干擾PAG1介導腫瘤相關巨噬細胞自噬狀態提高放射抗拒喉鱗癌的放射 敏感性研究①

張 鄂 黃 暢 費永光 岑瑞祥 陳 沛 （武漢市第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430022）

喉癌是頭頸部癌中較為常見的惡性腫瘤類型，具有較高的發病率和病死率。喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌中最常見的組織病理學類型，約占喉癌病例的85%～95%，據統計，全球每年約能診斷出110 000例LSCC新發病例，其中有40%已處于癌癥晚期［1-2］。LSCC的主要治療方法仍是手術切除，然而部分晚期LSCC由于發生了遠處轉移而無法進行手術根治。對于這些轉移且難以切除的LSCC病例，放射治療在局部控制中發揮關鍵作用［3］。但LSCC患者在放射治療過程中往往產生放射抗拒，導致患者預后較差，五年總生存率仍然較低。因此，有必要對LSCC放射抗拒發生發展中的調控機制進行深入了解，以選擇有效的治療靶標，提高腫瘤細胞的放射敏感性。

鞘糖脂微結構域1相關磷酸化蛋白（phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains 1，PAG1）是一種跨膜銜接蛋白，位于細胞膜脂筏。PAG1在抗原運輸和免疫信號傳導中具有重要作用，其表達水平的增加可能具有促炎作用［4-5］。既往研究表明，PAG1在腫瘤中發揮的作用取決于其表達水平，此外，在喉癌原發性放射抗拒表型中具有關鍵調控作用［6］。鑒于此，本研究通過檢測LSCC組織中PAG1的表達水平，并將PAG1-siRNA轉染至腫瘤相關巨噬細胞，建立腫瘤相關巨噬細胞與放射抗拒人喉鱗癌細胞共培養體系，探究PAG1在介導腫瘤相關巨噬細胞對放射抗拒人喉鱗癌細胞的作用及相關機制，為開發有效的克服LSCC放射抗拒基因治療措施奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集2018年1月至2020年6月于武漢市第一醫院接受手術切除的LSCC患者40例的腫瘤組織及鄰近癌旁組織（距腫瘤邊緣≥5 mm）。其中男性24例，女性16例，年齡43～71歲，平均年齡（48.90±5.12）歲，所有患者均為原發病例，臨床資料完整，且手術前未接受放化治療。病理切片由 2名經驗豐富的病理醫師復查判定。在手術中取材的新鮮標本立即于液氮中冷凍，置于-80 ℃冰箱保存。所有對象均簽署知情同意書，該研究方案在武漢市第一醫院倫理委員會的監督下獲得批準和實施。

1.1.2 主要材料與試劑 人喉鱗癌細胞株Hep-2和人外周血單核細胞系THP-1購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，放射抗拒人喉鱗癌細胞株Hep-2max由武漢市第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科構建保存；免疫組織化學染色試劑購自上海昊鑫生物公司；Trizol試劑和Lipofectamine2000細胞轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；PMA和IL-4購自美國Sigma公司；IL-6、IL-12、IL-4及IL-10 ELISA試劑盒購自南京凱基生物公司；Transwell小室購自杭州四季青生物公司；MTT試劑液和免疫熒光染色試劑購自上海碧云天生物研究所；Annexin V-FITC/PI和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司；兔抗人CD86-PE和CD206-FITC抗體購自eBioscience公司；兔抗人PAG1、Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及P62購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和FITC標記的山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling公司。PAG1-siRNA（5'-GCAGAGAUAUUACCAGGCUdTdT-3'）及陰性對照序列（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'）參考文獻［7］設計，交由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色檢測LSCC組織中PAG1表達 將LSCC組織及癌旁組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，經梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，常規石蠟包埋，制備厚度為4 μm的連續切片。切片脫蠟脫水，加入枸櫞酸緩沖液煮沸10 min，冷卻，PBS清洗，然后將切片置于3%H2O2溶液消除內源性過氧化物酶，PBS清洗，滴加山羊血清封閉液，室溫封閉 30 min，滴加稀釋的兔抗人PAG1（1∶200），4 ℃下孵育過夜。次日，PBS清洗，滴加稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫繼續孵育30 min，PBS再次清洗，滴加二氨基聯苯胺（DAB）顯色，采用蘇木素復染15 s，流水反復沖洗，脫水透明，中性樹膠封片，干燥，通過光學顯微鏡觀察組織切片并拍照。PAG1陽性表達以棕色顆粒為主，電鏡下隨機選擇 5個視野，以陽性細胞結合染色強度進行綜合評定。陽性細胞評分：陽性細胞比例＜5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分。染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者相加分數＜2分則判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測PAG1 mRNA表達 在剪碎的組織或細胞中加入Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度與濃度，選擇OD260/OD280范圍在1.8～2.0之間的樣品。根據反轉錄試劑盒說明書操作，將總RNA逆轉錄合成cDNA，RT-qPCR檢測基因表達，以cDNA為模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實驗，GAPDH作為內參基因。擴增條件如下：95 ℃ 3 min，1個循環；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，40個循環，根據2-ΔΔCt法計算基因mRNA相對表達量。引物交由上海生工生物公司合成，PAG1正向引物：5'-GCAGCGGACAGATGCAGAT-3'，反向引物：5'-CAGGAAGATGAGGAAGGTGATGA-3'；GAPDH正向引物：5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，反 向 引 物：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

1.2.3 腫瘤相關巨噬細胞的誘導與鑒定 取生長狀態良好的THP-1細胞，調整密度為1×106個/ml，吸取100 μl接種于6孔板，參考文獻［8］方法誘導，加入含50 ng/ml PMA的培養基誘導24 h后，棄培養液，PBS清洗細胞；再加入含20 ng/ml IL-4的培養基誘導72 h，使細胞分化為M2型腫瘤相關巨噬細胞，以未誘導的THP-1細胞作為對照組。參考文獻［9］方法，根據細胞是否貼壁，胞體是否出現偽足以及M2型巨噬細胞生物指標CD206是否上調判斷誘導是否成功。收集誘導后的細胞，PBS洗滌并重懸，在細胞懸液中加入等體積血清，室溫下封閉30 min，加入兔抗人CD86-PE抗體和兔抗人CD206-FITC抗體，4 ℃下暗室孵育30 min，PBS洗滌細胞，并再次重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞表面巨噬細胞標記物的表達情況。

1.2.4 PAG1-siRNA轉染腫瘤相關巨噬細胞 取誘導后的腫瘤相關巨噬細胞，調整密度為1×106個/ml，吸取100 μl接種于96孔板，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱過夜培養。將細胞隨機分為3組，包括對照組、陰性對照組（NC-siRNA）、PAG1-siRNA組，按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書操作，配制PAG1-siRNA及陰性對照NC-siRNA與脂質體Lipofectamine2000復合物，在對應分組細胞中加入復合物進行轉染，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養4～6 h，棄培養液，換用新鮮培養液繼續培養48 h，RT-qPCR和Western blot檢測細胞轉染效果。

1.2.5 Western blot檢測PAG1與自噬相關蛋白表達 在各處理組細胞中加入預冷的RIPA裂解液，置于冰上裂解，離心取上清液，根據BCA試劑盒說明測定蛋白濃度。各組蛋白樣品均以30 μg進行上樣，通過10%SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白電轉至PVDF膜。TBST洗膜，并置于5%山羊血清中封閉2 h，再次洗膜后，加入稀釋的兔抗人PAG1 （1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、

LC3-I（1∶1 000）及P62（1∶1 000）抗體，4 ℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）抗體，室溫繼續孵育2 h。TBST洗膜，滴加ECL化學發光試劑液顯影，凝膠成像系統觀察各蛋白條帶，Image J圖像分析軟件統計各條帶灰度值，以GAPDH為內參計算各目的蛋白表達水平。

1.2.6 ELISA檢測單核細胞分泌相關細胞因子表達變化 收集轉染48 h后各處理組腫瘤相關巨噬細胞培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測巨噬細胞分泌相關細胞因子IL-6、IL-12、IL-4及IL-10含量。酶標儀測定各反應孔在450 nm處的吸光度值（A），制作標準曲線，計算各孔中對應各項細胞因子水平。

1.2.7 細胞共培養系統的建立與放射處理 以孔徑為0.4 μm的Transwell小室和24孔細胞培養板建立Transwell共培養系統，在上室接種處于對數期的Hep-2max細胞1×105個，下室接種不同處理組的腫瘤相關巨噬細胞2×105個。根據下室接種的細胞類型，分組包括：Hep-2max組（下室為正常培養基）、M2+Hep-2max組（下室為誘導后的腫瘤相關巨噬細胞）、PAG1-siRNA-M2+Hep-2max組（下室為PAG1-siRNA轉染的誘導后的腫瘤相關巨噬細胞）。將Transwell共培養系統置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中連續培養4 d，收集上室Hep-2max細胞。采用8 Gy X射線照射Hep-2max細胞24 h，1 000 r/min離心5 min，收集細胞。此處以未經8 Gy X射線照射的Hep-2max細胞作為對照組。

1.2.8 MTT法檢測細胞活性 調整各處理組Hep-2max細胞濃度，以2×104個/孔接種至96孔板，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，分別在培養24 h、48 h及72 h時，在每孔中加入20 μl MTT （5 mg/ml）試劑，繼續孵育4 h，棄培養液，每孔加入150 μl DMSO試劑，置于搖床振蕩至藍紫色結晶甲瓚完全溶解，酶標儀測定各反應孔在490 nm處的吸光值（A）。

1.2.9 流式細胞術檢測細胞凋亡 PBS洗滌各處理組Hep-2max細胞，以1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入適量1×binding buffer重懸細胞，調整密度為1×106個/ml，取100 μl細胞懸液，依次加入5 μl Annexin V/FITC混勻，室溫避光孵育5 min，再加入10 μl碘化丙啶（PI），混勻后室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.10 TUNEL染色檢測細胞凋亡 采用PBS洗滌各處理組Hep-2max細胞，加入4%多聚甲醛，固定細胞30 min，加入含0.3%Triton X-100的PBS重懸細胞，室溫避光孵育5 min，然后加入TUNEL檢測液，反復吹打至混勻，置于37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗滌細胞，經涂片處理，在熒光顯微鏡下隨機選擇 5個視野觀察，計視野下細胞總數目和TUNEL陽性染色細胞數目，計算TUNEL陽性率。

1.2.11 免疫熒光染色檢測細胞自噬水平 采用PBS洗滌各處理組Hep-2max細胞，加入4%多聚甲醛固定細胞15 min，加入含0.5%TritonX-100的PBS液通透處理15 min，PBS洗滌細胞，采用10%山羊血清封閉細胞2 h，加入稀釋的兔抗人LC3（1∶200）抗體，4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌細胞，滴加熒光素FITC標記的山羊抗兔IgG（1∶250）抗體，室溫避光孵育1 h，滴加DAPI試劑，避光孵育5 min進行染核，PBS洗滌細胞，涂片處理，在熒光顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察，觀察蛋白熒光表達強度并拍照。

1.3 統計學分析 SPSS23.0統計學軟件進行實驗數據分析，Graphpad Prsim 8制作統計圖，計量資料采用xˉ±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LSCC組織及癌旁組織中PAG1表達比較 通過免疫組織化學染色觀察到癌旁組織染色較淺，PAG1陽性表達率為7.50%（3/40），而LSCC腫瘤組織中可見明顯棕黃色至褐色的染色，PAG1陽性表達率達97.50%（39/40），陽性表達率較癌旁組織明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖1A。RT-qPCR檢測結果顯示，LSCC腫瘤組織中PAG1 mRNA相對表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 喉鱗癌組織及癌旁組織中PAG1表達檢測Fig.1 Detection of PAG1 expression in LSCC tissues and adjacent tissues

2.2 腫瘤相關巨噬細胞形態與標志物表達檢測 倒置相差顯微鏡觀察誘導前后細胞的形態變化，可見誘導前THP-1細胞邊緣清晰，呈規則的圓形或類圓形，而誘導后的細胞形態發生明顯改變，呈不規則多邊形，胞體有尾足伸出，見圖2A。流式細胞術檢測結果顯示，實驗組細胞中M1巨噬細胞表面標記物CD86表達較對照組明顯減少，M2型巨噬細胞表面標志物CD206表達較對照組則明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2B。

圖2 腫瘤相關巨噬細胞的鑒定Fig.2 Identification of tumor-associated macrophages

2.3 轉染后腫瘤相關巨噬細胞中PAG1表達檢測 RT-qPCR和Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，PAG1-siRNA組腫瘤相關巨噬細胞中PAG1 mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.01），而NC-siRNA組細胞中PAG1 mRNA和蛋白相對表達量與對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 轉染后各組腫瘤相關巨噬細胞中PAG1表達檢測Fig.3 Detection of PAG1 expression in tumor-associated macrophages of each group after transfection

2.4 轉染后腫瘤相關巨噬細胞上清細胞因子表達比較 ELISA檢測結果顯示，PAG1-siRNA組腫瘤相關巨噬細胞上清中IL-6、IL-12水平較對照組升高，IL-4和IL-10水平較對照組降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；NC-siRNA組與對照組中上述細胞因子水平變化差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 轉染后各組腫瘤相關巨噬細胞中上清細胞因子表達檢測Fig.4 Detection of cytokine expression in supernatant of each group of tumor-associated macrophages after transfection

2.5 各處理組Hep-2max細胞活性比較 MTT檢測結果顯示，與對照組相比，8 Gy X射線照射的Hep-2max細胞活性降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與誘導后腫瘤相關巨噬細胞共培養再經8 Gy X射線照射的細胞相比，誘導后腫瘤相關巨噬細胞轉染PAG1-siRNA與Hep-2max共培養后，再經8 Gy X射線照射，細胞活性下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組Hep-2max細胞OD值比較（±s）Tab.1 Comparison of OD value of Hep-2max cells in each group （±s）

表1 各組Hep-2max細胞OD值比較（±s）Tab.1 Comparison of OD value of Hep-2max cells in each group （±s）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with M2+Hep-2max， 2）P＜0.05.

2.6 各處理組Hep-2max細胞凋亡情況比較 流式細胞術檢測結果顯示，經8 Gy X射線照射的Hep-2max細胞凋亡率較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與Hep-2max細胞和誘導后腫瘤相關巨噬細胞共培養后再經8 Gy X射線照射的細胞相比，Hep-2max細胞和誘導后腫瘤相關巨噬細胞轉染PAG1-siRNA共培養后再經8 Gy X射線照射的細胞凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5。TUNEL染色結果顯示，與對照組相比，經過 8 Gy X射線照射的Hep-2max細胞TUNEL陽性率升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與Hep-2max細胞和誘導后腫瘤相關巨噬細胞共培養后再經8 Gy X射線照射的細胞相比，誘導后腫瘤相關巨噬細胞轉染PAG1-siRNA共培養后再經過8 Gy X射線照射的細胞TUNEL陽性率升高，差異具有統計學意義 （P＜0.01），見圖6。

圖5 流式細胞術檢測各處理組Hep-2max細胞凋亡Fig.5 Flow cytometry detection of Hep-2max cell apoptosis in each treatment group

圖6 TUNEL染色檢測各處理組Hep-2max細胞凋亡（×100）Fig.6 TUNEL staining to detect Hep-2max cell apoptosis in each treatment group （×100）

2.7 各處理組Hep-2max細胞自噬水平比較 通過免疫熒光染色觀察細胞自噬情況，可見未經處理的對照組Hep-2max細胞中綠色熒光強，LC3表達水平高；經8 Gy X射線照射的細胞中綠色熒光強度較對照組明顯減弱，LC3表達水平降低；與誘導后腫瘤相關巨噬細胞共培養后再經8 Gy X射線照射的細胞中綠色熒光強度稍暗，LC3表達水平較高；而與誘導后腫瘤相關巨噬細胞轉染PAG1-siRNA共培養后再經8 Gy X射線照射的細胞中綠色熒光強度明顯減弱，LC3表達水平降低，見圖7。Western blot檢測自噬相關蛋白表達結果顯示，與對照組相比，經8 Gy X射線照射的Hep-2max細胞中Beclin-1蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與誘導后腫瘤相關巨噬細胞共培養后再經8 Gy X射線照射的細胞相比，Hep-2max細胞和誘導后腫瘤相關巨噬細胞轉染PAG1-siRNA共培養再經 8Gy X射線照射后細胞中Beclin-1蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖8。

圖7 免疫熒光染色檢測各處理組Hep-2max細胞自噬（×400）Fig.7 Immunofluorescence staining to detect autophagy of Hep-2max cells in each treatment group （×400）

圖8 Western blot檢測各處理組Hep-2max細胞自噬相關蛋白表達Fig.8 Western blot detection of autophagy-related protein expression in Hep-2max cells in each treatment group

3 討論

LSCC是僅次于肺癌的第二大上呼吸道惡性腫瘤，在世界范圍內，種族、國家、年齡及性別之間的差異造成了LSCC在各地區與各國家間的不同發病率［10］。盡管近年來包括外科手術、放射療法和化學療法在內的多式聯運療法已有所改善，但患者預后仍不理想。目前，LSCC的復雜病理機制尚不明確，吸煙、飲酒、空氣污染和HPV等因素是導致該疾病的主要誘因［2，11］。在臨床實踐中，LSCC的短期或長期預后取決于其臨床階段，包括遠處轉移、原發腫瘤大小和淋巴結受累。由于疾病的不同階段具有各自的特征，僅靠分期不足以預測LSCC的預后和復發風險。因此，闡明LSCC發生發展的重要分子發病機制，鑒別關鍵的作用因子，對探討LSCC的治療策略意義重大。

PAG1也稱Csk結合蛋白，作為一種普遍表達的跨膜蛋白，充當Src家族激酶（SFK）的重要調節劑。PAG1在各種惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用，但其表達水平在不同類型癌細胞中是可變的。PAG1表達的增加或減少反映了其在腫瘤細胞中的兩種不同途徑和功能，即具有促癌作用或抗癌作用。在某些癌細胞中，PAG1表達的下調通過MAPK/PI3K途徑的表觀遺傳組蛋白修飾和二惡英受體AhR的轉錄抑制來解釋，而PAG1表達的上調可能取決于PAG-Lyn信號體的形成以及與EBP50的相互作用［7，12］。本研究發現PAG1在LSCC組織中過表達，但在非腫瘤組織中表達水平較低，推測PAG1可能參與LSCC的病理過程。此外，LIN等［13］研究發現PAG1在鼻咽癌組織和細胞中表達上調，通過靶向PTEN刺激鼻咽癌的增殖與轉移能力，從而加重鼻咽癌的惡性進程，進一步實驗表明了敲低PAG1可阻止鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲；LU等［14］報道指出PAG1在乳腺癌中高表達，并通過激活Src促進乳腺癌細胞的增殖與轉移。由此可見，腫瘤組織中高表達的PAG1可能是潛在的致癌因子。

腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，通過多種機制參與腫瘤細胞活化、腫瘤血管生成和轉移等過程。腫瘤為逃避巨噬細胞的殺傷作用能夠使腫瘤相關巨噬細胞表型發生改變，從而促進腫瘤發展進程［15］。目前，一些研究證據表明腫瘤相關巨噬細胞在癌癥的放化療抗性中可能發揮重要作用。ZHENG等［16］最新研究指出在化學療法刺激下使得更多腫瘤相關巨噬細胞被募集到結直腸癌腫瘤組織中，這與化學抗藥性的發展高度相關，而由腫瘤相關巨噬細胞產生的高水平表達的GDF15通過增強脂肪酸β氧化過程從而破壞腫瘤細胞的化學敏感性；ZHENG等［17］研究發現腫瘤相關巨噬細胞來源的miR-21參與介導胃癌細胞對順鉑的耐藥性，miR-21可直接從腫瘤相關巨噬細胞轉移到胃癌細胞，通過下調PTEN增強PI3K/AKT信號通路激活，促進胃癌細胞耐藥性產生并抑制細胞凋亡；HUANG等［18］研究發現順鉑耐藥的肺癌細胞不僅顯示出較強的自我更新能力，還通過分泌巨噬細胞抑制因子促進腫瘤相關巨噬細胞向M2型的極化，并發現這一現象與Src相關信號增加有關。以上研究均提示腫瘤相關巨噬細胞可能與腫瘤細胞耐藥性密切相關。同樣，本研究結果顯示，干擾PAG1表達的腫瘤相關巨噬細胞能夠增加放射抗拒人喉鱗癌細胞Hep-2max的放射敏感性，促進Hep-2max細胞凋亡發生。

自噬是一種高度保守的機制，是細胞內蛋白質質量控 制系統的主要組成部分之一，可去除受損細胞器以維持細胞穩態。自噬與細胞凋亡間既有協同作用也有拮抗作用，兩者參與了腫瘤細胞化學抗性的穩態［19-20］。研究表明，腫瘤相關巨噬細胞自噬狀態的改變可能對腫瘤細胞的放化療敏感性產生重要影響。APEL等［21］研究發現在下調腫瘤細胞自噬水平后，原本放射抵抗的大腸癌細胞放射敏感性明顯增加；SHAO等［22］研究結果表明結直腸癌細胞的放射敏感性與腫瘤相關巨噬細胞自噬有關，腫瘤相關巨噬細胞中自噬的上調可抑制結腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，增加結直腸癌細胞的放射敏感性；GUO等［23］研究結果指出通過氯喹抑制自噬能夠改變腫瘤相關巨噬細胞狀態，重新極化的M1型巨噬細胞顯示出對Hep-2細胞較高的吞噬活性，增加了Hep-2細胞對順鉑的敏感性。本研究發現，干擾PAG1表達的腫瘤相關巨噬細胞與放射抗拒人喉鱗癌細胞Hep-2max共培養后，細胞中LC3綠色熒光強度明顯減弱，同時，Beclin-1蛋白表達水平降低、P62蛋白表達水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ下調，說明細胞自噬狀態受到抑制。

綜上所述，干擾PAG1能夠抑制腫瘤相關巨噬細胞自噬水平，增加與之共培養的放射抗拒人喉鱗癌細胞的放射敏感性。因此推測腫瘤微環境中腫瘤相關巨噬細胞自噬的調節狀態可能是腫瘤放射抵抗的機制之一。本研究為提高腫瘤放療效果的研究提供新思路，該作用涉及的詳細機制值得進一步深入研究。