外源赤霉素和吲哚乙酸對老芒麥生長、生理特性及染色體端粒的調控

賈燕偉， 祁 娟， 賽寧剛， 獨雙雙， 路 欣， 李 霞

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

中圖分類號：S482.8+91；Q945.3文獻標識碼：A

文章編號：1007-0435(2023)02-0456-08

Regulation of Exogenous GA3and IAA on Growth,Physiological Properties and Chromosomal Telomeres ofElymussibiricus

JIA Yan-wei, QI Juan*, SAI Ning-gang, DU Shuang-shuang, LU Xin, LI Xia

(College of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University;Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education; Gansu Grassland Engineering Laboratory;China-US Center for Grazing Land Ecosystem Sustainability, Lanzhou, Gansu Province 730070, China)

Abstract:The effects of different concentrations (30,75 and 150 mg·L-1) of gibberellin (GA3) and indole acetic acid (IAA) on the growth and development ofElymussibiricusseedlings were investigated by measuring the morphological and physiological properties,and telomerase activity of the seedlings,with a view to providing a theoretical basis for promoting the growth and development ofE.sibiricus,increasing the yield and even preventing premature failure. TheE.sibiricus‘Chuancao No.2’ was used as the experimental material by using the sand culture method. The results showed that the treatments increased plant height,leaf length,leaf area and above-ground biomass,and 150 mg·L-1of GA3and 30 mg·L-1of IAA treatments were beneficial to plant growth and biomass accumulation ofE.sibiricus. The GA3treatments reduced chlorophyll content on days 10 to 15 and malondialdehyde (MDA) content on day 15,and significantly increased superoxide dismutase (SOD) activity on days 0 to 5,peroxidase (POD) activity on days 0 to 15,catalase (CAT) activity on day 10 and telomerase activity on day 15. The IAA treatments significantly increased the soluble protein content on days 10 to 15,SOD activity on days 0 to 5 and POD activity on days 0 to 15. According to comprehensive evaluation of principal components,the effect of 150 mg·L-1GA3treatment was superior to other treatments.

Keywords:Elymussibiricus;Exogenous hormone;Growth and development;Morphological characteristics;Physiological properties;Telomerase activity

老芒麥(Elymussibiricus)是禾本科(Poaceae)多年生牧草，在我國主要分布在西北、華北、東北等地，它作為青藏高原高寒地區重要的飼草之一，對我國畜牧業的發展起著不可忽視的作用[1]，同時，它在高寒草甸草原上能夠形成優勢種和建群種，對維持草原生態系統的穩定具有重要作用[2]。但老芒麥播種當年基本不能完成生育期，收益較低，且其人工草地可利用年限較短，在2～4年內產量較高，以后逐年下降[2]。老芒麥在天然草地群落中相對生物量、相對多度和相對蓋度亦隨著利用年限增加而顯著降低[3]。

植物激素對植物生長發育起著重要調控作用，通過整合體內外各種信號以不斷調控植物的生長發育，從而應對非生物和生物脅迫。通過噴施外源激素可以誘導內源激素(如赤霉素、生長素、脫落酸等)的變化，進而對植物激素信號轉導系統產生作用[4]。激素的功能特異性，取決于物種、組織、激素濃度、發育階段以及植物生長條件等諸多因素[5]，它對植物生長發育的調控，與其生長生理狀態以及激素濃度都有著密不可分的關系[6]。外源植物激素，尤其吲哚乙酸(Indole acetic acid，IAA)和赤霉素(Gibberellin，GA3)已在眾多農作物上得到廣泛應用，并取得了顯著的經濟和社會效益。研究發現，GA3對水稻(Oryzasativa)種子的萌發具有顯著的促進作用[7]，外源激素IAA，GA3調控小麥(Triticumaestivum)分蘗芽生長的最適濃度為60 mg·L-1[8]，噴施GA3或IAA，可有效增加食用型甘薯(Dioscoreaesculenta)淀粉或可溶性糖含量[9]。目前，外源激素在羊草(Leymuschinensis)、草地早熟禾(Poapratensis)及豆科牧草上被廣泛利用，外源激素對羊草的生長發育、開花習性及結實等特征有著重要影響[10-11]，能夠提高草地早熟禾抗白粉病能力[12]，增強苜蓿(Medicago)根系抗氧化活性等[13]。

為了探究外源激素對老芒麥生長發育的影響，本研究團隊通過利用其與氮、磷素配施研究發現，外源激素能顯著促進老芒麥生長及營養物質的吸收[14-15]，但有關外源激素對老芒麥生長形態、生理特性及染色體端粒方面探究較少。為此，本研究以‘川草2號’老芒麥為研究對象，通過研究噴施不同濃度外源GA3和IAA對老芒麥地上形態、生理特性以及染色體端粒酶活性的影響，以期為提高其產量及延長老芒麥人工草地的利用年限奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗材料為‘川草2號’老芒麥，其種子由四川草業科學研究院提供。本試驗于2022年4月下旬在甘肅農業大學草業學院實驗室進行。挑選均勻飽滿、健康的‘川草2號’老芒麥種子，用75%酒精消毒10 min，再用蒸餾水沖洗三遍，晾干備用。采用砂培法進行幼苗栽培，選取上口徑10 cm、下口徑7 cm、高16 cm的塑料杯作為砂培容器，將細沙和蛭石高溫滅菌后，按細沙∶蛭石=3∶1的體積比混合，盛裝至塑料杯4/5處，蒸餾水澆透后，均勻撒播老芒麥種子，每杯50粒，覆上一層細沙和蛭石，蓋住種子。將所有塑料杯放置培養室(溫度25℃±1℃，光照12 h，黑暗12 h)培育，每天固定時間澆灌等量蒸餾水。待幼苗長至2～3 cm時進行間苗至30株·杯-1，并開始澆灌Hoagland營養液，每天補充損失的水分，每5天更換一次營養液，更換營養液前用蒸餾水沖洗杯內沙子和蛭石，重復3遍，防止鹽分積累。

試驗設置GA3和IAA兩種生長類激素的添加，分別設置3個濃度梯度(30，75和150 mg·L-1)，記為GA330，GA375，GA3150和IAA 30，IAA 75，IAA 150。待老芒麥長至三葉期時，于每天下午17:00進行葉面噴施外源激素，以噴施蒸餾水為對照，噴施量以成滴為準，隔天處理一次，共處理4次，分別在全部處理結束后的第0，5，10和15 天取樣，每處理3次重復，用以測定生理指標和端粒酶活性，取樣后立即放入液氮中，取出后保存至—80℃超低溫冰箱備用。在第15 d進行地上形態特征的測定。

1.2 測定指標與方法

1.2.1形態指標的測定 株高(cm)：每個處理隨機取10株，用卷尺測量莖基部至最高處的垂直距離，即絕對高度，分別求其平均值[15]。

莖粗(cm)：每個處理隨機取10株，用游標卡尺測量基部莖的直徑，分別求其平均值[16]。

葉長(cm)：每個處理隨機取10株，用卷尺測量倒二葉(從根莖基部數起倒數第2葉)基部到葉尖的長度[15]。

葉寬(cm)：每個處理隨機取10株，用游標卡尺測量倒二葉(從根莖基部數起倒數第2葉)中間最寬處寬度[15]。

葉面積(cm2)：葉長×葉寬×0.75[15]。

地上生物量(g)：齊莖基部刈割后稱其鮮重，3次重復，取其平均值[16]。

1.2.2生理指標的測定 采用分光光度法測定葉綠素含量[17]，考馬斯亮藍G-250法測定葉片可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量[17]，氮藍四唑比色法測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性[17]，愈創木酚比色法測定過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性[17]，紫外吸收法測定過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性[18]，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量[17]。

1.2.3端粒酶活性的測定 稱取鮮樣各0.5 g，放入預冷的研缽中，用液氮研磨成粉末，倒入5 mL離心管，再加入4.5 mL 0.01 mol·L-1的PBS勻漿液，10 000 r·min-1高速冷凍離心20 min，上清液即為酶液。采用植物端粒酶ELISA檢測試劑盒測定樣品端粒酶活性，購于上海嵐派生物科技有限公司。

1.3 數據分析

使用SPSS 26 軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA，LSD)、Duncan氏多重比較檢驗及主成分分析，采用Microsoft Excel 2019進行處理數據和繪圖，所有數據均以3個重復的平均值±標準誤(SE)表示。

2 結果與分析

2.1 外源激素GA3和IAA對生長特性的影響

由表1可知，不同濃度GA3處理后株高較CK顯著提高了73.51%，82.12%和89.98%(P<0.05)，而IAA處理后提高25.10%，2.72%和11.58%；30 和150 mg·L-1IAA處理顯著增加了老芒麥莖粗，但30 和75 mg·L-1GA3的噴施顯著降低了幼苗莖粗；兩種激素處理后，葉長較CK均顯著提高，GA3處理效果較顯著，分別較對照顯著提高了61.23%，73.23%和76.15%(P<0.05)，但GA3顯著抑制了葉寬的增長，而30 和75 mg·L-1IAA處理后，葉寬顯著提高，分別較CK提高了11.76%和8.82%；外源GA3和IAA處理均明顯促進了葉面積的增加，其中150 mg·L-1GA3和30 mg·L-1IAA處理后，葉面積分別較CK提高71.03%和52.05%；75，150 mg·L-1GA3和30 mg·L-1IAA處理后其地上生物量較CK增幅明顯，分別顯著提高了30.11%，27.13%和24.29%。

表1 外源GA3和IAA對老芒麥生長特性的影響Table 1 Effect of exogenous GA3 and IAA on the growth characteristics of E. sibiricus

2.2 外源激素GA3和IAA對葉片生理特性的影響

2.2.1外源GA3和IAA對葉片葉綠素和可溶性蛋白含量的影響 由圖1A可得，不同GA3處理后第15 d葉綠素含量分別較CK顯著降低28.85%，25.36%和26.36%(P<0.05)；30 mg·L-1IAA處理后第0 d葉綠素含量顯著降低，降幅為17.44%，75 mg·L-1IAA處理后10～15 d的葉綠素含量均顯著降低，降幅分別為15.92%和12.69%，150 mg·L-1IAA處理后葉綠素含量相對穩定。

不同濃度IAA處理均顯著提高了10～15 d的可溶性蛋白含量，第10 d的增幅分別為58.05%，79.46%和27.06%，第15 d的增幅分別為10.93%，7.53%和52.25%。GA3處理效果不明顯，僅150 mg·L-1GA3處理在第0 d顯著提高了可溶性蛋白含量(圖1B)。

圖1 不同濃度GA3和IAA對老芒麥葉片葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of GA3 and IAA on chlorophyll and soluble protein content of E. sibiricus leaves注：各處理間不同小寫字母表示在相同生長天數不同濃度激素處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters among treatments indicate significant differences among treatments with different concentrations of hormones on the same growth days at the 0.05 level,the same as below

2.2.2外源GA3和IAA對葉片丙二醛和抗氧化酶活性的影響 圖2A顯示，葉片在生長發育過程中，MDA含量會逐漸增加。外源GA3和IAA處理能夠對葉片體內MDA含量產生顯著影響。在處理后第15 d，除150 mg·L-1IAA外，其它處理MDA含量較CK均顯著降低，其中75和150 mg·L-1GA3處理降幅最大，分別較對照降低了30.43%和34.78%。

由圖2B可得，GA3處理顯著提高了0～5 d的SOD活性，第0 d各處理增幅達到最大，分別為103.03%，77.97%和68.01%。IAA各處理亦顯著提高了第0 d的SOD活性，分別較CK提高61.13%，67.28%和40.13%，同時，75 mg·L-1IAA顯著提高了5～10 d的SOD活性。

由圖2C可知，外源GA3的添加顯著提高了葉片0～15 d的POD活性，且隨生長天數增加呈先降低后升高趨勢；30，75和150 mg·L-1GA3處理后第15 d，POD活性較CK顯著提高了205.90%，105.82%和169.50%。30和150 mg·L-1IAA顯著提高了第0，10和15 d的POD活性，75 mg·L-1IAA均顯著提高0～15 d的POD活性；IAA處理后第15 d效果明顯，POD活性分別較CK提高93.82%、87.69%和120.39%。

圖2D表明，除150 mg·L-1IAA外，葉片內CAT活性隨生長天數增加呈先降低再升高后又降低的趨勢，在第10 d CAT活性達到最高。30，75，150 mg·L-1GA3和150 mg·L-1的IAA處理后第10 d，CAT活性分別較CK顯著提高了64.93%，107.73%，143.05%和96.24%。

2.3 外源激素GA3和IAA對葉片端粒酶活性的影響

由圖3可知，CK葉片中端粒酶活性隨生長天數的增加而逐漸降低，第0 d端粒酶活性最高，為14.92 IU·L-1，第15 d端粒酶活性較第0 d降低18.42%。外源GA3和IAA的噴施對老芒麥葉片端粒酶活性具有較大影響。30，75和150 mg·L-1的GA3以及30，75 mg·L-1的IAA處理均顯著提高了葉片第15 d的端粒酶活性，分別為12.83，13.62，13.27，14.09和12.85 IU·L-1，較CK提高5.42%，11.91%，9.04%，15.78%和5.59%。

2.4 主成分分析及綜合評價[19]

將累計貢獻率大于80%且方差特征值大于1的作為主成分，共提取了3個主成分(表2)，其特征值分別為7.306，2.717和2.111，貢獻率分別為56.200%，20.902%和16.241%，3個主成分的累計貢獻率達到93.343%，具有一定代表性。

第1主成分貢獻率較大的是葉長、株高、MDA、葉綠體、地上生物量、葉面積、葉寬、POD和端粒酶活性，其中MDA、葉綠素和葉寬起反向作用，反映了老芒麥生長發育過程中地上部形態特征、膜保護物質的含量、葉綠素含量、抗氧化酶活性以及端粒酶活性的變化；第2主成分貢獻率較大的是SOD和莖粗，即為抗氧化酶和地上形態特征；第3主成分上可溶性蛋白和CAT的貢獻率較大，主要反映了老芒麥幼苗在生長發育過程中滲透調節能力和細胞內抗氧化酶活性的大小。綜合3個主成分分析結果，地上部形態特征、生理特性以及端粒酶活性，均可作為評價各處理下老芒麥生長發育狀況的綜合指標。

圖2 不同濃度GA3和IAA對老芒麥葉片丙二醛和抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of GA3 and IAA on malondialdehyde and antioxidant enzyme activities of E. sibiricus leaves

圖3 外源GA3和IAA對老芒麥葉片端粒酶活性的影響Fig.3 Effect of exogenous GA3 and IAA on telomerase activity of E. sibiricus leaves

根據不同處理下各主成分因子得分計算出綜合得分，再依據綜合得分情況對各處理進行排序(表3)。排名前三的處理分別為150 mg·L-1GA3，75 mg·L-1GA3和30 mg·L-1GA3，其中150 mg·L-1GA3綜合得分2.045，CK排名最后，表明外源噴施GA3和IAA對老芒麥地上部生長均有促進作用，其中噴施濃度為150 mg·L-1的GA3效果最佳。

表2 各指標主成分方差貢獻率及載荷矩陣Table 2 Principal component variance contribution and loading matrix for each indicator

表3 各指標主成分因子得分及排序Table 3 Principal component factor scores and sorting for each indicator

3 討論

3.1 外源激素GA3和IAA對老芒麥地上生長特性的影響

植物激素如赤霉素或生長素等在調節植物生長發育的各種過程以及脅迫反應中發揮著關鍵作用。外源植物激素主要通過影響植物內源激素的平衡，從而引起植株生長和生理代謝活動的變化[20]。研究表明一定濃度范圍內的外源生長素、赤霉素和細胞分裂素對于草種的發芽及幼苗的生長均具有促進作用[21-22]，通過比較不同濃度外源激素對農藝性狀及生理特性的影響可篩選出有利于植物生長發育最適宜的激素噴施濃度。研究表明，濃度為30 mg·L-1的GA3可提高谷子(Setariaitalica)的株高、葉面積、葉片數[23]，而0～40 mg·L-1GA3對無芒雀麥(Bromusinermis)農藝性狀無明顯促進作用，但10 mg·L-1對其種子產量具有顯著調控效果[24]。150 μg·g-1IAA是‘壩莜3號’種子萌發和幼苗生長的最適濃度[25]，30 mg·L-1IAA處理對老芒麥根系的直徑和根表面積有明顯促進作用[26]。本研究表明，較高濃度的GA3(150 mg·L-1)和較低濃度IAA(30 mg·L-1)有利于老芒麥植株生長和生物量的積累。這說明不同植物對不同外源激素的敏感度有很大的差異[27]。

3.2 外源激素GA3和IAA對老芒麥葉片生理特性的影響

3.3 外源激素GA3和IAA對老芒麥葉片端粒酶活性的影響

端粒酶在植物生長發育、細胞增殖、DNA修復以及細胞凋亡過程中扮演著重要角色，植物的整個器官和組織在生長發育過程中，端粒酶的激活具有相當大的變化，特別是在具有長生命周期的物種中[32]，即端粒酶活性與細胞活動相關[33]。研究指出，分化能力強的細胞和組織器官內端粒酶活性較高[34]。本研究結果表明，除150 mg·L-1的IAA處理外，其它處理均顯著提高了第15 d的端粒酶活性，75 mg·L-1GA3和30 mg·L-1IAA處理的端粒酶活性增幅較大，說明該濃度外源GA3和IAA處理可以在老芒麥生長發育到一定階段提高其葉片內端粒酶活性，從而維持端粒穩定性，甚至延緩葉片早衰。有研究發現：銀杏(Ginkgobiloba)只在生長的早期階段表現出高的端粒酶活性，而在它的生命周期結束時，端粒酶是檢測不到的[35]，這反映出端粒酶的活性可能取決于葉片的生長狀態。另外，本研究發現正常的生長條件下，噴水處理10 d后，在MDA含量升高的情況下，端粒酶活性降低，依照上述理論，可能是葉片趨向衰老，端粒發生縮短，端粒酶活性必然減弱。一定濃度IAA和GA3處理后，可提高端粒酶活性，而MDA含量相應降低，前人研究表明，細胞端粒酶活性的提高，可能是老芒麥在正常生命周期的代謝過程中伴隨的ROS發揮第二信使作用，通過調控細胞生長等使植物體內各項活動維持穩定，端粒酶同時被激活，使染色體端粒長度處于動態平衡狀態[36]；也可能部分ROS對端粒DNA造成損傷，而端粒酶被激活對其進行損傷修復[37]。

4 結論

噴施一定濃度的外源GA3和IAA，能有效促進老芒麥株高、葉長、葉面積及地上生物量的積累，并在一定發育階段提高了葉片內可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性以及端粒酶活性，減弱了膜脂過氧化作用，保證葉片各種代謝活動正常運行。綜合外源激素對老芒麥地上形態特征、生理特性和染色體端粒酶活性影響得出，噴施150 mg·L-1的GA3效果較佳。