BMSCs通過調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制LPS誘導急性肺損傷小鼠炎癥反應

陳茂瓊,楊萌婷,蔡 姣,匡夢嵐,吳 莎,楊山福,張芷楠,楊小軍,樊永霞

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由各種原因導致的肺泡上皮及間質急性炎癥性肺損傷,臨床表現為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),可導致多器官功能障礙,發病率及病死率高,即使康復也面臨長期生活質量低下的風險[1]。盡管經過40余年的不斷研究,仍未找到有效的藥物治療方法。采用間充質干細胞(mesenchyml stem cells, MSCs)治療ALI 是目前研究的熱點[2]。MSCs 用于嚴重肢體缺血患者的一項臨床研究[3]顯示MSCs可明顯改善患者肺功能[4]。多項研究證明[2,5],MSCs治療ALI能減輕肺損傷嚴重程度,增強肺組織的修復能力,且安全,但具體機制仍不是十分明確。該文通過LPS誘導小鼠ALI模型,經同源BMSCs移植,探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑脂多糖LPS(美國Sigma,貨號:039M4004V),地塞米松磷酸鈉注射液(貴州天地藥業有限責任公司,貨號:H52020477),胎牛血清FBS(美國Gibco公司,貨號:10099141)和低糖培養基L-DMEM(美國Gibco公司,貨號:12100046);Eagle′s培養基(美國Gibco公司,貨號:11835030);ELISA試劑盒(美國NOVUS公司,貨號:101808,546999,);吉姆薩染色試劑盒、HE染色試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒(北京索萊寶生物公司,貨號:G1020,20200629, 20200817);Trizol(美國賽默飛公司,貨號:284912);RT-PCR試劑盒(日本寶日醫生物技術公司,貨號:RR820A);SDS-PAGE凝膠試劑盒(美國Bio-Rad公司,貨號:10074554485249);SDS-PAGE凝膠試劑盒(美國Bio-Rad公司,貨號:64341430),SDS-PAGE凝膠試劑盒(美國Bio-Rad公司,貨號:10074554485249);一抗TLR4、NF-κB、MyD88(美國CST公司,貨號:Q9QUK6,Q04206,Q99836);超敏化學發光液(美國Affinity公司,貨號:1824a01)。

1.2 動物SPF級KM(昆明種)小鼠,雌雄各半,4周齡,體質量(20±2)g,共32只,購自貴州醫科大學實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXY(黔)2018-0001),飼養條件:溫度(25±2)℃,濕度(50%～70%),自由獲取食物和水,于帶有12 h明/暗循環(7:00—19:00)的房間適應性喂養1周后開始造模。本實驗涉及的實驗動物經貴州醫科大學動物倫理委員會審查并批準,批準號:2101208。

1.3 儀器生物安全柜、CO2細胞恒溫培養箱、冰凍切片機、MultiSkan3酶標儀(美國Thermo Fisher),活細胞工作站(日本Olympus),流式細胞儀(FACSCantot Ⅱ),病理組織切片掃描儀(日本Nano Zoomer),全自動血液分析儀(深圳邁瑞),渦旋振蕩器(無錫杰瑞安儀器設備有限公司SCILOGEX);電泳儀、凝膠成像儀、RT-PCR儀(美國伯樂);光學顯微鏡(日本Nikon);超低溫高速離心機(德國Eppendorf);超純水儀(美國Millipore);肺功能檢測儀;恒溫烘箱(上海善志儀器設備有限公司);電子天平(天津德安特公司)。

1.4 方法

1.4.1BMSCs分離、提取、培養及鑒定 取2只4周齡成年雄性KM小鼠,無菌條件下頸椎脫臼法處死后取雙側股骨,制備BMSCs。密度梯度離心分離有核細胞,貼壁法培養小鼠骨髓中MSCs,將原代細胞接種于75 cm2的培養瓶,經10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素(100 IU/ml) 的低度Dulbecco′s改良Eagle′s培養基培養細胞。3 d后第1次換液,待細胞生長融合至80%～90%,用0.25% EDTA胰蛋白酶消化,進行第1次細胞傳代,培養至第4代后經流式細胞儀檢測細胞膜表面分子(CD105、 CD90、CD45、CD34)的水平。經胰酶消化、離心、生理鹽水洗滌2遍,重懸成細胞懸液備用。本實驗采用狀態較好的第4代細胞,待其在7 500 mm2培養瓶中融合至約70%,去掉培養上清液,用生理鹽水清洗2遍,按濃度為 1010pfu/L的綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein,GFP) 標記的腺病毒液,在7 500 mm2培養瓶中加入0.1 ml,37 ℃ 孵育 1.5～2 h后更換為完全培養基繼續培養48 h,熒光顯微鏡下觀察GFP發光情況。胰酶消化、離心,PBS液重懸成細胞懸液備用。

1.4.2模型制備、分組及治療 將體質量 (20±2) g KM小鼠適應性喂養1周后,使用隨機數字表法將小鼠分為4組,每組8只,即對照組(Control)、模型組(LPS)、地塞米松治療組(LPS+DEX)、BMSCs移植組(LPS+BMSCs)。1%戊巴比妥鈉(10 ml/kg)腹腔注射,待麻醉生效,仰臥位固定四肢,酒精消毒后切開頸部皮膚并分離皮下各層組織,暴露氣管,經氣管緩慢推注LPS(5 mg/kg),觀察小鼠是否出現呼吸急促、躁動等,判斷藥物彌散進入肺組織。隨后逐層縫合切口放回鼠籠,待小鼠恢復活力后方可離開。對照組以類似方法暴露氣管,注射相同劑量生理鹽水。造模24 h后,尾靜脈一次性注射移植GFP標記的BMSCs細胞懸液,劑量1×108個/kg;DEX治療組,尾靜脈注射DEX 3 mg/kg,每日1次,連續3 d;對照組和模型組尾靜脈注射相應體積生理鹽水,每日1次,連續3 d。

1.4.3動物樣本收集 治療完畢24 h,統計小鼠存活數目。存活小鼠行1%戊巴比妥鈉(10 ml/kg)腹腔注射麻醉,摘眼球收集血液,室溫靜置30 min,1 000 r/min離心15 min,收集血清于-80 ℃冰箱保存,用于ELISA檢測;采血完畢后,切開皮膚以暴露氣管,通過氣管套管將預冷的0.3 ml PBS注入肺中,并用注射器輕輕推注、反復灌洗,每次間隔1 min,回收3次吸出液體以獲得支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。未經肺泡灌洗的各組小鼠剪開胸部,取出肺組織進行肺W/D重量比及病理學檢查,其中部分肺組織凍存于液氮中,后續用于基因和蛋白組學檢測;部分則放入4%多聚甲醛液固定,用于病理學檢查。

1.4.4指標檢測

1.4.4.1小鼠肺功能檢測 細胞移植后第4天,分別檢測小鼠肺功能。戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,待其達深度麻醉、自主呼吸消失,氣管插管并連接FlexiVent肺功能檢測儀,在含氧21%、呼吸頻率150次/min、潮氣量10 ml、呼吸末壓力達0.2 kPa狀態下進行機械通氣,待呼吸平穩后,霧化吸入乙酰甲膽堿 (methacholine, Mach) 進行支氣管激發試驗。Mach濃度依次遞增:0、1.5、3、6、12、25、50和100 g/L,間隔時間為2 min,霧化時間20 s,以誘發小鼠支氣管平滑肌痙攣。同時檢測:氣道阻力 (airway resistance, ARs)、氣道彈性阻力 (airway elastic resistance, AERs)、動態順應性 (dynamic compliance,DC)、主氣道阻力(main airway resistance, MARs)。

1.4.4.2肺W/D重量比的計算 取各組小鼠左肺上葉,PBS洗凈表面血跡并用吸水紙蘸干多余液體,電子天平稱量濕重W。置于60 ℃的烘箱中烘烤脫水48 h至恒重,稱量記錄干重D,通過計算肺W/D重量比評估肺組織水腫程度。

1.4.4.3瑞氏-吉姆薩染色法檢測小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎性細胞的表達并計數 取BALF離心(3 000 r/min,5 min)棄上清液,PBS重懸細胞,取0.2 ml細胞懸液進行炎性細胞分類計數,另取0.2 ml懸液甩片,固定后用瑞氏-姬姆薩染液染色5 min,光學顯微鏡下觀察并計數炎性細胞。

1.4.4.4病灶冰凍切片追蹤肺組織中標記的BMSCs 取肺標本放置于托盤上,用鑷子輕輕撥動組織使其盡量平整鋪展,于整個組織塊表面加入包埋劑,并置于冷凍速凍臺面上(冷凍溫度為-20 ℃)使其凝固,待凝固后轉移至切片載物架上,設置切片厚度為8 μm,置于活細胞工作站顯微鏡下觀察并拍照統計肺組織中GFP陽性細胞的數量。

1.4.4.5肺組織病理學檢測 取經過4%多聚甲醛固定的肺組織,脫水、包埋、切片機切片,脫蠟后行HE染色,光學顯微鏡觀察評估肺組織病理學變化并評估肺損傷程度,采用0～3分評分系統(0:正常;1:輕度;2:中度;3:重度),對肺泡壁厚度、炎性細胞浸潤、出血三項進行盲法評估。

1.4.4.6RT-PCR檢測肺組織TLR4、MyD88、NF-κBmRNA表達 TRIzol法提取液氮儲存的肺組織的總RNA并檢測濃度,逆轉錄cDNA后進行擴增反應,根據NCBI基因庫數據,設計小鼠TLR4,MyD88和NF-κB引物(引物由生工生物工程上海股份有限公司合成),進行PCR擴增,并以GAPDH為內參,以2-ΔΔCt值計算各基因mRNA相對表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.4.7酶聯免疫吸附法(ELISA)測定分析 取 -80 ℃冰箱凍存的小鼠血清,根據ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的吸光度值并計算出各炎癥細胞因子的表達水平。

1.4.4.8蛋白免疫印跡法(Westren blot)檢測TLR4-MyD88-NFκB通路相關蛋白表達 取液氮儲存的肺組織提取蛋白,BCA法測濃度后加熱。10% SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉90 min,相應一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h,用發光液顯影并分析。

2 結果

2.1 BMSCs提取及鑒定接種3 d可見培養瓶底散在出現部分貼壁細胞;接種7 d細胞數量明顯增多,且逐漸融合,接種10～14 d,細胞呈長梭形或多角形、旋渦狀或流水樣分布。第1代傳第2代,3～5 d即可融合至70%～80%,繼續往下傳代。第4代細胞經過流式細胞儀檢測,結果顯示:CD105+、 CD90+、CD45-、CD34-,符合MSCs的生物學特征。見圖1。

圖1 光鏡下培養至第4代的小鼠BMSCs ×200

2.2 BMSCs對ALI小鼠生存率的影響從造模開始到治療結束Control組、LPS+DEX組、LPS+BMSCs組無小鼠死亡,LPS組小鼠死亡2只,死亡率為25%,存活小鼠只數≥6只;LPS+DEX組、LPS+BMSCs組無小鼠死亡,提示BMSCs可降低LPS誘導ALI小鼠的死亡。

2.3 FlexiVent肺功能檢測結果LPS誘導ALI小鼠肺功能:MARs、ARs、AERs增加,DC降低,P<0.05。LPS+DEX組、LPS+BMSCs組經過治療后,MARs、ARs、AERs增加減緩,DC增加接近對照組。見圖2。

2.4 BMSCs對ALI小鼠肺組織W/D重量比及肺組織病理學的影響與對照組相比,LPS組小鼠肺W/D重量比明顯增高(P<0.01);與LPS組相比,LPS+DEX組、LPS+BMSCs組W/D重量比值下降(P<0.05)。HE染色顯示對照組肺組織未見肺泡壁結構改變及炎性細胞浸潤;與對照組相比,LPS組小鼠肺臟水腫、淤血明顯,肺間質炎性細胞增多、聚集(紅色方框處),肺泡壁增厚,肺泡水腫、壞死、毛細血管出血(綠色方框處),組織學評分升高(P<0.01),表明造模成功;與LPS組相比,LPS+DEX組、LPS+BMSCs組小鼠肺水腫、充血程度減輕,炎性細胞浸潤減少,組織學評分降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 BMSCs對LPS誘導ALI小鼠肺組織病理學、肺W/D重量比及肺損傷的影響

2.5 BMSCs對小鼠BALF中炎性細胞分類及計數的影響對照組僅有少量炎性細胞;與對照組相比,LPS組白細胞、中性粒細胞、單核細胞等明顯增加(均P<0.01);與LPS組相比,LPS+DEX組、LPS+BMSCs組白細胞、中性粒細胞及單核細胞數量均減少(均P<0.05)。見圖4。

圖4 BMSCs對LPS誘導ALI小鼠BALF中炎性細胞的影響 ×50

2.6 冰凍切片追蹤BMSCs在肺組織的定植熒光顯微鏡下可見BMSCs定植于肺部毛細支氣管周圍,在GFP下見綠色熒光,在Merge下見藍色熒光,如圖5紅色箭頭所指。

圖5 BMSCs在肺組織的定植 HE×100

2.7 BMSCs對ALI小鼠肺組織中TLR4、MyD88和NF-κBmRNA表達的影響與對照組相比,RT-PCR檢測結果示LPS組的肺組織中TLR4,MyD88和NF-κB的mRNA表達明顯升高(P<0.01)。與LPS組相比,LPS+BMSCs組、LPS+DEX組的肺組織中TLR4,MyD88和NF-κB的mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見圖6。

圖6 BMSCs對LPS誘導ALI小鼠肺組織TLR4、MyD88和

2.8 BMSCs對ALI小鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α,水平的影響與對照組相比,LPS組小鼠血清中IL-1β、IL-6和 TNF-α水平上升(均P<0.01);與LPS組相比,LPS+BMSCs組、LPS+DEX組IL-1β、IL-6和 TNF-α水平明顯下降(均P<0.05)。見圖7。

圖7 BMSCs對ALI小鼠血清中TNF-α,

2.9 BMSCs對ALI小鼠肺組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的影響Western blot檢測顯示,與對照組相比,LPS組TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達上調(均P<0.01),與LPS組相比,LPS+BMSCs組、LPS+DEX組TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達下調(均P<0.01)。見圖8。

圖8 BMSCs對ALI小鼠肺組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的影響

3 討論

ALI是一種以肺泡/毛細血管通透性增高、肺部炎癥和肺組織結構損傷為特征的呼吸道疾病。因肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞損傷,表現為彌漫性肺間質和肺泡水腫,可導致急性呼吸窘迫綜合征,是臨床上病死率較高的呼吸系統疾病,目前尚無高效且不良反應小的治療藥物[1]。ALI發生后,過度炎癥反應導致毛細血管滲透性增加并上調炎癥細胞因子數量,因此,治療ALI的關鍵在于控制炎癥反應[6]。LPS可刺激TLR4和巨噬細胞觸發免疫系統活化,促進細胞因子分泌,導致膿毒性休克[7]。研究[8]表明,MyD88依賴性TLR4信號通路是激活NF-κB的重要途徑,在NF-κB信號傳導調節中至關重要。當細胞受到LPS等刺激時,IκB-α發生磷酸化,從復合物中解離并入核,激活NF-κB信號通路,引起下游釋放炎癥因子,這些炎癥因子又會進一步激活NF-κB信號通路,引發“炎癥風暴”,使肺損傷和炎癥反應持續發展[8]。下調TLR4/MyD88信號通路或抑制NF-κB激活,可減輕LPS誘導的ALI的“炎癥風暴”反應,說明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路與ALI密切相關[9]。

在過去的幾十年里,以MSCs為基礎的細胞治療學成為研究熱點。在MSCs治療ALI的臨床前期研究[10]中顯示了良好的修復和促再生作用,但其具體機制仍不明確。體外研究[11]顯示:BMSCs可通過TLR4信號通路緩解LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥和凋亡,該過程與其降低肺泡上皮細胞中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路基因的mRNA水平并抑制相關蛋白表達密切相關。本研究發現,通過靜脈移植BMSCs后,即可定植于受損的肺臟組織,通過調控信號通路TLR4/MyD88/NF-κB的基因和蛋白表達,抑制炎癥反應,改善肺功能和肺組織病理狀況。BMSCs具有以下特點,有望成為ALI細胞治療的理想種子細胞。首先,BMSCs可以來源患者自體,用于患者自身不會發生排異反應,也不用擔心外源性MSCs可能帶來的病原微生物及腫瘤細胞污染,也不存在倫理學爭議。BMSCs本身免疫原性低,具有廣泛的免疫調節功能,影響先天免疫和獲得性免疫,有利于自體和同種異體移植[12]。其次,BMSCs對損傷和炎癥組織都有很強的內在趨向性。越來越多的臨床前和臨床研究表明,肝細胞生長因子、轉化生長因子-β和血管內皮生長因子可以誘導BMSCs向炎癥部位遷移。BMSCs可以釋放各種可溶性因子和外泌體,從而減輕炎癥,改善損傷部位的微環境,促進組織修復和再生[13]。此外,BMSCs有可能分化為肺組織細胞以替代受損的細胞或組織,盡管這一觀點存在爭議。最后,BMSCs作為有生命的生物藥物,移植進入模型動物體內后可在一定的時間內持續發揮作用,并且不會像地塞米松對機體作用短暫且不良反應較為嚴重[14]。這些都提示BMSCs對ALI進程有較強的抑制作用。

綜上所述,BMSCs移植治療LPS誘導的ALI的作用機制與調控 TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路,抑制炎癥因子及介質釋放,降低炎癥水平有關。BMSCs能有效改善LPS誘導的ALI,通過抑制炎癥反應,減輕肺損傷癥狀,發揮保護作用。本研究闡釋了BMSCs治療LPS誘導ALI的可能潛在機制,為進一步開拓細胞生物治療ALI、尋找治療ALI的作用靶點提供了客觀的實驗依據和理論支持。