白花香蓮解毒顆粒治療HBeAg 陽(yáng)性慢性乙型肝炎的臨床療效及對(duì)血漿外泌體miR-122表達(dá)的影響?

蒙蔭杰，邱 華，黃 鵬，李 旺，毛德文

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染肝臟后引起的一種慢性傳染性疾病。由CHB 導(dǎo)致的相關(guān)疾病，如肝硬化、肝癌等，其治療費(fèi)用給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。miR-122 是肝臟中特異性表達(dá)量最多的miRNA，占成年人肝臟中總MicroRNAs（miRNAs）的70%［1］。研究表明，miR-122過(guò)表達(dá)能夠抑制HBV的復(fù)制［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，壯藥白花香蓮解毒顆粒能夠抑制HBV-DNA的復(fù)制及HBeAg分泌，同時(shí)可改善肝功能［3］。為了進(jìn)一步明確其臨床療效及作用機(jī)制，筆者使用隨機(jī)對(duì)照研究方法，觀察治療前后兩組臨床療效、乙肝兩對(duì)半定量、血漿外泌體miR-122、乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的水平、肝功能并記錄不良反應(yīng)事件，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年6月至2019年10月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科門診就診的120例HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組60例，同時(shí)納入30例健康體檢者作為健康組。觀察組中男38例，女22例；平均年齡（37.25±5.81）歲；平均病程（14.18±5.83）年；血清HBV DNA（6.57±0.96）copies/mL；HBeAg滴度為（942.31±527.18）S/Co；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶（alanine aminotransferase，ALT）為（107.52±23.46）U/L。對(duì)照組中男43例，女17例；平均年齡（38.14±6.32）歲；平均病程（13.52±6.47）年；血清HBV DNA（6.43±0.87）copies/mL，HBeAg 滴 度 為（926.45±516.73）S/Co；ALT 為（102.83±25.31）U/L。兩組基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)納入：1）符合文獻(xiàn)［4］中HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)者；2）血清HBeAg、HBsAg均為陽(yáng)性者；3）年齡18～65歲者；4）本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：AF/SC-08/03.1），且患者簽署知情同意書(shū)者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)排除：1）合并失代償期肝硬化、肝細(xì)胞癌、肝性腦病及其他嚴(yán)重的全身性疾病和精神病者；2）HIV 抗體陽(yáng)性者；3）合并其他類型肝炎病毒者；4）對(duì)恩替卡韋耐藥者；5）孕婦及哺乳期婦女；6）近3月內(nèi)曾參加其他臨床試驗(yàn)者。

1.4 治療方法對(duì)照組給予恩替卡韋（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20100019，批號(hào)：18015461）口服，每日0.5 mg，每日1次。共治療48 周。觀察組抗病毒治療與對(duì)照組相同，同時(shí)服用白花香蓮解毒顆粒（藥物組成：白花蛇舌草30 g，三葉香茶菜20 g，黃花倒水蓮15 g，排錢草15 g），每日2 次，每次2 袋，早晚飯后溫服。兩組均治療48周。

1.5 觀察指標(biāo)于治療前及治療12、24、48 周時(shí)測(cè)定以下指標(biāo)。

1.5.1 乙肝兩對(duì)半定量 采用雅培公司的化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乙肝兩對(duì)半定量。

1.5.2 外泌體miR-122 的測(cè)定 采集各組試驗(yàn)者外周靜脈血5 mL，標(biāo)本以3000×g離心10 min，吸取血漿。按照外泌體試劑盒說(shuō)明書(shū)（大連美侖生物技術(shù)有限公司）提取外泌體，采用western blot 檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志性marker CD63、CD9 來(lái)對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。提取外泌體后，嚴(yán)格按照Trizol 試劑盒（購(gòu)自上海名勁生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)操作，采用Trizol 法提取總RNA，并在260、280 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)RNA 溶液的吸光度，若A260/A280為1.8～2.1，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA。PCR 擴(kuò)增：實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均擴(kuò)增miR-122 及U6 兩個(gè)基因，以CT 值形式表示RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，采用U6作為內(nèi)參，miR-122的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔCt表示。

1.5.3 HBV DNA 定量 采用熒光定量PCR 法檢測(cè)血清HBV DNA 載量（試劑盒購(gòu)自廣東凱普生物科技股份有限公司）。

1.5.4 肝功能檢測(cè) 采用日本奧林巴斯公司的全自動(dòng)生化儀進(jìn)行肝功能檢測(cè)：ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血清總膽紅素（total bilirubin，TBiL）、白蛋白（albumin，ALB）水平。因ALT 水平與肝臟病理學(xué)顯著的炎癥壞死和纖維化相關(guān)，因此本研究主要觀察ALT水平作為肝功能恢復(fù)的指標(biāo)。

1.5.5 安全性指標(biāo) 觀察兩組血常規(guī)、腎功能、心電圖，并記錄不良反應(yīng)事件。

1.5.6 臨床療效［4］顯效：ALT、TBiL值恢復(fù)正常，HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBV-DNA（-）。有效：ALT、TBiL值恢復(fù)正常或下降50%以上，HBeAg（-）或HBV-DNA（-），或HBeAb（+）。無(wú)效：未達(dá)到上述指標(biāo)者。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s 表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBeAg 水平比較治療12、24、48 周時(shí)，觀察組HBeAg滴度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組HBeAg水平、miR-122相對(duì)表達(dá)量、HBV-DNA及ALT水平比較（±s）

注：與本組治療前比較，a表示P＜0.05，b表示P＞0.05；與對(duì)照組同期比較，c表示P＜0.05，d表示P＞0.05，-表示無(wú)數(shù)值

組別例數(shù)ALT（U/L）107.52±23.46d觀察組60 61.72±18.54a，c 41.48±7.52a，c 12.46±3.61a，c 102.83±25.31對(duì)照組60 69.47±21.49a 47.85±9.26a健康組18.35±4.68a-30時(shí)間治療前治療12周治療24周治療48周治療前治療12周治療24周治療48周-HBeAg（S/Co）942.31±527.18d 723.56±228.71a，c 402.13±204.25a，c 184.37±103.54a，c 926.45±516.73 874.43±352.62a 751.26±243.46a 331.28±215.41a-miR-122水平0.51±0.26c，d 2.82±0.74a，c 6.57±1.26a，c 10.62±2.17a，c 0.48±0.24 0.50±0.22b 0.53±0.25b 0.56±0.21b 1.21±0.37 HBV-DNA（copies/mL）6.57±0.96d 4.31±0.24a，c 3.14±0.42a，c 0.84±0.12a，d 6.43±0.87 4.75±0.81a 3.81±0.56a 0.87±0.15a-

2.2 血漿miR-122 相對(duì)表達(dá)量治療前，兩組血漿中miR-122 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組與健康組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，在12、24、48 周時(shí)，觀察組高于治療前，且同時(shí)段比較，觀察組均高于對(duì)照組（P＜0.05）；對(duì)照組治療12、24、48周時(shí)與治療前比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 血清HBV-DNA 定量及ALT 水平治療前，兩組血清HBV-DNA、ALT水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；治療12、24、48周時(shí)，上述指標(biāo)兩組較治療前均有改善（P＜0.05）。兩組同時(shí)段比較，治療12、24 周時(shí)，觀察組HBV-DNA、ALT 水平均低于對(duì)照組（P＜0.05）；治療48周進(jìn)，兩組HBV-DNA比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組ALT 水平比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 不良反應(yīng)治療后，兩組受試者的血常規(guī)、腎功能及心電圖均未見(jiàn)明顯變化，兩組均未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。

2.5 臨床療效治療48 周時(shí)，觀察組顯效15 例（25.00%），有 效39 例（65.00%），無(wú) 效6 例（10.00%），總有效率為90.00%（54/60）；對(duì)照組顯效7 例（11.67%），有效36 例（60.00%），無(wú)效17 例（28.33%），總有效率為71.67%（43/60）。觀察組總有效率高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

中醫(yī)藥是我國(guó)寶貴的醫(yī)療資源，在抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、保肝抗炎等方面具有一定的療效［5-6］。壯醫(yī)藥因其獨(dú)特的理論及治則治法為廣大人民群眾所接受。壯醫(yī)學(xué)認(rèn)為，毒和虛是引起疾病的重要病因病機(jī)［7］，壯醫(yī)將HBV 病毒歸為疫毒，屬于“毒邪”范疇，當(dāng)毒邪感染人體后，留于肝臟，邪正相爭(zhēng)，導(dǎo)致龍路、火路擁塞，水道、谷道、氣道不通利，毒邪內(nèi)留日久，耗傷正氣，出現(xiàn)五臟六腑功能失調(diào)，氣血化生不足，而濁毒稽留體內(nèi)，形成毒虛共存這一病機(jī)特點(diǎn)。因此，針對(duì)慢性乙型肝炎的病機(jī)特點(diǎn)，結(jié)合壯鄉(xiāng)地處亞熱帶的氣候環(huán)境，在“解毒補(bǔ)虛”這一壯醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，形成了獨(dú)具特色的方藥——白花香蓮解毒顆粒。方中白花蛇舌草為主藥，解熱毒，除濕毒，通龍路；黃花倒水蓮為公藥，補(bǔ)虛健脾；三葉香茶菜為母藥，清解熱毒，輔助主藥增強(qiáng)清利濕熱、祛邪排毒之功；排錢草作為幫藥及引藥，具有清熱通利水道。諸藥相合，具有攻毒補(bǔ)虛，疏通三道，調(diào)暢兩路，調(diào)和陰陽(yáng)之效。

外泌體（exosome）是體內(nèi)細(xì)胞在多泡小體（MVBs）與細(xì)胞質(zhì)膜融合時(shí)釋放的胞外囊泡，內(nèi)含多種蛋白質(zhì)、mRNA 和miRNA，能夠保護(hù)miRNA 免受核酸酶的降解［8］，因此外泌體內(nèi)的miRNA能反映其來(lái)源細(xì)胞的功能、狀態(tài)，具有作為生物標(biāo)志物的價(jià)值。miR-122 是肝臟中一種特異的miRNA，約占成年人肝臟中總miRNAs的70%，對(duì)于維持肝臟的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［1］。相關(guān)研究顯示，在人體感染HBV后，肝臟中miR-122的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且miR-122的水平與肝內(nèi)HBV-DNA 載量和肝壞死性炎癥呈負(fù)相關(guān)［9］。進(jìn)一步研究證實(shí)［10］，HBV mRNA 含有一個(gè)與miR-122互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，兩者結(jié)合后導(dǎo)致miR-122失活，因此，HBV感染者肝臟的miR-122呈低表達(dá)水平。

本研究結(jié)果顯示，治療12、24、48 周時(shí)，觀察組血漿中miR-122 相對(duì)表達(dá)量均高于治療前。治療12、24、48 周時(shí)，兩組血清中HBV-DNA 水平逐漸下降；觀察組在治療12、24周時(shí)HBV-DNA水平低于對(duì)照組；治療48周時(shí)，兩組HBV-DNA水平相當(dāng)。可以看出，miR-122 的表達(dá)水平增高可以抑制HBVDNA 的復(fù)制，即miR-122 的水平與HBV-DNA 載量呈負(fù)相關(guān)。另外，治療12、24、48周時(shí)，觀察組HBeAg滴度顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明白花香蓮解毒顆粒能夠有效地抑制HBeAg 的分泌，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miR-122與HBeAg的表達(dá)可能呈負(fù)相關(guān)，這與朱蕾等［11］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，miR-122 的表達(dá)水平影響著HBV 的復(fù)制過(guò)程，預(yù)示著可以通過(guò)提高其表達(dá)水平來(lái)抑制HBV 的復(fù)制。壯藥白花香蓮解毒顆粒能明顯提高miR-122 的表達(dá)水平，能夠有效地抑制HBV-DNA的復(fù)制及HBeAg 的分泌，同時(shí)改善肝功能，因此，我們推測(cè)，其療效機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血漿外泌體miR-122的表達(dá)有關(guān)。