膠原十二型α1鏈在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義

羅 壯, 任 俊, 張滄源, 孫倩男, 4, 王 勇, 4, 馬儀超1, , 王道榮1, , 4

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 胃腸外科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 3. 揚(yáng)州大學(xué)-揚(yáng)州市普通外科研究所, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 4. 江蘇省揚(yáng)州市消化病/代謝病基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 5. 江蘇省淮安市中醫(yī)院 肛腸科, 江蘇 淮安, 223001)

結(jié)直腸癌(CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)最新的全球癌癥流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)報(bào)告[1]顯示，結(jié)直腸癌發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第3位，病死率居首位。中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率呈逐年增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[2-3]。研究[4]表明，基因調(diào)控異常是結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展的重要因素。膠原十二型α1鏈(COL12A1)作為一種編碼Ⅻ型膠原蛋白α鏈的基因，是原纖維相關(guān)膠原蛋白家族的成員之一[5-7], 而Ⅻ型膠原蛋白則是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中重要的細(xì)胞支架及支撐蛋白[8-9]。JANUCHOWSKI R等[10]研究發(fā)現(xiàn)COL12A1在卵巢癌中呈高表達(dá)，并且與卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性有關(guān)。在腫瘤部位的適應(yīng)性免疫反應(yīng)所發(fā)揮的作用對(duì)于腫瘤侵襲和防御癌癥之間的平衡至關(guān)重要，對(duì)這種免疫反應(yīng)的評(píng)估可能有助于確定局部CRC和轉(zhuǎn)移性CRC的預(yù)后及治療[11]。研究[12]表明COL12A1在胰腺癌中表達(dá)升高，并且與不良預(yù)后有關(guān)，COL12A1可以作為胰腺癌的免疫標(biāo)記物。本研究采用生物信息學(xué)分析、免疫組織化學(xué)(IHC)法及蛋白印跡法(WB)等手段探討COL12A1在結(jié)腸癌中的作用及可能的生物學(xué)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料及方法

1.1 一般材料

收集2020年8月—2021年12月江蘇省蘇北人民醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除的結(jié)腸癌及相應(yīng)癌旁正常組織共47對(duì)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診為首發(fā)結(jié)腸腺癌樣本，術(shù)前未行放化療，未合并其他腫瘤。由武漢塞維爾生物科技有限公司完成組織芯片微陣列的制作，提供每個(gè)芯片位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的患者順序并制作成組織芯片。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(UICC/AJCC)第8版結(jié)直腸腫瘤TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行病理分期。本研究通過(guò)江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，患者均已簽署同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及判斷標(biāo)準(zhǔn)

將石蠟切片置于60 ℃烤箱中，冷卻后用二甲苯及乙醇脫蠟; ddH2O沖洗后將切片放入檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù); 再用磷酸液緩沖液漂洗; 組織上滴入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑后，滴入山羊血清工作液，滴一抗B3GNT5(稀釋1∶70), 4 ℃過(guò)夜; 于次日滴入生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，滴辣根霉標(biāo)記鏈霉卵白素工作液; 滴DAB顯色液; 玻片浸入蘇木精; 流水沖洗玻片; 梯度酒精脫水，封片。采用NDP. VIEW2軟件觀察圖片，并進(jìn)行掃描對(duì)比，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行定量分析，由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。染色強(qiáng)度無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分; 陽(yáng)性比率≤25%為1分, >25%～50%為2分, >50%～75%為3分, >75%為4分; 染色強(qiáng)度與陽(yáng)性比率得分的乘積為最終得分, ≥4分為高表達(dá)[13]。

1.3 蛋白提取及WB檢測(cè)

RIPA冰上裂解結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞系NCM460, 持續(xù)15 min, 經(jīng)離心后取蛋白上清保存。一部分上清利用BCA蛋白濃度試劑檢測(cè)試劑盒確定濃度，步驟參照說(shuō)明書; 剩余部分按比例加入5×蛋白上樣緩沖液, 100 ℃煮沸5 min, 冷卻后以30 μg/孔上樣，經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后; 經(jīng)5%的牛奶封閉1.5 h, 一抗4 ℃孵育過(guò)夜, TBST洗滌每次10 min, 共3次; 二抗孵育1 h, TBST洗滌每次10 min, 共3次; 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，分析目的蛋白和GAPDH的吸光度(D)值，以目的蛋白與GAPDH的D值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

從UCSCXena網(wǎng)站(https://xena.ucsc.edu/)下載腫瘤與癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸腺癌(COAD)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(HTSeq-FPKM數(shù)據(jù))。排除部分樣本: “0”基因表達(dá)值和缺失值。本研究共收集結(jié)腸癌組織458例和結(jié)腸正常組織41例，分析不同分組間COL12A1的表達(dá)差異。利用GEPIA和PrognoScan在線分析網(wǎng)站中的不同數(shù)據(jù)集來(lái)分析COL12A1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL12A1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。采用R軟件進(jìn)行基因本體論(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析，探討COL12A1在結(jié)腸癌中發(fā)揮其生物學(xué)功能所依賴的相關(guān)信號(hào)通路。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示; 若不符合正態(tài)分布，則采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示; 應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。計(jì)數(shù)資料采用Pearsonχ2檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL12A1基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，泛癌表達(dá)分析結(jié)果顯示COL12A1在胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌等多種腫瘤中均呈高表達(dá)(圖1A)。與相應(yīng)正常組織比較，結(jié)腸癌組織樣本中COL12A1基因表達(dá)水平呈高表達(dá)(圖1B), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步分析COL12A1基因在不同分期結(jié)腸癌中的表達(dá)，除了Ⅳ期外，隨著分期的升高,COL12A1基因表達(dá)水平逐漸升高(圖1C), 且均高于正常組織表達(dá)水平。與普通腺癌比較，黏液腺癌中COL12A1基因表達(dá)水平更高(圖1D)。以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中COL12A1基因表達(dá)水平較高(圖1E)。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析協(xié)會(huì)(CPTAC)結(jié)腸癌數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中COL12A1蛋白表達(dá)水平也高于正常組織(圖1F)。

A: 泛癌分析結(jié)果表明COL12A1在胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中呈高表達(dá); B: TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中COL12A1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)高于正常結(jié)腸黏膜組織; C: 不同分期結(jié)腸癌組織中COL12A1表達(dá)均高于正常組織; D: 結(jié)腸腺癌、黏液腺癌組織中COL12A1表達(dá)均高于正常組織,且黏液腺癌中COL12A1表達(dá)高于腺癌組織; E: 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中COL12A1表達(dá)高于正常組織; F: CPTAC樣本庫(kù)結(jié)腸癌組織中COL12A1蛋白表達(dá)量高于正常組織。圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中COL12A1在結(jié)腸癌中的表達(dá)

2.2 COL12A1在結(jié)腸癌細(xì)胞系及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平

WB檢測(cè)正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞系NCM460以及結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT116中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示, 2種結(jié)腸癌細(xì)胞系中COL12A1均呈高表達(dá)(圖2A)。47對(duì)結(jié)腸癌組織及相應(yīng)正常組織樣本的IHC分析結(jié)果顯示, COL12A1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)高于正常組織(圖2B、2C), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

A: WB檢測(cè)結(jié)果表明COL12A1在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)水平高于正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞系NCM460; B: 47對(duì)結(jié)腸癌組織及正常組織芯片IHC染色典型結(jié)果; C: 47對(duì)結(jié)腸癌組織及正常組織芯片IHC染色結(jié)果。圖2 COL12A1在結(jié)腸癌細(xì)胞系及組織樣本中的表達(dá)

2.3 COL12A1對(duì)CRC患者預(yù)后的影響

本研究提取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE17536數(shù)據(jù)集及GSE14333數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)，采用不同COL12A1探針對(duì)CRC樣本中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)表達(dá)水平分為高表達(dá)COL12A1組與低表達(dá)COL12A1組。對(duì)2組患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明高表達(dá)COL12A1組中，患者總生存期(OS)、無(wú)病生存期(DFS)、疾病特異性生存期(DSS)均較低表達(dá)COL12A1組差，說(shuō)明COL12A1表達(dá)越高，則患者預(yù)后越差(圖3A、3B、3C)。利用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中COL12A1與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，分別對(duì)OS及DFS進(jìn)行分析，結(jié)果表明COL12A1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者OS無(wú)相關(guān)性(HR=1.5,P=0.093), 與DFS具有顯著相關(guān)性(HR=1.7,P=0.027),提示結(jié)腸癌患者COL12A1表達(dá)越高，其DFS越短(圖3D、3E)。

A、B: GSE17536數(shù)據(jù)庫(kù)中不同探針檢測(cè)COL12A1高表達(dá)與低表達(dá)的OS、DFS、DSS比較; C: GSE14333數(shù)據(jù)庫(kù)中不同探針檢測(cè)COL12A1高表達(dá)與低表達(dá)的DFS比較; D、E: GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸癌患者COL12A1高表達(dá)與低表達(dá)的OS差異(P=0.093)與DFS差異(P=0.025)。圖3 數(shù)據(jù)庫(kù)中COL12A1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 COL12A1表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)腸腫瘤組織中COL12A1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)COL12A1與結(jié)腸癌免疫(R=0.35,P=1.7e-14)和基質(zhì)(R=0.76,P<2.2e-16)評(píng)分存在正相關(guān)性。通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站觀察COL12A1表達(dá)水平與結(jié)腸癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果顯示COL12A1與結(jié)腸癌的腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)(R=-0.314,P<0.001)。COL12A1與結(jié)腸癌中B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均呈正相關(guān)(P<0.001), 其中與巨噬細(xì)胞(R=0.546)、中性粒細(xì)胞(R=0.535)、樹突狀細(xì)胞(R=0.52)關(guān)系最為密切。見圖4。

A: COL12A1表達(dá)水平與結(jié)腸癌免疫評(píng)分呈正相關(guān); B: COL12A1表達(dá)水平與結(jié)腸癌基質(zhì)評(píng)分呈正相關(guān); C: 通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL12A1表達(dá)與6種免疫細(xì)胞的相關(guān)性。圖4 COL12A1與結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系

2.5 COL12A1在結(jié)腸癌中下游信號(hào)通路的分析

利用TCGA下載相關(guān)的結(jié)腸癌數(shù)據(jù)，通過(guò)GSEA軟件進(jìn)行基因本體論(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)功能注釋分析，研究與COL12A1共表達(dá)基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，在COL12A1高的基因組中, GO功能主要涉及細(xì)胞黏附、化學(xué)突觸傳遞、化學(xué)刺激、女性特征發(fā)展、多細(xì)胞信號(hào)等生物過(guò)程。KEGG分析結(jié)果表示, KEGG通路顯著富集細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞質(zhì)DNA感應(yīng)途徑、細(xì)胞基質(zhì)受體相互作用、神經(jīng)活性配體受體相互作用、嗅覺傳導(dǎo)、自噬調(diào)節(jié)、RIG-I受體信號(hào)通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、味覺傳導(dǎo)。見圖5。

A: 結(jié)腸癌中與COL12A1共表達(dá)的基因富集生物學(xué)功能(GO); B: COL12A1共表達(dá)的基因在結(jié)腸癌中富集的生物通路(KEGG)。圖5 COL12A1共表達(dá)基因的功能和通路富集分析

2.6 結(jié)腸癌組織中COL12A1表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)47例結(jié)腸癌組織中COL12A1的IHC結(jié)果將其分為2組，免疫評(píng)分(IRS)≥4分為COL12A1高表達(dá)組, IRS<4分為COL12A1低表達(dá)組，結(jié)果顯示COL12A1表達(dá)水平與神經(jīng)/血管浸潤(rùn)(P=0.029)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.003)、TNM分期(P=0.001)有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、CEA、CA199表達(dá)水平無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 COL12A1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間存在著許多信息交換，微環(huán)境為癌細(xì)胞提供了有利條件，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。ECM是腫瘤微環(huán)境中最豐富的成分之一。ECM中膠原蛋白的表達(dá)異常已在多種癌癥中報(bào)道[14], 膠原家族的重要成員Ⅰ型膠原是ECM的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分, Ⅻ型膠原蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的結(jié)構(gòu)類蛋白，是與Ⅰ型膠原蛋白相關(guān)的同種三聚體，這種關(guān)聯(lián)被認(rèn)為可以改變膠原蛋白Ⅰ原纖維與周圍基質(zhì)間的相互作用，在腫瘤微環(huán)境的整體調(diào)控中發(fā)揮了重要意義[5, 15-16]。

研究[17]發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌中，甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)通過(guò)COL12A1介導(dǎo)的RAF/MER/ERK/MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)食管鱗癌的增殖及轉(zhuǎn)移能力，一定程度上揭示了COL12A1上游的調(diào)控機(jī)制及其參與的腫瘤調(diào)控通路。COL12A1在胰腺癌中高表達(dá)，并且與患者的不良預(yù)后有關(guān)，其中NAMPTP1/HCG11-hsa-miR-26b-5p-COL12A1信號(hào)軸可能是調(diào)控胰腺癌不良預(yù)后的關(guān)鍵信號(hào)通路，但本研究只涉及了基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控層面，并未進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[18]。本研究首先通過(guò)TCGA及CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)COL12A1在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明COL12A1在結(jié)腸癌中的基因及蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常結(jié)腸黏膜組織，說(shuō)明該基因在結(jié)腸癌組織中被異常激活; 隨后通過(guò)IHC及WB的方法檢測(cè)了細(xì)胞系及本中心臨床樣本中COL12A1表達(dá)情況，結(jié)果表明其在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞，并且本中心樣本研究結(jié)果也與數(shù)據(jù)庫(kù)中COL12A1表達(dá)趨勢(shì)相同，其在結(jié)腸癌樣本中的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組織。上述結(jié)果表明, COL12A1在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)均明顯升高。然而, COL12A1在結(jié)腸癌中高表達(dá)的意義及作用尚不明確。本研究進(jìn)一步對(duì)COL12A1與結(jié)腸癌預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明COL12A1表達(dá)越高的患者預(yù)后越差; 臨床病理特征的相關(guān)性分析結(jié)果表明, COL12A1表達(dá)水平與神經(jīng)/血管浸潤(rùn)(P=0.029)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.003)、TNM分期(P=0.001)有關(guān)，證實(shí)了COL12A1在結(jié)腸癌中的表達(dá)與惡性生物學(xué)行為呈正相關(guān)。

本研究還對(duì)COL12A1的表達(dá)與結(jié)腸癌免疫浸潤(rùn)水平進(jìn)行了分析，在結(jié)腸癌中, COL12A1的表達(dá)與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均呈正相關(guān)，相關(guān)性程度由強(qiáng)到弱，其中與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞相關(guān)性最明顯，與CD4+T細(xì)胞的相關(guān)性較與CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性更強(qiáng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), COL12A1的高表達(dá)提升了M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)，而浸潤(rùn)在腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞一旦轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，即可募集并表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而成為腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[19]。在結(jié)直腸癌中，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量比M1型多，不僅抑制抗腫瘤免疫[20], 其衍生的外泌體還可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲與遷移[21], 提示M2型巨噬細(xì)胞與結(jié)直腸癌密切相關(guān)。COL12A1的表達(dá)與結(jié)腸癌基質(zhì)評(píng)分及免疫評(píng)分水平具有相關(guān)性，而免疫評(píng)分是T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤的直接衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此任何直接或間接影響該過(guò)程的機(jī)制也會(huì)影響免疫評(píng)分類別，免疫評(píng)分測(cè)量的宿主免疫反應(yīng)在無(wú)病生存期方面優(yōu)于金標(biāo)準(zhǔn)TNM分類[22]。本研究還對(duì)COL12A1在結(jié)腸癌中的可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明在COL12A1高表達(dá)組中GO功能主要涉及細(xì)胞黏附、化學(xué)突觸傳遞等生物過(guò)程; KEGG通路顯著富集細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞基質(zhì)受體相互作用等，而COL12A1本身就是一種編碼Ⅻ型膠原蛋白α鏈的基因，其在細(xì)胞間黏附、細(xì)胞間信息傳遞中發(fā)揮重要作用。

本研究的不足: ① 僅初步探討了COL12A1的臨床意義及可能的作用機(jī)制，其具體在結(jié)腸癌中影響細(xì)胞增殖或者轉(zhuǎn)移等表型尚缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù); ② COL12A1的確切下游作用靶點(diǎn)也尚未明確，需更更深入的研究。

綜上所述, COL12A1在結(jié)腸癌中表達(dá)升高，其高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)，高表達(dá)的COL12A1可以激活一系列癌癥相關(guān)通路，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展, COL12A1或可作為結(jié)腸癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。