使用致敏因子OVA構建大鼠分泌性中耳炎模型

劉懿萱，張南鳳，魯小玲，于慧前

分泌性中耳炎，又稱漿液性中耳炎，以中耳積液和聽力下降為主要特征，是耳科的常見病[1-2]。分泌性中耳炎的病因與發病機制復雜，目前普遍認為分泌性中耳炎的發病與細菌和病毒感染、咽鼓管功能障礙、腺樣體肥大或炎癥、過敏性炎癥和咽部返流等相關[3]。分泌性中耳炎病因和發病機制的復雜性也反應了其治療的多樣性，因此需要更進一步的研究，而一個有效的動物模型的建立尤其重要。既往研究發現中耳炎患者的中耳積液中炎癥介質富集，包括組胺、腫瘤壞死因子和白介素等，并且炎癥介質在動物模型中被證實可誘導分泌性中耳炎的發生[4-6]。本研究探討致敏因子雞卵白蛋白（OVA）對大鼠中耳的作用，以及其作為大鼠分泌性中耳炎動物模型誘導因子的有效性，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取40只健康的SPF級Sprague-Dawley（SD）6～8周的雄性大鼠，體質量為250～300 g。所有動物購自維通利華（北京），并在復旦大學上海醫學院動物實驗中心SPF級動物實驗室中進行飼養及相關實驗，實驗前適應性飼養1周，所有大鼠均排除耳科相關疾病。

1.2 造模方法 將大鼠隨機分為對照組和中耳炎組（OME組）。第一階段為全身致敏階段，在適應性喂養后第1天，對照組和OME組的大鼠均通過腹腔注射1.2 mg OVA（A5503，Sigma）（將其溶解在0.6 ml的PBS中，用5.14 mg氫氧化鋁作為免疫佐劑）。第8天，重復致敏注射。第15和16天是耳內激發階段，在第15天，用10%水合氯醛溶液（330 mg/kg）麻醉大鼠，使用顯微鏡下的微型注射器通過鼓膜的后下象限或前下象限將0.1 mg OVA（將其溶解在35l PBS液中）注射到OME組大鼠雙側中耳腔中，對照組大鼠則注射等量PBS。第16天，再次麻醉大鼠，重復鼓膜注射，見圖1。

圖1 大鼠中耳炎模型建造方案

1.3 檢測方法 第16天完成鼓膜注射后即造模完成，進行后續驗證。經腹腔注射10%水合氯醛溶液行全身麻醉后，進行下列觀察及檢測。

1.3.1 鏡下觀察鼓膜 耳內鏡下觀察大鼠鼓膜的色澤、形狀以及有無積液等。隨后，斷頭處死大鼠，在解剖顯微鏡下解剖出聽泡，觀察中耳腔積液情況。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色切片觀察 取出的聽泡經打孔后，放置于10%的多聚甲醛中，于4℃固定24 h，然后經過10%乙二胺四乙酸溶液（EDTA），于4℃脫鈣24 h，常規石蠟包埋、切片，進行HE染色。通過30×、60×放大倍率的光學顯微鏡下觀察中耳黏膜，評估中耳損傷的嚴重程度。

2 結果

所有大鼠在試驗期間行為、飲食及活動均正常，未見意外死亡。

2.1 鼓膜形態 對照組20只大鼠共40耳，鼓膜呈半透明薄膜狀，橫徑較縱徑長，可分為緊張部和松弛部。緊張部鼓膜透明，可見錘骨柄；松弛部鼓膜向外膨隆，可隨呼吸向鼓室內外擺動。均未出現內陷、氣液平面或者鼓室內氣泡等分泌性中耳炎表型。模型組20只大鼠共32耳，鼓膜出現大量的中耳內積液，耳道顯示出清晰的徑向血管分布，可診斷大鼠存在分泌性中耳炎。

2.2 黏膜組織學改變 對照組20只大鼠共40只耳，中耳黏膜主要是單層扁平上皮，未顯示出異常；而模型組20只大鼠共32只耳，可在鏡下觀察到黏膜和黏膜下組織增厚，見圖2。

圖2 大鼠中耳黏膜組織

3 討論

目前，常用于分泌性中耳炎造模的動物包括大鼠、小鼠、豚鼠和兔等，傳統的建模方法主要有改變咽鼓管結構和功能[7]，包括用木塞、膨脹海綿、燒灼咽鼓管咽口、組織膠等進行咽鼓管的機械堵塞；使用三叉神經紊亂、切斷或麻痹腭帆張肌等造成咽鼓管功能障礙；使用細菌及其產物進行鼓室注射造模等[8-10]。近期也有學者使用基因工程技術構建分泌性中耳炎的轉基因小鼠模型，包括Sh3pxd2b突變小鼠、22q11.2突變雜合突變小鼠、Oxgr1敲除小鼠等[11-12]。對于實驗動物和造模方法的選擇，實驗室往往會根據實驗工作條件，造模方法的難易程度、可行性及穩定性等方面進行考慮，會結合自身研究的切入點選擇或改良合適的建模方法。

本研究考慮到大鼠性格溫和、外耳道較小鼠寬大，且飼養方便的特點，選擇使用大鼠進行造模。OVA作為一種致敏因子，不會破壞中耳腔及咽鼓管的正常解剖結構，且不是細菌及其代謝產物，不會對分泌性中耳炎的炎癥反應及進一步的炎癥轉歸的觀察產生影響，具有一定的模型優越性。本研究采用微型注射器進行鼓膜穿刺給藥，可大大減小對鼓膜局部的創傷，極大降低繼發性感染的可能性。通過耳內鏡下觀察鼓膜形態和鼓室內積液情況，可直接為大鼠分泌性中耳炎的診斷提供依據。HE染色結果顯示分泌性中耳炎大鼠的鼓室黏膜增厚，并且有炎性細胞浸潤，這進一步說明大鼠分泌性中耳炎模型的成功建立，也從另一方面反映了炎癥細胞在分泌性中耳炎發病機制中的作用，這也是未來研究的方向。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 魯小玲、劉懿萱：實驗操作、論文撰寫；劉懿萱、張南鳳：數據整理、統計學分析；魯小玲、于慧前：研究指導、論文修改、經費支持