內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在吸煙COPD模型小鼠膈肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究①

任慧敏 韓樹(shù)池 薛乾隆 王 慧 王 佳 （河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科，張家口 075000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo-nary disease，COPD）是以進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。膈肌是與呼吸功能直接相關(guān)的呼吸肌，長(zhǎng)期存在的氣流受限會(huì)增加膈肌負(fù)荷，引起膈肌功能障礙［1-2］。有研究報(bào)道，膈肌細(xì)胞凋亡是引起COPD患者膈肌功能障礙的重要因素之一，但目前COPD發(fā)病過(guò)程中膈肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚［3］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，具體是指病理刺激下未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集中引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)下游蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、肌醇酶1α（inositol-requiringenzyme 1α，IRE1α）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor，ATF6）三種跨膜蛋白進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性存活或凋亡。有研究報(bào)道，COPD患者膈肌組織中ERS過(guò)度激活，多種ERS標(biāo)志基因表達(dá)增加，但ERS在膈肌細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確［4］。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討ERS在吸煙COPD模型小鼠膈肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制，旨在為闡明COPD發(fā)病過(guò)程中膈肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，生產(chǎn)許可：SCXK（滬）2018-0006；Perk基因敲除（Perk-/-）小鼠（C57BL/6背景）購(gòu)自北京唯德生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 芙蓉牌香煙（湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，每支含尼古丁1.0 mg、焦油12 mg）；ERS拮抗劑4-苯基丁酸（4-PBA）、ERS激動(dòng)劑毒胡蘿卜素（MCE公司）；IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（上海西唐生物公司）；HE染色試劑盒（武漢博士德公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司）；PERK、IRE1α、ATF6、PERK、CHOP、Caspase-12一抗（Abcam公司）；eIF2α及p-eIF2α一抗（CST公司）。小動(dòng)物肺功能儀（北京新行興業(yè)科貿(mào)公司）；正置顯微鏡（Nikon公司）；凝膠電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及給藥 野生型雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、激動(dòng)劑組、拮抗劑組，每組8只。Perk-/-雄性小鼠隨機(jī)分為PERK-KO組、PERK-KO+模型組，每組8只。采用被動(dòng)吸煙法制備COPD模型，方法如下：每日將小鼠置于自制薰煙箱內(nèi)、暴露于10支香煙中2次，起始時(shí)燃燒4支香煙，然后每次燃燒2支香煙，每只香煙燃燒約12 min，換煙間隔3 min，2次被動(dòng)吸煙間隔＞4 h，持續(xù)12周。激動(dòng)劑組每日2次被動(dòng)吸煙之間給予300 ng/kg毒胡蘿卜素腹腔注射，劑量選擇參照HUANG等［5］的研究；抑制劑組每日2次被動(dòng)吸煙之間給予0.35 g/kg 4-PBA灌胃，劑量選擇參照任路平等［6］的研究。

1.2.2 肺功能檢測(cè) 腹腔注射1%戊巴比妥鈉，劑量40 mg/kg，麻醉后進(jìn)行氣管插管，與小動(dòng)物肺功能儀連接，測(cè)定0.3 s用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.3 second，F(xiàn)EV0.3）占用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）的比值（FEV0.3/FVC）和呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）。

1.2.3 血清及支氣管肺泡灌流液（BALF）中炎癥細(xì)胞因子的檢測(cè) 完成肺功能測(cè)定后經(jīng)眼球取血， 1 500 r/min離心分離血清；處死小鼠，做頸部切口暴露氣管，插入灌流針并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液1 ml灌洗肺泡3次，吸出BALF并于1 500 r/min 離心 10 min，分離上清。采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6含量。

1.2.4 肺組織病理改變的HE染色 完成血清及BALF取材后，解剖得到適量肺組織，4%多聚甲醛固定后制作4 μm厚的病理切片，采用HE染色試劑盒染色，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，顯微鏡下觀察 肺組織病理改變，測(cè)量肺泡平均截距（mean linear intercept，MLI）。

1.2.5 膈肌組織細(xì)胞凋亡率的TUNEL檢測(cè) 解剖膈肌組織適量，4%多聚甲醛固定后制作4 μm厚的病理切片，采用TUNEL試劑盒染色，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性染色和DAPI陽(yáng)性染色的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按照TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot檢測(cè)膈肌組織中蛋白表達(dá) 另取適量膈肌組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取得到蛋白后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，孵育1∶1 000稀釋的PERK、IRE1α、ATF6、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-12一抗或1∶3 000稀釋的β-actin一抗過(guò)夜，孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影并計(jì)算蛋白條帶吸光度，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)PERK、IRE1α、ATF6、PERK、eIF2α、CHOP、Caspase-12的表達(dá)水平進(jìn)行半定量 分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吸煙COPD模型小鼠肺功能及肺組織病理改變 對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁完整。被動(dòng)吸煙法制作COPD模型后，模型組出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁破裂、肺泡腔擴(kuò)大等病理改變。測(cè)量MLI并比較可知：與對(duì)照組相比，模型組小鼠MLI明顯增加。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組與模型組小鼠肺組織病理改變（HE染色）Fig.1 Pathological changes in lung tissue of mice in control group and model group （HE staining）

小動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)對(duì)照組和模型組小鼠的肺功能指標(biāo)FEV0.3/FVC、PEF，與對(duì)照組相比，模型組小鼠FEV0.3/FVC、PEF明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與模型組小鼠肺功能的比較（±s）Tab.1 Comparison of lung function of mice between control group and model group （±s）

表1 對(duì)照組與模型組小鼠肺功能的比較（±s）Tab.1 Comparison of lung function of mice between control group and model group （±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05.

ELISA法檢測(cè)血清及BALF中IL-1β、IL-6含量以進(jìn)一步確認(rèn)COPD造模成功，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清及BALF中IL-1β、IL-6含量明顯增多（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組與模型組小鼠血清及BALF中IL-1β、IL-6含量的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of IL-1β and IL-6 contents in serum and BALF of mice between control group and model group （±s，n=8）

表2 對(duì)照組與模型組小鼠血清及BALF中IL-1β、IL-6含量的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of IL-1β and IL-6 contents in serum and BALF of mice between control group and model group （±s，n=8）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05.

2.2 吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中ERS通路的變化及ERS激動(dòng)劑、拮抗劑的干預(yù)效果 PERK、IRE1α、ATF6是ERS下游三種信號(hào)分子，Western blot結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，模型組小鼠膈肌中PERK表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），IRE1α、ATF6表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與模型組相比，激動(dòng)劑組小鼠膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表達(dá)水平明顯升 高（P＜0.05），拮 抗 劑 組 小 鼠 膈 肌 中PERK、IRE1α、ATF6表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 4組小鼠膈肌組織中PERK、IRE1α、ATF6表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of PERK， IRE1α and ATF6 in diaphragm tissues of mice among four groups

2.3 吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率的變化及ERS激動(dòng)劑、拮抗劑的干預(yù)效果 ERS的PERK通路具有促細(xì)胞凋亡作用，在證實(shí)模型組小鼠膈肌中PERK表達(dá)增加后，TUNEL檢測(cè)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，模型組小鼠膈肌中細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，激動(dòng)劑組小鼠膈肌中細(xì)胞凋亡率明顯升高，拮抗劑組小鼠膈肌中細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 4組小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率比較Fig.3 Comparison of apoptosis rates in diaphragm tissue of mice among four groups

2.4 吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中PERK下游基因表達(dá)的變化及ERS激動(dòng)劑、拮抗劑的干預(yù)效果 PERK通路對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用依賴于下游eIF2α的磷酸化及ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)的增加，Western blot結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，模型組小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，激動(dòng)劑組小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯升高，拮抗劑組小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 4組小鼠膈肌組織中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of expression levels of p-eIF2α， ATF4， CHOP and Caspase-12 in diaphragm tissues of mice among four groups

2.6Perk基因敲除對(duì)吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中PERK及下游基因表達(dá)的影響 敲除Perk后，Western blot結(jié)果表明：PERK-KO組和PERK-KO+模型組膈肌組織中均不表達(dá)PERK，見(jiàn)圖5；與對(duì)照組相比，PERK-KO組小鼠膈肌組織中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，PERK-KO+模型組小鼠膈肌組織中peIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖5 4組小鼠膈肌組織中PERK表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of PERK expression levels in diaphragm tissues of mice among four groups

圖6 Perk敲除后4組小鼠膈肌組織中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平比較Fig.6 Comparison of expression levels of p-eIF2α， ATF4， CHOP and Caspase-12 in the diaphragm tissues of mice among four groups after Perk knockout

2.7Perk基因敲除對(duì)吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率的影響 TUENL檢測(cè)結(jié)果表明：敲除Perk后，與對(duì)照組相比，PERK-KO組小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化（P＞0.05）；Perk敲除小鼠采用被動(dòng)吸煙法制作COPD模型，與野生型小鼠制作COPD模型的模型組相比，PERK-KO+模型組小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 Perk敲除后4組小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率的比較Fig.7 Comparison of apoptosis rates in diaphragm tissue of mice among four groups after Perk knockout

3 討論

COPD患者長(zhǎng)期處于氣流受限、膈肌負(fù)荷加重狀態(tài)，會(huì)造成膈肌做功增加，加以缺氧、營(yíng)養(yǎng)不良等因素影響，會(huì)導(dǎo)致膈肌功能障礙。多項(xiàng)COPD相關(guān)臨床研究表明，COPD患者存在膈肌移動(dòng)度及收縮速度降低等膈肌功能障礙表現(xiàn)，且膈肌功能障礙程度與肺功能減退、病情急性加重有關(guān)［7-8］。因此，闡明COPD膈肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制具有積極的臨床意義。

膈肌細(xì)胞凋亡是近些年發(fā)現(xiàn)的與COPD發(fā)病過(guò)程中膈肌功能障礙密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)吸煙COPD模型大鼠及小鼠膈肌組織中的細(xì)胞凋亡率均明顯增加［9-10］。本研究采用香煙煙霧吸入方式進(jìn)行COPD造模，造模后模型組小鼠肺組織出現(xiàn)典型的COPD病理改變且肺功能明顯減弱，表明COPD造模成功；而后通過(guò)TUNEL染色檢測(cè)膈肌組織細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示模型組小鼠膈肌組織細(xì)胞凋亡率明顯升高，與既往文獻(xiàn)中COPD模型大鼠及小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率增加的報(bào)道吻合，表明膈肌組織細(xì)胞凋亡與COPD的發(fā)病密切相關(guān)［9-10］。在此基礎(chǔ)上，本研究深入探究了COPD發(fā)病過(guò)程中膈肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞器，在吸煙、感染、缺氧等病理因素刺激下會(huì)發(fā)生ERS，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白聚集，進(jìn)而通過(guò)下游PERK、IRE1α、ATF6三種膜蛋白進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起未折疊蛋白反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11-13］。有研究報(bào)道，在吸煙COPD模型大鼠肺組織中，ERS的PERK通路過(guò)度激活且與肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)［14］；另有COPD相關(guān)的臨床研究證實(shí)，COPD患者膈肌組織中ERS相關(guān)的PERK、IRE1α、ATF6均表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［4］。本研究在COPD模型小鼠膈肌組織中檢測(cè)到PERK表達(dá)明顯增加，IRE1α、ATF6表達(dá)無(wú)明顯變化，提示COPD小鼠膈肌組織中ERS的PERK通路過(guò)度激活，這可能是造成膈肌組織中細(xì)胞過(guò)度凋亡的分子機(jī)制。

在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，PERK通過(guò)引起下游eIF2α磷酸化途徑增加ATF4表達(dá)，ATF4進(jìn)一步誘導(dǎo)CHOP表達(dá)并使Caspase-12發(fā)生活化，最終Caspase-12引起Caspase的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15-17］。本研究在發(fā)現(xiàn)COPD小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡率及PERK表達(dá)增加后，進(jìn)一步對(duì)PERK下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示COPD模型小鼠膈肌組織中p-eIF2α、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平均明顯增加，與細(xì)胞凋亡率及PERK表達(dá)增加的結(jié)果吻合，表明吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中ERS的PERK通路過(guò)度激活可能是造成膈肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

為進(jìn)一步驗(yàn)證ERS在COPD小鼠膈肌細(xì)胞凋亡中的作用，本研究繼續(xù)設(shè)計(jì)了ERS激動(dòng)劑及拮抗劑實(shí)驗(yàn)、Perk基因敲除實(shí)驗(yàn)。在COPD造模過(guò)程中加用ERS激動(dòng)劑后，膈肌組織中細(xì)胞凋亡率及p-eIF2α、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平均進(jìn)一步增加；而加用ERS拮抗劑后，膈肌組織中細(xì)胞凋亡率及p-eIF2α、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平均明顯降低。以上結(jié)果證實(shí)ERS激活與COPD小鼠膈肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。ERS拮抗劑和激動(dòng)劑同時(shí)針對(duì)ERS的三條通路發(fā)揮作用，加用拮抗劑和激動(dòng)劑后PERK、IRE1α、ATF6的表達(dá)均發(fā)生了相應(yīng)變化，僅通過(guò)拮抗劑和激動(dòng)劑的實(shí)驗(yàn)無(wú)法直接證實(shí)PERK通路在膈肌細(xì)胞凋亡中的作用，因此本研究還設(shè)計(jì)了Perk基因敲除實(shí)驗(yàn)，在敲除Perk后進(jìn)行COPD造模，結(jié)果顯示：與野生型小鼠相比，Perk敲除小鼠進(jìn)行COPD造模后膈肌組織中細(xì)胞凋亡率及p-eIF2α、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平均降低，由此證實(shí)PERK通路直接參與COPD小鼠膈肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

綜上所述，吸煙COPD模型小鼠膈肌組織中細(xì)胞凋亡及ERS的PERK通路均過(guò)度激活，PERK通路激活通過(guò)下游p-eIF2α/CHOP/Caspase-12通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究的特殊和創(chuàng)新之處在于首次通過(guò)基因敲除小鼠闡明膈肌中ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在COPD發(fā)病中的作用，為今后闡明ERS在COPD膈肌細(xì)胞凋亡中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為今后深入探究COPD發(fā)病過(guò)程中膈肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制提供了新思路。