抵抗素基因多態性與結直腸癌易感性的相關性

王 琳, 劉 冰, 劉國華, 楊邯平

(河北省邯鄲市第一醫院 普外科, 河北 邯鄲, 056000)

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和病死率隨人口老齡化加劇以及居民膳食結構改變而上升[1]。結直腸癌早期臨床癥狀不顯著，發現時絕大部分患者已處中晚期，嚴重影響生理和心理健康[2]。抵抗素是由脂肪細胞分泌的富含半胱氨酸的細胞因子，與肥胖、糖尿病等疾病密切相關[3]。研究[4]顯示，抵抗素基因位點rs1862513C/G的多態性與類風濕性關節炎等疾病相關，證實其基因位點突變可能與炎癥機制存在聯系。研究[5]表明，結直腸癌等癌癥患者中抵抗素水平呈異常低表達。但目前關于抵抗素基因多態性與結直腸癌相關性的研究較少，因此，本研究探討抵抗素基因位點rs1862513C/G多態性與結直腸癌易感性的關系，以期為結直腸癌患者診斷和治療提供潛在的基因標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2020年1月本院就診的結直腸癌患者56例為研究對象(病例組)，平均年齡(51.83±13.24)歲; 選取同期結直腸腺瘤患者52例為對照組，平均年齡(50.64±13.06)歲; 選取同期60例健康體檢者作為健康組，平均年齡(52.38±12.46)歲。

納入標準: ① 符合診斷標準[6], 經纖維結腸鏡活檢或切除并經病理證實者; ② 未合并其他類型的惡性腫瘤者; ③ 臨床資料及組織標本保留完整、無缺損者; ④ 結直腸癌患者、結直腸腺瘤及健康體檢者均為漢族; ⑤ 詳細了解研究內容后自愿參加，并簽署同意書者。排除標準: ① 伴有心、肝、腎等器質性病變者; ② 有細胞分子靶向治療史患者; ③ 伴有內分泌疾病、高血壓病等疾病者。本研究經醫院臨床研究倫理委員會審核并批準。收集整理受試者性別、體質量指數(BMI)、飲食習慣、排便、腸道狀況等一般資料。

1.2 主要試劑與儀器

SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(貨號RR820A)購自日本Takara公司; 抵抗素ELISA試劑盒(型號CSB-E06884h)購自上海恒斐生物科技有限公司; 脂聯素ELISA試劑盒(型號20000)購自上海廣銳生物科技有限公司; 瘦素ELISA試劑盒(型號10-1199-01)購自廣州市進德生物科技有限公司。凝膠成像儀(型號Gel Doc EZ), 購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 血清抵抗素、脂聯素和瘦素水平測定: 采集研究對象第2天清晨空腹靜脈血10 mL, 采用離心機于3 000轉/min轉速下離心15 min, 收集上層血清至干燥的離心管中，之后迅速置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清脂聯素、抵抗素、瘦素水平，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.3.2 抵抗素基因型檢測: 采用上海萊楓生物科技有限公司提供的基因組DNA提取試劑盒提取血清中DNA, DNA提取參照試劑盒說明書進行。聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。PCR反應體系(25 μL): 模板DNA 2.0 μL, 上、下游引物各0.5 μL, MgCl21.5 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTP 2.0 μL, Taq DNA polymerase 0.2 μL, ddH2O 加至25 μL。PCR反應程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40個循環; 72 ℃ 5 min。電泳，凝膠成像儀分析，任意取包含3種基因型的單一條帶產物(16個)純化并測序，BLAST比對測序結果。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 3組一般資料比較

3組年齡、性別、BMI比較，差異無統計學意義(P>0.05)。病例組飲食不規律、排便不規律、腸道出現息肉及炎癥患者的例數多于健康組，腸道出現息肉及炎癥患者的例數多于對照組，差異有統計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 3組一般資料比較

2.2 3組血清抵抗素、脂聯素和瘦素水平比較

病例組抵抗素水平低于健康組和對照組，脂聯素、瘦素水平高于健康組和對照組，差異均有統計學意義(P<0.05); 對照組抵抗素水平低于健康組，脂聯素、瘦素水平高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組血清抵抗素、脂聯素和瘦素水平比較 ng/mL

2.3 3組抵抗素基因多態性rs1862513位點各基因型的分布及遺傳平衡檢驗

健康組、對照組及病例組各基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05), 提示所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性，均來自同一孟德爾群體。抵抗素基因在rs1862513位點上有3種基因型，分別為GG型、GC型、CC型。健康組GG型基因型最多, CC型基因型最少; 對照組GC型基因型最多, CC型基因型最少; 病例組CC型基因型最多, GG型基因型最少。見圖1、表4。

A為CG基因型; B為CC基因型; C為GG基因型。箭頭處為基因多態性位點。圖1 病例組抵抗素基因多態性位點rs1862513的基因型堿基測序圖

表4 抵抗素基因多態性rs1862513位點基因型分布及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗[n(%)]

2.4 結直腸癌各基因型患者血清抵抗素、脂聯素、瘦素水平比較

CC型結直腸癌患者血清抵抗素水平低于GG型和GC型，脂聯素、瘦素水平高于GG型和GC型，差異均有統計學意義(P<0.05); GC型結直腸癌患者血清抵抗素水平低于GG型，脂聯素、瘦素水平高于GG型，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 結直腸癌各基因型患者血清抵抗素、脂聯素、瘦素水平比較 ng/mL

2.5 結直腸癌的影響因素分析

將結直腸癌是否發生作為因變量，校正飲食習慣、排便、腸道狀況等混雜因素后，以抵抗素基因的GG型基因型、GC型基因型、CC型基因型為自變量進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示, CC型基因型是結直腸癌的獨立危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 影響結直腸癌發生的多因素分析

3 討 論

結直腸癌的高發病率和病死率已嚴重危害人類生活質量和生命健康[7]。結直腸癌的發病機制及病因至今仍未完全明確，但隨著現代檢測技術的不斷進步，人們逐漸認識到結直腸癌是一個涉及多個基因的疾病[8]。研究[9]顯示，結直腸癌的發生與飲食、個人、遺傳、環境等有關，而環境因素致癌主要取決于個人對腫瘤的易感性，而相關研究表明基因多態性與結直腸癌易感性有密切聯系。

抵抗素具有多種生物學功能，可通過拮抗胰島素使血糖水平不斷升高，同時可對脂肪細胞分化產生抑制性作用，加速脂肪細胞的增生，進而影響肥胖的發生[10-11]。抵抗素基因位點(rs1862513)C/G多態性的出現表明體內有較高的轉錄活性和表達增強[12-13]。研究[14]表明，抵抗素基因rs1862513位點的基因多態性與癌癥發生風險有關。本研究結果顯示，結直腸癌患者基因型中CC型最多(42.86%), 其次為GC型(32.14%), GG型最少(25.00%); 而健康體檢者基因型中GG型最多(60.00%), 其次為GC型(33.33%), CC型最少(6.67%); CC型基因型是影響結直腸癌發生的獨立危險因素。本研究與羅俊等[15]研究壞死性小腸結腸炎患兒中抵抗素基因rs1862513位點各基因型的分布基本一致，提示CC基因型與GG基因型相比可能增加了結直腸癌的發病風險，推測其可能是因為抵抗素基因rs1862513位點C/G的多態性與血管的損害有關，可造成腸道缺血、缺氧等病變，最終引發結直腸癌。此外，本研究中結直腸癌患者血清抵抗素水平低于健康人群和結直腸腺瘤患者，脂聯素、瘦素水平高于健康人群和結直腸腺瘤患者，與相關研究[5]結果一致; CC型結直腸癌患者血清抵抗素水平低于GG型和GC型，脂聯素、瘦素水平高于GG型和GC型，提示抵抗素基因位點(rs1862513)C/G多態性的出現可能影響患者抵抗素、脂聯素等的表達水平，進而加重患者病情。本研究多因素分析結果進一步表明，抵抗素CC型基因型與結直腸癌易感性有一定相關性。結合本研究相關結果進一步推測C等位基因可能對抵抗素相關基因的轉錄過程有重要抑制作用，進而降低抵抗素的表達，影響脂肪細胞增生及胰島素水平，增加結直腸癌發病風險。

綜上所述，抵抗素基因rs1862513位點基因的多態性可能與結直腸癌的發病風險顯著相關，且CC基因型與GG、GC基因型相比均增加了結直腸癌的發病風險，可為臨床早期結直腸癌的防治起到一定的借鑒作用。但本研究仍存在一定的局限性，本研究結果可能因種族和地域的不同而產生差異，因此，尚需擴大樣本量進一步證實抵抗素基因rs1862513位點多態性與結直腸癌發生的關系。