lncRNA-NR_046269對(duì)馬爾尼菲籃狀菌感染人支氣管上皮細(xì)胞早期IL-6 表達(dá)的影響①

徐明鵬 韋虹羽 李穎華 梁象東 方 妮 陳 艷

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530007）

馬爾尼菲籃狀菌病（曾稱馬爾尼菲青霉菌病）主要分布于中國(guó)南部（含香港、臺(tái)灣）和東南亞地區(qū)［1］。馬爾尼菲籃狀菌（Talaromyces marneffei，TM）是流行區(qū)域常見(jiàn)機(jī)會(huì)致病性真菌，可導(dǎo)致全身播散性侵襲性感染。近年免疫缺陷或免疫功能低下或使用免疫抑制劑患者增多，使得馬爾尼菲籃狀菌病發(fā)生率急劇上升。文獻(xiàn)報(bào)道，每年新發(fā)TM感染患者約50 000例［2］。HIV患者中，TM感染率高達(dá)16.1%，TM感染是HIV最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，病死率顯著高于其他并發(fā)癥［3］。近年非HIV患者TM感染率亦逐年增多，已成為中國(guó)南部常見(jiàn)真菌感染性疾病［4］。如不及時(shí)診治，病死率幾乎高達(dá)100%，即使及時(shí)給予抗真菌藥物治療，病死率仍高達(dá)30%［5］。WU等［6］報(bào)道，播散性馬爾尼菲籃狀菌病即使給予足量足療程抗真菌治療，復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%。由于抗真菌藥物難以徹底清除TM，病死率及復(fù)發(fā)率較高，臨床治療難度大，故闡明TM的致病機(jī)制，探索新的治療手段迫在眉睫。

lncRNA是近年研究熱點(diǎn)，但其在感染性疾病過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用研究甚少，主要集中于細(xì)菌及病毒致病機(jī)制研究，在致病性真菌方面鮮有報(bào)道。本課題組率先開(kāi)展了宿主lncRNA在病原真菌感染過(guò)程中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的研究，TM感染宿主后，引起宿主lncRNA適應(yīng)性改變，一方面導(dǎo)致宿主患病，另一方面起免疫防御作用。本課題組前期通過(guò)基因芯片檢測(cè)了TM感染BEAS-2B細(xì)胞株4 h后lncRNA和mRNA的表達(dá)譜，共檢測(cè)到848個(gè)lncRNA及mRNA具有顯著差異表達(dá)，其中l(wèi)ncRNA-NR_046269表達(dá)較對(duì)照組顯著升高［（37.23±2.04）倍，P＜0.05］［7］。本研究通過(guò)構(gòu)建編碼/非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)NR_046269與IL-6表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，并通過(guò)RNA過(guò)表達(dá)/敲低技術(shù)證實(shí)NR_046269可調(diào)節(jié)IL-6表達(dá)，擬從lncRNA基因表達(dá)調(diào)控角度探討TM感染早期免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，為臨床尋找治療靶點(diǎn)提供 新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B及TM標(biāo)準(zhǔn)菌株均保存于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自Life Technologies公司；ELISA試劑盒購(gòu)自CUSABIO公司；敲低及過(guò)表達(dá)慢病毒載體均購(gòu)自上海吉瑪公司，干擾片段序列為5'-GGCGACAAGCAACAACAATCA-3'。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞株，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，按1∶2隔天傳代1次。

1.2.2 菌懸液制備與分組 將TM菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，置于真菌培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng)，7～10 d后用無(wú)菌PBS溶液反復(fù)刮洗TM培養(yǎng)基上的菌落，無(wú)菌紗布過(guò)濾、離心，得到TM孢子。RPMI1640培養(yǎng)基重懸TM孢子，調(diào)整孢子懸液至適當(dāng)濃度。實(shí)驗(yàn)組以感染復(fù)數(shù)為10∶1的TM孢子加入BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)4 h，對(duì)照組細(xì)胞采用等量RPMI1640培養(yǎng)基處理。

1.2.3 編碼/非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)前期基因芯片檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)環(huán)境計(jì)算 lncRNA NR_046269與差異mRNA的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC），篩選閾值為|PCC|≥0.97且P＜0.05。采用Cytoscape（v2.8.1）構(gòu)建編碼/非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 qPCR 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qPCR試劑盒說(shuō)明書，在EP管中加入反應(yīng)體系。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性3 s，60 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參GAPDH 及目的基因引物均由Life Technologies公司設(shè)計(jì)合成（表1）。2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA和mRNA相對(duì)表達(dá)。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Sequences of primers used for qPCR

1.2.5 ELISA 收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞上清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)兩組細(xì)胞450 nm處光密度（OD）值，計(jì)算樣本濃度。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BEAS-2B細(xì)胞株中加入構(gòu)建好的慢病毒載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12 h后棄含病毒液的培養(yǎng)基，加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)及熒光強(qiáng)度。轉(zhuǎn)染48 h后傳代，待細(xì)胞貼壁后加入嘌呤霉素，篩選克隆陽(yáng)性細(xì)胞系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以±s表示。組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-NR_046269與IL-6表達(dá)呈負(fù)相關(guān) 通過(guò)構(gòu)建編碼/非編碼基因網(wǎng)絡(luò)篩選出NR_046269與154個(gè)mRNA顯著相關(guān)（|PCC|≥0.97，P＜0.05），其中116個(gè)mRNA與NR_046269呈正相關(guān)，38個(gè)mRNA與NR_046269呈負(fù)相關(guān)（圖1）。NR_046269與IL-6呈顯著負(fù)相關(guān)（PCC=-0.998，P＜0.05）。qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組IL-6 mRNA表達(dá)降低（0.82±0.21）倍（P＜0.05，圖2A）。ELISA結(jié)果亦顯示實(shí)驗(yàn)組IL-6表達(dá)較對(duì)照組顯著降低［（0.42±0.25） ng/mlvs（0.81±0.26） ng/ml，P＜0.05，圖2B］。

圖1 NR_046269與差異表達(dá)mRNAs相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between NR_046269 and differentially expressed mRNAs

圖2 TM感染BEAS-2B細(xì)胞4 h后IL-6表達(dá)Fig.2 Expression of IL-6 in BEAS-2B cells after infection with TM for 4 h

2.2 NR_046269負(fù)調(diào)控IL-6表達(dá) 為驗(yàn)證NR_046269對(duì)IL-6表達(dá)是否有負(fù)調(diào)控作用，對(duì)NR_046269進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)，qPCR檢測(cè)NR_046269敲低組和過(guò)表達(dá)組IL-6 mRNA表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示，敲低組NR_046269表達(dá)顯著下調(diào)，而IL-6表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。相反，過(guò)表達(dá)組NR_046269表達(dá)顯著上調(diào)，而IL-6表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，圖3）。提示lncRNA-NR_046269對(duì)IL-6具有負(fù)調(diào)控作用。

圖3 qPCR檢測(cè)NR_046269過(guò)表達(dá)和敲低組IL-6表達(dá)Fig.3 qPCR was performed to verify expression of IL-6 in overexpression or knockdown of NR_046269 groups

3 討論

感染發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是病原微生物與宿主相互作用的結(jié)果，機(jī)體免疫應(yīng)答和微生物免疫逃避決定疾病轉(zhuǎn)歸。TM分生孢子隨呼吸到達(dá)下呼吸道，黏附并穿透支氣管上皮細(xì)胞，隨后被單核/巨噬細(xì)胞吞噬，并潛伏于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)播散到全身各組織器官［8］。TM潛伏于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，逃避機(jī)體免疫殺傷作用。支氣管上皮細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)重要組成，在防御病原體入侵及誘導(dǎo)后續(xù)免疫應(yīng)答和免疫逃避過(guò)程中起關(guān)鍵作用［9］。因此，及時(shí)啟動(dòng)和完全激活支氣管上皮細(xì)胞固有免疫應(yīng)答對(duì)宿主清除病原體至關(guān)重要。

IL-6是經(jīng)典的急性期反應(yīng)和淋巴細(xì)胞刺激因子激活劑，是搭建固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵橋梁分子［10］。SCHAPER等［11］研究表明，IL-6通過(guò)與可溶性IL-6受體gp130蛋白結(jié)合誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型分化，分泌大量促炎因子，介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，從而殺傷及清除病原體。多數(shù)病原體感染急性期，如SARS-CoV-2病毒感染后，IL-6表達(dá)顯著升高，并與病毒載量呈正相關(guān)［12］。但少部分病原體感染急性期，IL-6表達(dá)無(wú)明顯升高。如結(jié)核分枝桿菌感染脂肪細(xì)胞時(shí)分泌較低水平的IL-6，有助于結(jié)核分枝桿菌潛伏于脂肪細(xì)胞內(nèi)［13］；沙眼衣原體感染宮頸上皮細(xì)胞后120 h內(nèi)促炎因子和趨化因子IL-6、TNF-α和CXCL8表達(dá)無(wú)顯著差異，表明沙眼衣原體可逃避強(qiáng)有力的促炎因子和趨化因子應(yīng)答，有利于沙眼衣原體適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境［14］。本研究中，TM感染人支氣管上皮細(xì)胞4 h后，qPCR及ELISA結(jié)果均顯示IL-6表達(dá)顯著降低，提示IL-6可能是TM誘導(dǎo)免疫逃避的重要炎癥因子之一。

lncRNA是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要參與者，其精確序列和自然結(jié)構(gòu)決定其與誰(shuí)互動(dòng)和發(fā)揮何種作用［15］。lncRNA可通過(guò)RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-蛋白相互作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、剪接、核酸降解和翻譯等［16］。雖然多數(shù)lncRNA的功能尚不清楚，但越來(lái)越多的研究表明，lncRNA在固有免疫應(yīng)答中可廣泛調(diào)節(jié)基因表達(dá)，是極其重要的固有免疫調(diào)節(jié)因子［17］。TM感染BEAS-2B細(xì)胞后lncRNA-NR_046269顯著差異表達(dá)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， NR_046269與IL-6表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。為了解 NR_046269與IL-6在BEAS-2B細(xì)胞中的互作關(guān)系，采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞株，敲低及過(guò)表達(dá)NR_046269，qPCR結(jié)果顯示，NR_046269敲低組IL-6表達(dá)顯著上調(diào)，而NR_046269過(guò)表達(dá)組IL-6表達(dá)顯著下調(diào)。由此推斷TM感染BEAS-2B細(xì)胞后 lncRNA-NR_046269具有反向調(diào)節(jié)IL-6表達(dá)的作用。

綜上，本研究明確了TM感染早期lncRNA-NR_046269對(duì)IL-6的負(fù)調(diào)節(jié)作用，為闡明TM致病機(jī)制及臨床防治TM感染提供了新的依據(jù)。