circ RNA_0017178對戊四氮致癲癇小鼠模型的影響

毛 戩,溫萍萍,孫洪英,張舒雅,孟晨曦,張 佳

癲癇是一種常見的神經系統疾病,特征是神經元過度同步放電出現短暫的中樞神經系統功能障礙,還伴有一定程度的心理障礙、行為障礙以及認知障礙[1]。目前全世界有超過7 000萬的癲癇患者,其中約三分之一為難治性癲癇[2]。癲癇的反復發作、高病死率加重了癲癇患者的經濟負擔[3]。神經元高度同步異常放電是癲癇發作的根本原因,但具體的發病機制尚未明確。因此,研究癲癇的發病機制,尋找診斷和治療癲癇的新方法尤為重要。環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種閉環結構的非編碼RNA,因其半衰期較長、表達穩定、不易降解等性質被廣泛研究[4],其在腦組織中表達豐富,在神經元功能中起著重要作用。據報道[5],circRNA與多發性硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病等神經系統疾病有關,然而,由于癲癇發病的具體機制尚不明確,且目前關于circRNA與癲癇的研究相對其他疾病開展的較少,病變通路、作用靶點尚未明確。該研究旨在對癲癇患者及對照組進行基因芯片測序結果分析,并對circ_0017178在癲癇中的作用機制進行生物信息學預測,探究circ_0017178對戊四唑癲癇小鼠的行為學變化及海馬細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料RNeasy Kit(美國安捷倫科技有限公司,貨號:DXT-74404)、 TRIZOL(德國themro,貨號:15596026)、反轉錄試劑盒(南京諾唯贊有限公司,貨號:R211-01/02),Fioll淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P8610),戊四唑(美國Sigma,貨號:P6500),Tunel細胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司,貨號:40308ES60),PBS洗液(上海源培生物科技公司,貨號:B390KJ),人circRNA基因芯片(美國安捷倫科技有限公司,芯片ID085202)、SureScan Dx微陣列芯片掃描儀(美國安捷倫科技有限公司,型號:G5791A),Agilent Bioanalyzer 2100(美國安捷倫科技有限公司,型號:2100),qubit3.0定量儀(美國Thermo,型號:Qubit 3.0 Nanodrop 2000),PCR擴增儀(美國 ABI,型號:7500),腦立體定位儀 (上海玉研儀器有限公司,型號:SA-103-3),熒光倒置顯微鏡(日本 Olympus ,型號:IX73)。

1.2 基因芯片分析

1.2.1病例資料 收集2018年11月—2019年3月就診于包頭醫學院第一附屬醫院癲癇門診和病房以及包頭市中心醫院癲癇門診的癲癇患者。納入標準:符合2017年國際抗癲癇聯盟癲癇發作和癲癇新分類標準[6]。排除標準:① 神經學檢查或頭顱磁共振發現顱腦腫瘤、血管損傷或畸形以及癲癇發作相關的腦軟化灶;② 由頭顱外傷、產傷或感染引發的癲癇; ③ 患有精神系統疾病、其它神經系統遺傳性或發作性疾病或存在明顯的智力障礙; ④ 3代家屬內發現存在明確的癲癇病史。按照病例組年齡、性別匹配包頭醫學院第一附屬醫院體檢健康人群作為健康對照組。該研究已通過包頭醫學院第一附屬醫院的倫理委員會批準,所有研究對象在抽血前均簽署知情同意書。

1.2.2基因芯片測序 EDTA管收集受試者外周肘靜脈血4 ml,依據Ficoll密度梯度離心法使用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),按照TRIzol試劑盒說明書提供的標準操作流程提取樣品的總RNA,并利用NanoDrop ND-2000定量檢測純度及濃度,使用qubit3.0熒光定量儀測定庫濃度,應用Agilent Bioanalyzer 2100對RNA片段的大小進行精確測定和濃度定量,使用Agilent Bioanalyzer 2100系統軟件檢測總RNA的完整性,選取高質量的RNA樣品用于后續芯片分析。應用人circRNA芯片鑒定差異性表達的circRNA。按照反轉錄試劑盒說明進行標記和擴增。隨后使用熒光染料 Cyanine-3-CTP(Cy3) 進行標記,利用Agilent Scanner掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction軟件(version12.0.3.1, Agilent Technologies)處理原始圖像、提取原始數據;利用Genespring軟件(version14.8, Agilent Technologies)進行數據的標準化和后續處理;使用火山圖可視化兩組之間的差異circRNA,并進行分層聚類以顯示樣品之間可區分的circRNA表達模式。本部分由北京閱微基因技術有限公司完成。

1.3 生物信息學分析使用circPrimer生信軟件[7](www.bio-inf.cn/circPrimer)分析circ_0017178的組成及可能結合的腺苷酸N6位(N6-methyladenosine,m6A)的甲基化修飾位點、核糖體進入位點(internalribosome entrysite, IRES )和開放閱讀框架(open reading frame,ORF)結合位點;使用circMir生物信息學軟件(www.bio-inf.cn/circmir)自帶的miRANDA工具和RNAhybird工具分別預測circ_0017178可能結合的miRNA,結果取交集得到的miRNA為circ_0017178可能結合的miRNA;使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_80/)生物信息學網站,將circMir所得的miRNA與癲癇基因可能結合的位點進行預測,預測結果以CWCS(cumulative weighted context++ score)評分分數進行評估,以CWCS分數<-0.1為最低的要求標準,使用Cytoscape構建circ_0017178相關miRNA及相關癲癇基因生物信息網絡圖。

1.4 動物學實驗

1.4.1實驗動物及分組 30只C57BL/6雄性成年小鼠(下文簡稱小鼠),周齡為12～13周,中位年齡12.5周,平均體質量為30～35 g,飼養環境溫度(22±2)℃,濕度 50%～60%,光照暗室循環 12 h,自由食水,并且在進行實驗前1周適應所生活的環境。本實驗所涉及到關于動物的使用和護理都符合動物實驗相關規定,并獲得了動物倫理委員會的批準(倫理學批號:包醫倫審動物2021第031號)。將小鼠隨機分為3組:對照組、空載體腺病毒組(下文簡稱空載體組)、circ_0017178過表達腺病毒組(下文簡稱過表達組),每組10只。

1.4.2構建腺病毒載體并進行qRT-PCR檢測 Circ_0017178過表達的質粒由由華大基因公司構建,腺病毒載體由漢恒生物公司根據腺病毒操作手冊說明書進行構建。9只小鼠用來檢測腺病毒載體的表達,隨機分為對照組、空載體組、過表達組3只/組,分別向各組小鼠海馬內注射生理鹽水、空載體病毒載體、過表達腺病毒載體。1周后使用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測小鼠海馬組織circ_0017178表達:參照TRIzol試劑說明書操作提取海馬組織總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書反轉錄,按照上面的反應體系進行cDNA的合成逆轉錄反應體系,PCR儀中進行擴增,根據循環數閾值(cycle threshold,CT)值的結果,采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達水平,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列表

1.4.3顱內立體注射轉染腺病毒載體 腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉1.4.1和1.4.2項的小鼠,使用前囟進行顱骨標志法定位:前囟和后囟處于水平,之間的間距大約0～0.1 mm,以前囟出為“0點”,前囟向嘴側的方向為“+”,向尾側的方向為“-”。使用腦立體定位儀固定小鼠頭部,剪去頭部毛發后消毒,沿矢狀縫切開3 cm的創口,緩慢分離皮下的相關組織,暴露小鼠的前囟、人字縫及矢狀縫。將金屬定位針置于矢狀縫上方,定位針前囟確定標準中線后在前囟后方2 mm,矢狀縫旁開2.5 mm處定位,即為海馬平面所在位置。鉆孔針顱骨鉆孔后于下降2 mm處對雙側海馬各注射1 μl的腺病毒液體,對照組注射等量的生理鹽水。縫合皮下組織和頭皮,對齊組織,用酒精對創口消毒。染毒后恢復1周,將1.4.2小鼠進行qRT-PCR檢測circ_0017178的表達驗證腺病毒構建情況,將1.4.1項小鼠用來構建戊四唑癲癇模型及檢測海馬組織細胞凋亡的情況。

1.4.4構建戊四氮癲癇小鼠模型 用0.9%生理鹽水溶液將戊四氮配成100 mg/ml,每天上午9時到12時按照35 mg/kg對1.4.1項小鼠經腹腔給予戊四唑(pentylenetetrazole, PTZ)注射,持續21 d,每次注射完PTZ 后0.5 h內記錄小鼠行為變化,按照癲癇發作程度的Racine評分[8]評估,具體的動物行為學觀察內容包括:① 潛伏期:首次達到Racine 4級及以上的天數;② 發作頻率:每次注射PTZ后癲癇小鼠的發作次數;③ 發作時間:每次注射PTZ后癲癇小鼠的發作時間。

1.4.5Tunel染色法檢測海馬組織細胞凋亡情況 腹腔注射50 mg/kg苯巴比妥鈉麻醉1.4.1項分組小鼠,安樂死后提取海馬組織制備切片。按照Tunel細胞凋亡檢驗試劑盒說明書對海馬組織切片進行Tunel染色,使用熒光顯微鏡對樣本的海馬組織CA1區細胞凋亡情況進行檢測分析計數。

1.5 統計學處理芯片數據利用差異倍數及t檢驗的P值進行差異circRNA的篩選:上調或者下調差異倍數≥2.0 且P值<0.05為有生物學重復性,上調或者下調差異倍數<2無生物學重復性;動物實驗正態分布計量資料以平均值±標準差表示,不符合正態分布或方差不齊數據采用M(P25,P75)來表示;采用Levene 檢驗方差齊性,方差齊則使用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較;數據不符合正態分布或方差不齊時使用秩和檢驗進行兩組間比較;計數資料使用卡方檢驗進行兩組之間的比較。分別使用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析和做統計圖,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例臨床一般資料本研究納入癲癇組(EP)和正常對照組(NC)受試者各3例,3組受試者按照病例組的年齡、性別匹配選出,一般臨床資料見表2。

表2 病例臨床一般資料

2.2 基因芯片分析結果

2.2.1總RNA質量 經qubit3.0定量儀檢測兩組總RNA的純度和濃度,按照質量檢測標準,A260/A280比值1.8～2.1則符合circRNA芯片實驗要求;Agilent2100生物分析RIN≥7則樣品RNA完整性良好。該研究癲癇組和對照組所有樣本RNA 質量符合后續circRNA芯片實驗的要求,見表3。

表3 癲癇組和對照組的總RNA質檢結果

2.2.2circRNA表達譜分析結果 circRNA在癲癇組和對照組中表達倍數變化及統計學顯著程度以火

山圖呈現(圖1A),根據circRNA表達水平的不同,經過圖像采集和數據分析后篩選得差異circRNA(圖1B)。與健康對照組對比,癲癇組差異性表達的circRNA 共21 988條,上調的circRNA 11 488條,下調的共10 500條;上調的circRNA中有6條(circ_0069272、circ_0073442、circ_0033065、circ_0033063、circ_0017178、circ_0049415)有生物學重復性(表4);下調的circRNA中有3條(circ_0083773、circ_0088262、circ_0016396)有生物學重復性(表5); 9條有生物學重復性的環狀RNA中, circ_0017178的來源基因CHRM3與癲癇易感性有關。因此,接下來對circ_0017178進行生物信息學分析,并在動物實驗中對circ_0017178與癲癇的關系展開研究。

圖1 癲癇組和對照組環狀RNA差異倍數火山圖和RNA聚類圖

表4 癲癇組與對照組相比顯著上調的6條差異circRNA

表5 癲癇組與對照組相比顯著下調的3條差異circRNA

2.3 生物信息學分析結果

2.3.1CircPrimer生物信息學軟件分析結果 如圖2所示,circ_0017178是CHRM3基因的表達產物,由CHRM3的外顯子exon8聚合形成的外顯子型環狀RNA,含有127個堿基序列。使用“DEACH”功能發現circ_0017178可能結合的m6A甲基化位點一共有3個(表6),使用“高度匹配”功能發現circ_0017178可能結合的m6A甲基化位點為1個,位置位于27號位點,同時,circ_0017178具備1個ORF1和IRES的潛在結合位點。

圖2 CircPrimer對circ_0017178的生物信息學分析圖

表6 ORF與m6A結合位點信息

2.3.2CircMir生物信息學軟件分析結果 circMir生物信息學軟件分析circ_0017178可能結合的miRNA顯示circ_0017178可能結合51個miRNA,RNAhybird工具分析顯示circ_0017178可能結合299個miRNA,取交集共有26個miRNA。分別為:miR-363-5pmiR-3681-5p、miR-4298、miR-433-3p、miR-4433b-3p、miR-4436b-3p、miR-4475、miR-4651、miR-4740-3p、miR-4776-5p、miR-4786-5p、miR-4800-5p、miR-584-3p、miR-656-5p、miR-665、miR-6735-5p、miR-6736-3p、miR-6782-5p、miR-6847-5p、miR-6879-5p、miR-8071、miR-877-5p、miR-4632-5p、miR-6738-5p、miR-184、miR-4726-5p。見圖3。

圖3 CircMir對circ_0017178的生物信息學分析結果圖

2.3.3TargetScan生物信息學網站預測 將26個miRNA與癲癇相關基因運用TargetScan,將取得的結果以CWCS<-0.1分為條件, 6個miRNA (miR-4632-5p、miR-6738-5p、miR-184、miR-4726-5p、miR-877-5p、miR-433-3p) 沒有找到符合條件的癲癇基因,另外20個miRNA可以交互匹配到39個癲癇基因,共96條路線參與構成生物信息學網絡。見圖4。

圖4 生物信息學預測得到的circ_0017178調控癲癇基因網絡圖

2.4 Circ_0017178對癲癇小鼠的影響

2.4.1qRT-PCR法檢測circ_001718過表達腺病毒載體水平 1.4.2小鼠在對照組和空載體組中,未檢測出circ_0017178的表達;在circ_0017178過表達組海馬組織中,內參平均CT值為16.43,circ_0017178的平均CT值為24.54,表明circ_001718腺病毒載體構建成功。

2.4.2Circ_0017178對癲癇小鼠生物行為學變化的影響 1.4.1小鼠構建PTZ癲癇模型過程中,對照組小鼠死亡1只,9只小鼠成功構建PTZ癲癇模型;空載體組C57BL/6小鼠死亡2只,8只小鼠成功構建PTZ癲癇模型;過表達circ_0017178組C57BL/6小鼠死亡2只,8只小鼠成功構建PTZ癲癇模型。三組小鼠的潛伏期、發作時間、發作次數均符合計量資料正態分布,且方差齊(P>0.05)。與對照組及空載體組相比,circ_0017178過表達組癲癇的潛伏期明顯縮短(t=12.78、13.39,均P<0.05)、發作時間明顯延長(t=12.86、10.88, 均P<0.05)、發作次數明顯增加(t=8.92、6.79,均P<0.05);空載體組及對照組間無差異。結果見圖5。

圖5 各組癲癇小鼠動物行為學結果統計分析圖

2.4.3Circ_0017178對癲癇小鼠海馬組織細胞凋亡的影響 在1.4.1中對照組、空載體組、過表達組三組癲癇小鼠海馬CA1區中可見紅色熒光信號(紅光代表細胞凋亡),相比于對照組和空載體組,過表達組海馬組織CA1區熒光信號更強。見圖6A。采取圖像分析計數,卡方檢驗結果顯示空載體組和對照組之間細胞凋亡率差異無統計學意義(χ2=0.66,P>0.05),過表達組的細胞凋亡率明顯高于對照組和空載體組(χ2=49.38、41.11,均P<0.05)。見圖6B。表明,相比于空載體組和對照組,Circ_0017178過表達組海馬組織CA1區細胞凋亡更嚴重。

圖6 Tunel染色細胞凋亡結果

3 討論

CircRNA在疾病中的功能是結合miRNA以“分子海綿”發揮作用,此外,還具備吸附蛋白 、調控其它基因轉錄 、干擾其它基因剪接 、翻譯多肽、作為生物學標記物等多種功能[9],目前circRNA在癲癇中的研究很少。本研究結果表明circ_0017178與癲癇密切相關。

circRNA發揮功能與其來源的位置密不可分,circRNA根據其來源分為外含子circRNA、內顯子circRNA以及外含子-內顯子混合的circRNA。外顯子circRNA在細胞質中穩定表達,可以與miRNA或RNA結合蛋白相互作用,甚至包繞具備翻譯起始密碼子的區域,可能在基因表達和翻譯中發揮調節作用[10]。相比之下,內顯子circRNA更多位于細胞核中,受其他因素干擾較小,表達穩定[11]。外顯子-內含子circRNA同時具有外顯子和內含子circRNA特征。本研究通過circPrimer生物信息學軟件分析發現circ_0017178為外顯子型circRNA,其可能具備“分子海綿”的功能結合miRNA調節癲癇基因的表達在癲癇中發揮作用。本研究結果顯示circ_0017178可能結合的miRNA共有26個,運用TargetScan匹配發現其中20個miRNA匹配到39個癲癇基因,共96條ceRNA通路。

本研究顯示circ_0017178在結構上不僅具備m6A甲基化的位點,還具備與ORF1、IRES結合的位點。研究[12]表明m6A修飾會影響circRNA的發生、翻譯、降解和細胞定位,在circRNA的代謝過程中起到生理或病理生理調節作用。m6A可能促進circRNA的翻譯能力[13]。IRES、ORF和m6A修飾三個基本元素賦予circRNA 編碼蛋白質的獨特能力,從而具備翻譯的潛力[12]。因此circ_0017178的 具備的m6A結合位點可能通過表觀遺傳學在癲癇中發揮作用,circ_0017178甚至還具備翻譯的潛能。

研究表明[14]circRNA可能通過影響神經元凋亡過程從而對癲癇產生影響。細胞凋亡是一種細胞程序性的死亡,受到嚴格的程序性生物控制。細胞凋亡有利于維持多細胞生物組織和器官的完整性和平衡性,使機體更容易適應體內不斷變化的環境,對生物具有特殊的意義[15]。本研究癲癇小鼠體內實驗發現circ_0017178過表達后可以更加快速地誘發癲癇發作,以及加重癲癇的嚴重程度,同時利用Tunel染色觀察到過表達circ_0017178后加劇了癲癇小鼠海馬組織的凋亡程度,這表明circ_0017178可能通過促進細胞凋亡參與癲癇的發生和發展。

本研究亦存在不足,如僅運用PTZ癲癇模型進行了實驗,僅運用Tunel染色驗證細胞凋亡,因此在后期實驗中將設計實驗構建其他癲癇模型進行重復實驗,同時用檢測Capase-3、死亡受體等方式多維度對細胞凋亡進行研究;生物信息學方面,將進一步探究circRNA-miRNA-mRNA的相互關系。隨著生物學技術的發展和circ RNA 研究的不斷深入,未來將更深刻的了解circRNA與癲癇的關系,為癲癇防治提供新的方法,為治療策略及新藥研發開辟新的切入點。