潛伏相關核抗原在卡波氏肉瘤相關皰疹病毒感染過程中的作用

路正東,晏巍振 綜述 王林定,周 暢 審校

卡波氏肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV),又稱為人類皰疹病毒8型,是一種雙鏈DNA病毒,常導致感染者出現內皮細胞腫瘤,即卡波氏肉瘤(Kaposis sarcoma,KS )。臨床上常表現為皮膚多發性斑點狀或斑塊狀等內皮細胞侵襲性表現[1]。KSHV在宿主體內常處于潛伏和裂解兩種狀態,潛伏相關核抗原(latency-associated nuclear antigen,LANA)是維持其潛伏期的關鍵蛋白,也是潛伏期含量最高的蛋白。潛伏期間的KSHV可在LANA的介導下,將基因組連接到宿主染色體上,從而使病毒基因組和宿主細胞同步復制[2]。目前,臨床上常在裂解期進行治療,主要原因是KSHV在潛伏期對抗病毒藥物具有很強的耐藥性和逃避宿主免疫殺傷的能力,而裂解期的治療效果則相對欠佳,故LANA可作為未來的研究重點。該文就LANA蛋白的作用機制和研究進展進行綜述。

1 概述

1.1 KSHVKSHV是一種致癌病毒,可導致KS等多種惡性腫瘤。KSHV基因組包含一個大約140 kb長的中央獨特編碼區和兩側高GC含量的非編碼末端重復序列(terminal repeat units,TR)[3],主要負責病毒蛋白表達。潛伏感染期間,病毒基因組在宿主細胞核中轉換為一個環狀集合體,使病毒的轉錄翻譯能力高度受限,無法僅靠自身完成病毒的復制,必須通過和宿主細胞的基因結合才能產生下一代病毒。該機制使得病毒在宿主體內維持一個非常低的水平,難以激活宿主的免疫反應,保證了病毒基因組的長久存在。

1.2 KSKS是一種高度血管化及增生性的內皮細胞源性腫瘤,來源于淋巴內皮細胞,以炎癥和廣泛的新血管生成為特征,具有特殊的雙階段生命周期[4]。感染早期,常常出現充分延長的梭形細胞大量增殖的特征性表現,隨著感染的加劇,梭形細胞數量增加,最終在晚期占主導地位,在血管縫周圍形成交織束,產生肉眼可見的結節。臨床表現為免疫逃避、炎癥和血管生成的混合癥狀。

1.3 LANA基因和蛋白LANA是一種含有1 162個氨基酸,220～230 kDa大小的多功能蛋白質,分為N端、C端和中央天冬氨酸/谷氨酸的重復序列[5]。C端結構域直接與KSHV基因組的保守TR序列結合。富含賴氨酸的N端中的染色質結合結構域(chromatin-binding domain, CBD)與宿主染色體對接,從而使KSHV基因組和宿主染色體形成一個整體結構。當宿主細胞進行有絲分裂時,連接在宿主染色體上的KSHV基因組同步進行復制,使得KSHV基因組持續存在于宿主細胞中,這是LANA最具特征性的功能之一。除了介導自身復制外,LANA蛋白還可以與多種腫瘤抑制蛋白相結合,降低這些蛋白的抑癌作用[6]。此外,LANA也被認為與促進血管的生成及宿主免疫系統逃逸有關,能夠保證KSHV的持久存在。因此,在KSHV的潛伏期間,LANA作為一種高度表達且作用廣泛的致癌蛋白,在KSHV感染的發病機制中起著核心作用。

2 LANA的作用機制

2.1 介導自身復制KSHV潛伏期的特征是在高度有序的核遺傳物質結構中保證自身的存在,同時保持有限的病毒基因復制,不產生感染性子代。過去的研究[7]證明,LANA以宿主細胞中的組蛋白H2A和H2B (H2A/B)為連接點,將病毒片段連接到細胞染色體上,與宿主細胞DNA同時復制并分離病毒基因片段到新生成的宿主子細胞核中。除了連接作用,LANA蛋白還具有調節作用,促進病毒基因組的連接和復制,保證病毒的長期存活和基因的穩定復制。

2.1.1募集核小體組裝蛋白1 (nucleosome assembly protein 1,NAP1) NAP1L1是核小體組裝蛋白1的成員之一,由391個氨基酸蛋白組成,在轉錄和DNA復制中發揮了組蛋白結合和核小體組裝等多種作用。病毒基因在S期復制時,NAP1L1會與LANA蛋白中靠近CBD的氨基末端結合,結合有NAP1L1的LANA蛋白會募集于KSHV的TR區域并與其結合,從而發揮NAP1L1的復制與組裝作用[8]。在KSHV基因復制過程中,除了負責復制和組裝外,NAP1L1也可以使病毒基因染色質化,降低其活性,負調控病毒裂解基因的轉錄,減少級聯反應的發生,確保KSHV持續處于潛伏期狀態。在LANA蛋白的募集作用下,NAP1L1還可以抑制部分基因啟動子的轉錄,如RTA和K1基因,研究[9]表明NAP1L1與LANA一起表達時,RTA啟動子和K1啟動子的活性都有所下降,但詳細機制尚不明確,可能是由NAP1L1破壞協同激活子p300與其它組蛋白的復合物結構所導致。這些研究證明了LANA募集的NAP1L1在調節部分啟動子轉錄活性及自我復制的重要性。

2.1.2寡聚體結構的穩定結合性 相關成像顯示,在潛伏感染期間,LANA蛋白中與KSHV基因TR序列結合的部位,即LANA DNA結合域(DNA binding domain,DBD),會形成包括十聚體、五聚體和螺旋體等多種高階寡聚體結構[10]。在KSHV的復制過程中,LANA寡聚體結構與TR區緊密結合,隨后招募細胞復制起始因子到該區,如起源識別復合體,該因子對病毒DNA復制和片段維持具有重要作用。同時,寡聚體結構可以自動調節ORF73基因的轉錄,在KSHV基因組的TR序列和ORF73序列之間存在一個使用染色質構象捕獲(chromatin conformation capture,3C)的DNA環,該環結構可以有效維持病毒的潛伏期,而寡聚體結構可以促進該DNA環的形成。若LANA DBD未形成寡聚體結構,LANA與TR結合的穩定性下降,病毒基因組易發生重排,DNA組易丟失,無法在宿主體細胞中完成正常復制。此外,3C DNA環也可能丟失,從而使病毒脫離潛伏期進入活躍期,無法建立持久的潛伏感染。LANA DBD寡聚結構的復雜性也會影響KSHV的復制能力,簡單的寡聚體結構可以有效驅動病毒DNA的有效連接和類宿主染色質化,從而達到感染期間的持續潛伏狀態。低寡聚體結構也可以促進核小體復合體的合成,通過克服LANA蛋白與核小體結合的能障[11],提供LANA蛋白結合于宿主DNA及合成核小體復合體的驅動力。

2.2 促血管產生促血管產生是KS腫瘤的一個重要標志,KS腫瘤的早期階段也存在高度血管化,即組織學變化表現為血管裂隙增生、紅細胞外滲和大量水腫。一般而言,血管產生是一種可暫時緩解病情的代償性表現,但在部分情況下,血管增生反而會進一步加重病情。KSHV感染過程中可誘導多種血管生成細胞因子,包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)、血管生成素-2等,以兩種不同的分泌方式誘導血管生成[12]。異常血管的產生有利于KSHV的轉移,進而加重病情,同時也會為腫瘤細胞提供營養物質,促進腫瘤細胞的增生和轉移。

2.2.1上調表皮生長因子樣結構域7(epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7) EGFL7是一種促血管生成細胞因子,也被稱為血管內皮抑制素,屬于VEGF家族。EGFL7在內皮性病變部位高度上調,常導致宿主出現病理性的血管生成和內皮細胞增殖。研究[13]表明,與正常人相比,KS腫瘤病人的EGFL7水平升高,且LANA的表達是導致該因子上調的主要原因。LANA對EGFL7表達的調控表現為隔離死亡域相關蛋白(death-associated protein,Daxx),降低Daxx與EGFL7的結合,從而減少Daxx對于EGFL7的抑制作用。Daxx是一種多功能蛋白,可與多種宿主細胞蛋白結合,參與調節轉錄和凋亡等多種細胞活動。Daxx通過與禽紅母細胞病病毒E26癌基因同源物1 (avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1,Ets-1)結合從而抑制Ets-1活性,Ets-1是正調控EGFL7表達所需的核心轉錄因子。而LANA Glu/ Asp結構域與Daxx結合后,具有對Daxx的隔離能力以及消除其對Ets-1的抑制作用的能力。Co-IP和免疫印跡實驗[14]表明,LANA與Daxx的結合破壞了Daxx與Ets-1之間的聯系,使EGFL7表達上調,促進血管的生成和內皮細胞的生長;除此之外,該實驗也證明當LANA蛋白過表達時,不僅隔離了過表達的內源性Daxx,還隔離外源性Daxx,這加大了相關臨床治療的難度。除了促血管生成作用,EGFL7還參與腫瘤的生長和轉移。臨床研究[15]表明,KSHV感染的原發性滲出性淋巴瘤細胞(BC3和BCBL1)的EGFL7蛋白上調,提示EGFL7可能在KSHV誘導的惡性腫瘤中起重要作用。

2.2.2上調缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1) HIF-1血管生成因子由組成型表達的β亞基和氧調節的α亞基組成,α亞基在正常氧張力下不穩定,但在低氧張力環境或一些激活的異常生長因子作用下穩定。KSHV感染后,LANA會使α亞基在宿主體內異常穩定表達,α亞基的兩個同源物HIF-1α和HIF-2α表達明顯上調,增加HIF-1的轉錄活性。在LANA的影響下,HIF因子與鄰近內皮細胞上的受體結合,上調VEGF等蛋白表達,促進新血管的生成及KS腫瘤的生長。LANA除了直接調節HIF-1外,也能調控丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM2)來間接調節HIF。PKM2作為HIF-1的輔助激活因子被轉運到細胞核中,促進HIF-1α的合成,其含量的增加保證了HIF-1對于新血管生成的高效調控。相關研究[16]表明,抑制KSHV細胞中PKM2會導致HIF-1所調控的基因表達減少;使用PKM2 siRNA抑制PKM2可以阻斷HIF -1依賴的VEGF啟動子的激活、表達和分泌。

2.3 延長KSHV生存時間

2.3.1酸性結構域讀取器抑制p53的作用 近期研究[17]表明,LANA包含兩個串聯的、部分重疊的酸性結構域序列,位于第332～465氨基酸,與SET易位蛋白(SE translocation,SET)癌蛋白酸性結構域序列同源。該結構域可以模擬SET結合的過程,優先與非乙酰化p53的羧基末端相互作用形成免疫共沉淀,抑制p53活性。同時,LANA還可能結合其它蛋白質來對病毒的持久性產生影響。例如,cAMP反應元件結合蛋白(CBP)可以和p53結合,使p53出現乙酰化,顯著降低LANA與p53的相互作用;LANA可以與CBP相互作用并抑制其乙酰化酶的活性,從而保證自身對于p53的抑制作用,防止宿主細胞被p53蛋白破壞,避免自身凋亡,延長了感染細胞與KSHV自身的生存時間。雖然LANA片段中的第845～895氨基酸中也存在較低的同源酸性序列,但病毒的持久潛伏狀態仍主要依賴于LANA第332～465片段中的酸性結構域讀取器[18]。如果缺少相關的酸性結構域讀取器,那病毒將無法保持持久的潛伏感染狀態。此外,LANA的富酸性結構域可以直接與Daxx相互作用,促進血管的生成,也可以為自身的長期存在提供有利的條件。

2.3.2LANA操縱G1-S進程 在細胞周期中,E2F基因的表達是細胞周期進入S期所必需的,對于維持正常的細胞穩態及復制具有重大意義。正常情況下,Cdk4/6-cyclin D和Cdk2-cyclin E在表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等多種細胞因子作用下激活,激活的復合物會磷酸化視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)家族蛋白,抑制其對于E2F轉錄因子的失活影響[19]。在感染細胞中,LANA與RB相互作用并增強對于E2F轉錄因子的失活作用,使細胞周期無法正常進入S期。LANA還可以與糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)相互作用,GSK-3β參與磷酸化和周期調節因子的降解,導致G1-S進程延長。在細胞周期中,毛細血管擴張性共濟失調(ataxia telangiectasia mutated,ATM)/毛細血管擴張性共濟失調相關(ataxia telangiectasia and related,ATR)蛋白和細胞周期檢測點激酶1(checkpoint kinase1,Chk1)/細胞周期檢測點激酶2(checkpoint kinase2,Chk2)可以調節細胞的自身凋亡,通過磷酸化p53蛋白來阻滯G1-S的進程。研究[20]表明,LANA可以直接與Chk2相互作用,阻斷ATM/ ATR介導的自身凋亡,延長G1-S進程。除了作用于Chk2,LANA蛋白也與ATM/ATR結合,降低其對murine double minute2 (Mdm2)因子的失活作用。此外,LANA也可以直接結合并阻斷p53介導的轉錄活性,進而抑制p53誘導的細胞凋亡,延長宿主細胞周期。LANA還可以正向調節細胞周期依賴啟動子,并通過維持周期蛋白依賴激酶抑制劑p16的過表達來誘導G1-S細胞周期的延長。在高LANA含量的細胞中,Chk1/Chk2蛋白明顯上調,p53蛋白活性降低,KSHV感染細胞存活率明顯上升。

2.3.3逃避宿主免疫監測 KSHV可以抑制多種免疫系統途經,躲避宿主免疫監測是重要的輔助發病模式之一,LANA可以促使CD8+T細胞產生干擾蛋白酶體來抑制主要組織相容性復合體Ⅰ類(major histocompatibility complex,MHC-I)的表達,也可以通過抑制CD4+T細胞來阻斷Ⅱ類反式激活蛋白(class Ⅱ transactivator,CIITA)轉錄和其與調節因子X(regulatory factor X,RFX)復合物相互作用,從而下調主要組織相容性復合體Ⅱ類(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)基因的反應[3]。LANA通過與KSHV的mRNA形成g-四鏈復合物則是上述免疫逃逸反應的主要影響因素。LANA在與自身mRNA結合形成四鏈復合物后,可以有效減少mRNA翻譯來抑制氨基酸抗原的合成,降低抗原的呈遞,以此來逃脫宿主的免疫系統。相關研究[21]顯示,當KSHV陽性細胞中g-四聯體結構穩定時,LANA的抗原提呈被下調。LANA還可以抑制會對g-四重體的合成起負向調節作用的異質核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs),以此來發揮免疫逃逸作用。hnRNPs是一種RNA結合蛋白家族,主要調節基因表達,包括mRNA剪接、維持mRNA的穩定轉運以及蛋白質翻譯的調節。hnRNPs可與g-四聯體選擇性結合,潛在破壞g-四重復合物,而LANA則可以顯著抑制上述的破壞作用[22]。潛伏期KSHV感染的宿主細胞中,LANA水平和hnRNP A1與LANA mRNA的相對結合量常呈反比關系。當LANA在細胞核中的濃度足夠高時,相對結合量則較低,以此確保hnRNP A1不會破壞g-四重體,抑制mRNA輸出到細胞質,使其無法翻譯,降低可用于抗原提呈的蛋白質水平。由于g-四環復合物在病毒生命周期中發揮了關鍵性作用,作為KSHV的藥物治療靶點具有重要意義。

3 展望

LANA具有介導自身復制、上調EGFL7促血管生成、逃避宿主免疫系統等多種功能。基于LANA能夠阻斷Daxx與Ets-1的相互作用、上調EGFL7和促進血管生成這一機制,采用人為調控EGFL7進行靶向治療或聯合治療,減少血管的生成,阻斷KSHV相關惡性腫瘤的發展。除此之外,LANA蛋白能夠直接結合并阻斷Chk1/Chk2蛋白的誘導凋亡、減少p53蛋白的磷酸化及抑制p53,從而逃避宿主免疫系統。以該機制為研究方向,可有效促進抗原的提呈,使KSHV及時被宿主免疫系統識別,阻滯KSHV的復制,提高機體的免疫能力。對LANA蛋白主導下的多種機制進行深入研究,可以為開發新型抗病毒藥物和早期抗感染藥物提供重要依據。