金絲桃苷在主動脈弓縮窄所致心肌肥厚中的作用

張曉東,張艷濤,張 磊,董文婷,安慧仙,韓 楊,張 杰,劉治國,李 煒,王 偉

高血壓是心血管疾病的重要危險因素,心臟是其主要受累器官[1]。當負荷增加時,心臟通過增加心肌細胞的面積適應血壓的升高或血容量的增加,這種心臟重塑稱為心肌肥厚[2],其能使心室壁壓力減小并維持收縮舒張功能[3]。但隨著心臟功能失代償,最終導致心力衰竭[4]。研究[2]表明氧化應激、細胞凋亡和炎癥等參與了心肌肥厚的形成。

金絲桃苷(hyperoside, Hyp)是從淫羊藿、金絲桃和貫葉連翹中分離得到的具有生物活性的黃酮苷[5]。研究[5-6]表明Hyp具有抗炎、抗氧化等藥理作用。Hyp調控MAPK和NF-κB抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的小膠質細胞炎癥[7]。此外,有研究[8]指出Hyp激活NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)減輕心肌缺血再灌注損傷。Nrf2是一種轉錄因子,激活后轉位到細胞核啟動抗氧化酶的轉錄,如血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)[9]。最近研究[10]表明,激活Nrf2/HO-1信號可改善氧化應激誘導的神經細胞的神經毒性。然而,Hyp在壓力負荷引起的心肌肥厚中的作用尚不明確,該研究旨在探討Hyp對TAC所致心肌肥厚的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器40只SPF級雄性C57BL/6小鼠(8周齡,體質量20～25 g)購于西安交通大學動物中心,動物生產許可證:SCXK(陜)2018-001。將小鼠飼養于溫度(25±1)℃,相對濕度(55±5)%,12 h/12 h晝夜交替的動物房中,實驗方案經西安國際醫學中心醫院倫理委員會審查通過。Hyp(美國Sigma公司,貨號:00180585),二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)染料(美國Invitrogen公司,貨號:D1168),TRIzol液(美國Invitrogen公司,貨號:15596026CN),三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:10006818),異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:40064360),75%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:80176998),磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS,武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:G0002-2L),蛋白酶抑制劑(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:G2006-250UL),RIPA裂解液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:G2002-100ML),NADPH氧化酶2(NADPH-Oxidase 2, gp91phox,英國abcam公司,貨號:ab129068),超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2, SOD2,美國Cell Signaling Technology公司,貨號:13141S),Nrf2(美國Cell Signaling Technology公司,貨號:12721S),HO-1(美國Cell Signaling Technology公司,貨號:43966S),β-actin(美國Cell Signaling Technology公司,貨號:3700S),逆轉錄試劑盒(北京Takara Bio公司,貨號:RR036A),實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(北京Takara Bio公司,貨號:639503),ML385(美國MedChemExpress公司,貨號:HY-100523),山羊抗兔(北京中衫金橋生物技術有限公司,貨號:ZB-5301),山羊抗鼠(北京中衫金橋生物技術有限公司,貨號:ZB-2305),小動物超聲儀(加拿大Fujifilm VisualSonics公司,型號:Visual Sonics770),激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司,型號:FV3000),實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司,型號:CFX96),Bio-rad化學顯像發光儀(美國Bio-Rad公司,型號:ChemiDoc XRS+)。

1.2 動物模型建立和分組將40只C57BL/6小鼠隨機分為4組,每組10只:① 假手術(Sham)組;② 主動脈縮窄(transverse aortic constriction,TAC)組;③ Hyp處理TAC組(Hyp+TAC);④ Hyp和Nrf2抑制劑ML385共同處理TAC(Hyp+ML385+TAC)組。用2%七氟醚將小鼠麻醉后固定在恒溫手術臺上。參考先前研究[11]進行模型制備,Sham組和TAC組術后當天開始用生理鹽水灌胃,Hyp+TAC組和Hyp+ML385+TAC組術后當天開始用Hyp(20 mg/kg·d)灌胃,Hyp+ML385+TAC組同時腹腔注射ML385(30 mg/kg),均持續4周,根據文獻報道確定Hyp和ML385的給藥時間和劑量[12-13]。

1.3 心臟超聲檢測術后4周,用2%七氟醚將小鼠麻醉后固定在恒溫超聲檢測臺上,將各組小鼠的心率控制在450～500次/min。采用VisualSonics770小動物超聲儀經胸壁進行M超檢測,檢測指標包括左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)和左心室舒張末期后壁的厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole, LVPWd)。

1.4 心臟質量(heart weight, HW)/體質量(body weight, BW)比值計算實驗結束后,用2%七氟醚將小鼠麻醉后稱重并記錄小鼠BW,快速頸動脈放血并摘取心臟,放入預冷的PBS中擠出心臟殘存血液,用濾紙吸干后稱取HW,計算各組小鼠HW/BW比值。

1.5 HE染色檢測心肌橫截面積,Masson染色檢測心臟纖維化,DHE染色檢測活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量計算各組小鼠HW/BW比值后,一部分心肌組織用4%多聚甲醛固定48 h后,石蠟包埋、切片。行常規HE和Masson染色;另外取部分組織用OCT包埋切片,按照DHE染色試劑盒說明書步驟進行染色,37 ℃水浴避光孵育15 min,用防淬滅液封片,激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.6 qRT-PCR檢測ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平術后4周,取部分心肌組織,采用Trizol法在冰上依次加入三氯甲烷、異丙醇和75%乙醇提取組織總RNA,逆轉錄試劑盒得到cDNA。用Bio-Rad CFX96實時定量儀檢測ANP、BNP、β-MHC的mRNA水平,以GAPDH作為內參,引物由上海吉凱基因有限公司合成。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列表(5′-3′)

1.7 Western blot檢測gp91phox、SOD2、Nrf2和HO-1的蛋白表達將各組小鼠左室心肌組織加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液,經研磨裂解、離心后保留上清,BCA法定量蛋白濃度;利用SDS-PAGE膠經電泳、轉膜將蛋白轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,4 ℃條件下用gp91phox(1 ∶1 000)、SOD2(1 ∶1 000)、Nrf2(1 ∶1 000)、HO-1(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)一抗孵育過夜;經TBST洗3次后,用山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗(1 ∶5 000)孵育2 h,TBST洗3次;用Bio-rad化學顯像發光儀檢測條帶,并用Image Lab軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 Hyp對各組心臟功能的作用心臟超聲結果顯示(圖1),Sham組LVEF值為(76±2)%,LVFS值為(40.3±1.5)%,LVPWd值為(0.76±0.05)mm,結果顯示TAC組的LVEF值(41.7%±3.1%)、LVFS值(23.3%±1.4%)低于Sham組(t=16.3,t=13.6,P<0.01),LVPWd值(1.27 mm±0.04 mm)高于Sham組(t=13.63,P<0.01);Hyp處理后,Hyp+TAC組的LVEF值(61%±3.9%)、LVFS值(34%±1.8%)明顯升高(t=6.65、7.34,P<0.01),LVPWd值(0.91 mm±0.06 mm)降低(t=8.20,P<0.01);而Hyp聯合Nrf2抑制劑ML385治療后,與Hyp+TAC組相比,LVEF值(42.3%±4.5%),LVFS值(24.7%±2.1%)明顯下降(t=5.36、5.60,P<0.01),LVPWd值(1.26 mm±0.04 mm)升高(t=7.90,P<0.01)。提示Hyp可以改善TAC組心臟功能。見圖1。

圖1 各組小鼠心臟LVEF、LVFS和LVPWd的水平(n=6)

2.2 Hyp對各組心肌橫截面積和肥厚相關指標的影響HE染色(圖2A)和qRT-PCR(圖2B)結果顯示,與Sham組相比,TAC組心肌橫截面積增大,HW/BW比值(t=21.23,P<0.01)以及ANP(t=24.33,P<0.01)、BNP(t=21.17,P<0.01)和β-MHC(t=38.08,P<0.01)的mRNA水平明顯增加;Hyp處理后,Hyp+TAC組心肌橫截面積、HW/BW比值(t=8.20,P<0.01)以及ANP(t=9.70,P<0.01)、BNP(t=8.89,P<0.01)和β-MHC的mRNA水平(t=16.48,P<0.01)較TAC組降低;而Hyp聯合Nrf2抑制劑ML385治療后,Hyp+ML385+TAC組心肌橫截面積、HW/BW比值(t=8.40,P<0.01)以及ANP(t=6.33,P<0.01)、BNP(t=8.41,P<0.01)和β-MHC的mRNA水平(t=10.80,P<0.01)較Hyp+TAC組增加。提示Hyp可以減輕TAC引起的心肌肥厚。

圖2 各組小鼠心肌肥厚指標水平的比較 (n=6)

2.3 Hyp對各組心肌纖維化的作用Masson染色結果顯示(圖3),與Sham組相比,TAC組心肌纖維化增加;Hyp處理后,Hyp+TAC組心肌纖維化減輕;而Hyp聯合Nrf2抑制劑ML385治療后,Hyp+ML385+TAC組的心肌纖維化增加。提示Hyp可以改善TAC引起的心肌纖維化。

圖3 各組小鼠心肌Masson染色圖(×400)

2.4 Hyp對各組心臟氧化應激水平的作用DHE染色(圖4A)和Western blot(圖4B)結果顯示,與Sham組相比,TAC組心肌DHE熒光增強,說明ROS含量增多,gp91phox表達增加(t=12.42,P<0.01),SOD2的表達降低(t=33.83,P<0.01);Hyp處理后,Hyp+TAC組DHE熒光減弱,說明ROS含量減少,gp91phox表達明顯降低(t=9.60,P<0.01),SOD2的表達增加(t=9.19,P<0.01);而Hyp聯合Nrf2抑制劑ML385治療后,和Hyp+TAC組相比,Hyp+ML385+TAC組DHE熒光增強,說明ROS含量增多,gp91phox表達明顯增加(t=11.23,P<0.01),SOD2的表達明顯降低(t=8.60,P<0.01)。提示Hyp可以改善TAC引起的氧化應激。

圖4 各組小鼠ROS、gp91phox和SOD2表達水平的比較(n=6)

2.5 Hyp對各組Nrf2和HO-1表達的影響Western blot結果顯示(圖5),與Sham組相比,TAC組心肌Nrf2和HO-1表達降低(t=22.92、32.15,P<0.01);Hyp處理后,Hyp+TAC組Nrf2和HO-1表達增加(t=11.41、9.30,P<0.01);而Hyp聯合Nrf2抑制劑ML385治療后,Hyp+ML385+TAC組Nrf2和HO-1表達較Hyp+TAC組相比降低(t=11.62、8.7,P<0.01)。提示Hyp可以調控TAC引起的Nrf2/HO-1信號的表達。

圖5 各組小鼠Nrf2和HO-1蛋白表達水平(n=6)

3 討論

心肌肥厚是心臟對生理病理因素的一種代償機制,而持續的肥厚最終會導致心臟失代償最終進展為心力衰竭[2]。關于心肌肥厚的病理機制已有較多報道,但目前仍然沒有完全闡明。此外,臨床上并沒有針對心肌肥厚的治療藥物。因此,尋找有效的潛在治療藥物成為當務之急。

研究表明,Hyp具有抗病毒、抗炎、抗氧化和抗癌等生物活性[5-6],在心肌缺血再灌注損傷中發揮保護作用[14]。同時,體內外研究[15]均表明,Hyp通過NF-κB信號誘導細胞凋亡和抑制細胞生長。然而,Hyp在心肌肥厚中的作用并不十分明確。本研究結果顯示,Hyp能改善TAC組心臟功能,抑制心肌細胞橫截面積、HW/BW值以及ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平。而ML385一定程度上阻斷了Hyp在TAC中的保護作用。心肌纖維化是肥厚型心肌病的重要病理學特征,可導致心室功能障礙和心律失常[3]。本研究Masson染色結果表明,Hyp能減輕TAC引起的心肌纖維化,而ML385能阻斷Hyp在TAC引起心肌纖維化中的作用。以上均說明Hyp在TAC引起的心肌肥厚中發揮保護作用。

已有證據表明,氧化應激在心肌肥厚的發生和發展中起著關鍵作用,可引起細胞功能障礙、蛋白質和脂質過氧化以及DNA損傷,最終導致不可逆的細胞損傷和凋亡[10]。而Nrf2信號在心肌細胞氧化應激的調控中發揮重要作用。已有研究[8]表明Hyp通過激活Nrf2信號通路,顯著改善缺血再灌注損傷引起的左室舒張末壓的升高和左室收縮壓的降低。本研究結果顯示,Hyp可降低TAC組ROS和gp91phox表達,增加SOD2的表達;同時,上調Nrf2和HO-1的表達。而ML385能阻斷Hyp在TAC引起的氧化應激中的改善作用,并影響Hyp對Nrf2/HO-1信號的調控。

綜上所述,本研究結果證明Hyp可通過抑制氧化應激改善TAC引起的心肌肥厚,這一作用可能與調控Nrf2/HO-1信號有關。本研究結果提示Hyp可能是防治壓力負荷導致的心肌肥厚的一種潛在治療藥物,但仍需要臨床實驗進一步評估Hyp的作用。