、miR-1827有望作為結直腸息肉惡變的重要監測指標及治療靶點。檢測Trib3、miR-1827表達變化可監測結直腸息肉惡變過程，進而進行結直腸癌的早期預防。