二陳湯對非酒精性脂肪性肝病FXR信號通路及膽汁酸水平的影響*

崔佳斌 鄭棟棟 陳 奇 江岸林

海鹽縣中醫院 浙江 海鹽 314300

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損害因素所致的，因大量脂質在肝臟沉積，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征，NAFLD可進一步演變為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[1]，已逐漸成為最主要的肝臟疾病之一。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由半夏、橘紅、白茯苓、甘草、烏梅和生姜組成，具有燥濕化痰、理氣和中之功效，廣泛用于NAFLD的治療[2]。近年來發現，法尼酯衍生物X受體（FXR）在物質代謝及腸道穩態中發揮重要的作用，通過調節膽汁酸（BA）、脂類及糖等代謝，可調控NAFLD的發展和轉歸[3]。本課題就二陳湯是否通過調控FXR信號通路干預NAFLD進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠51只，4周齡，體重（100±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心。適應性喂養1周后隨機分成2組：對照組8只，造模組43只，對照組予常規飼養，造模組予高脂飼料喂養，高脂飼料配方：基礎飼料72.6%，豬油10%，膽固醇2%，膽鹽0.4%，蛋黃粉5%，蔗糖10%。造模組于造模第8、10和12周各處死1只大鼠，取肝臟組織做HE染色，判定造模情況。

1.2 藥物及試劑：奧貝膽酸（美國Sigma），二陳湯（法半夏、茯苓各9g，陳皮、烏梅、生姜各6g，炙甘草3g，由海鹽縣中醫院中藥房提供）；RNA純化試劑盒（北京天根生化），PCR試劑盒（上海士鋒生物），蛋白提取試劑盒（杭州聯科），FXR、小異二聚體伴侶（SHP）、膽固醇7α羥化酶（CYP7A1）和膽鹽輸出泵（BSEP）一抗（英國Abcom），二抗（北京中杉金橋），BA檢測試劑盒（上海武昊），引物（生工生物工程）。引物序列：FXR（5’-CCATTTACAAGCCACGGACG-3’、5’-CCCAGGTTGGAATAATAGGACG-3’），SHP（5’-CTCCCCCGATGAAGGTCGAT-3’、5’-CTCTAAGACGCTCACAGTCTCT-3’），CYP7A1（5’-TGAAGAGTACCACACCAGG-3’、5’-CATCAGACTATGGCGCAGGT-3’），BSEP（5’-GGGCATCTCAAGCAAACACC-3’、5’-AATGGCATTCCCTCCAGAGC-3’）。

1.3 實驗儀器：精密電子秤（Sartorius，BT-224S），高速低溫離心機（Eooendorf，15R），全自動生化分析儀（北京朗普，SMT-120VP），紫外/可見分光光度計（上海譜元，α-1860），恒溫水浴箱（上海精密實驗，DK-S24），電子顯微鏡（Thermo Fihser，L120C TEM），熒光定量 PCR儀（ABI，7300），超凈工作臺（蘇凈，sW-CJ-2FD），電泳儀（Hexagon，DE214），全自動蛋白印跡處理系統（廣州博鷺騰生物，WB-600Auto）。

1.4 實驗分組及方案：造模12周后將造模組隨機分成模型組，奧貝膽酸組，中藥高、中、低劑量組，各組8只，進行藥物干預。奧貝膽酸組：奧貝膽酸以成人25mg/d劑量，按體表面積換算成大鼠劑量為2.25mg/kg·d，以0.5%羧甲基纖維素鈉為溶劑；二陳湯高、中、低劑量組：分別為4.86g/kg·d，2.43g/kg·d和1.22g/kg·d；模型組及對照組予同等劑量的生理鹽水，灌胃體積為10mL/kg，2次/d，持續4周，干預期間，喂養方式不變。

1.5 樣本采集：干預結束后，禁食8小時后大鼠按30mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，腹主動脈采血、離心后，取上層血清。處死大鼠后，取肝臟左葉固定位置，修剪其大小為5mm×5mm×3mm左右，放置10%中性福爾馬林溶液中固定，待HE染色。取大鼠肝右葉固定位置，2塊大小約5mm×5mm×5mm左右組織，以DEPC處理過的PBS沖洗干凈，分裝與凍存管中，先置于液氮中，后轉于-80℃保存待用。

1.6 檢測指標及方法：分述如下。

1.6.1 肝臟組織石蠟切片HE染色：取大鼠肝組織常規石蠟包埋、切片（5μm）、脫蠟、脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色后，在光鏡下觀察。

1.6.2 肝臟和血清BA檢測：取50mg肝組織，以酶聯免疫吸附法測定肝臟組織BA；生化儀檢測大鼠血清BA。

1.6.3 Realtime-PCR檢測：按Trizol Reagent試劑盒提取總RNA，檢測濃度及純度。反應條件：94℃、2min變性，95℃、40s，50℃～65℃、40s循環40次。定量分析采用公式：△△Ct=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4），Ct1、Ct2為處理樣品待測基因和管家基因循環次數，Ct3、Ct4分別對照樣品待測基因和管家基因循環次數。

1.6.4 Western blot檢測：組織充分勻漿后提取蛋白，按提取試劑盒說明進行操作。Bradford法檢測蛋白濃度后，上樣進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠80V、20min，分離膠100V、1h；轉膜至PVDF膜上并以考馬斯亮藍染色，封閉2h，一抗雜交，4℃孵育過夜，洗膜后二抗雜交反應1h，最后ECL發光照相測定蛋白表達量。

1.7 統計學方法：采用SPSS 21.0統計分析軟件進行計算。本試驗研究均采用雙側檢驗，以P＜0.05作為顯著性差異的標準。計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法；不符合正態分布數據以中位數表示，用非參數檢驗，如Wilcoxon秩和檢驗、Kruskal-wallis的H檢驗等。

2 結果

2.1 對NAFLD大鼠肝臟組織學的影響：如圖1所示，正常組肝組織形態大致正常；模型組大鼠肝細胞呈中-重度脂肪變，肝細胞腫脹，細胞核被擠向一邊，大量脂肪空泡充斥于包漿內，可見大小不等的脂滴，符合NAFLD病理表現；經奧貝膽酸及中藥治療后，肝細胞脂肪變有不同程度改善，脂肪空泡不同程度減少，以奧貝膽酸及中藥高劑量組最為顯著。

圖1 肝臟病理學檢測

2.2 對NAFLD大鼠肝臟及血清BA的影響：如表1和圖2所示，經高脂飼料喂養后，NAFLD模型大鼠肝臟和血清BA明顯升高，經藥物干預后有不同程度的降低，以奧貝膽酸和高劑量組最為顯著，且二陳湯各組呈劑量依賴性。說明在降低NAFLD肝臟BA方面，奧貝膽酸與二陳湯高劑量療效相當，而在降低血清BA方面二陳湯高劑量優于奧貝膽酸。

表1 各組大鼠肝臟及血清BA對比（±s）

表1 各組大鼠肝臟及血清BA對比（±s）

注：與正常組對比，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組對比，cP＜0.01；與奧貝組對比，dP＜0.05，eP＜0.01；與高劑量組對比，fP＜0.05，gP＜0.01；與中劑量組對比，hP＜0.05，iP＜0.01。

組別正常組模型組奧貝組高劑量組中劑量組低劑量組例數8 8 8 8 8 8肝臟BA（μg/mg）25.6±4.5 106.5±14.2bc 54.6±7.4bc 43.8±7.3bcd 67.4±9.1bceg 83.6±9.3bcegi血清BA（μmol/L）4.2±1.0 14.9±2.7b 7.0±1.7bc 6.6±1.8ac 9.0±1.9bcdf 11.6±2.2bcegh

圖2 肝臟及血清BA水平對比

2.3 對NAFLD肝臟FXR信號通路的影響：如圖3所示，NAFLD模型組大鼠FXR、SHP及BSEP mRNA表達較正常組顯著下降，CYP7A1 mRNA表達顯著上調；經奧貝膽酸及二陳湯治療后，FXR、SHP及BSEP mRNA表達具有不同程度上調，CYP7A1 mRNA表達不同程度下調，其中以奧貝膽酸及二陳湯高劑量最為顯著。

圖3 FXR、SHP、CYP7A1和BSEP mRNA表達的對比

對各組大鼠肝臟FXR、SHP、CYP7A1和BSEP蛋白表達的影響如圖4所示，NAFLD模型組大鼠FXR、SHP及BSEP蛋白表達較正常組顯著下降，CYP7A1蛋白表達顯著上調；經奧貝膽酸及二陳湯治療后，FXR、SHP及BSEP蛋白表達不同程度上調，CYP7A1蛋白表達不同程度下調，其中以奧貝膽酸及二陳湯高劑量最為顯著。

圖4 FXR、SHP、CYP7A1和BSEP蛋白表達的對比

3 討論

本病可歸屬于中醫學“肝癖”“痰濁”“肥氣”等范疇，脾虛運化失權、痰濕內生是重要病機，痰、濕、濁、瘀、熱為主要病理因素[4]。由于現代飲食結構及生活方式的改變，飲食因素在本病的發生發展中占有主導地位[5]。《儒門事親》：“膏粱之人，奉養過度，起居閑逸，酒食所傷，以致中脘留飲脹悶。”[6]痰濕停滯于臟腑、經絡，妨礙氣血運行，致氣血瘀滯、痰瘀互結，產生新的致病因素。學者統計發現，濕濁內停證在NAFLD中占34.5%，是最常見的證型[7]。二陳湯是治療痰濕的代表方，亦是基礎方，廣泛用于NAFLD等代謝綜合征。

就本病發病機制而言，我們對本病的認識，從最早的“二重打擊”學說逐漸發展到目前的“多重打擊”學說[8]。臨床研究發現NAFLD患者血清膽汁酸水平明顯升高[9]，Thompson等[10]亦發現NAFLD小鼠膽汁酸池增大，膽汁酸組成改變，提示膽汁酸過多引起的細胞毒性亦參與了本病的發生發展。膽汁酸是膽汁的主要成分，在肝臟依賴CYP7A1生成后，由BSEP泵入膽小管，儲存于膽囊，最后排放入小腸發揮生理作用[11]。

FXR可通過調節膽汁酸代謝，干預NAFLD的進展。無論是人還是動物研究均發現，FXR表達下調與NAFLD進展間存在正相關[12]。FXR激活后誘導SHP的表達，可促使肝臟核受體-4與肝受體同源物-1結合的共活化物解離并失活，從而降低對CYP7A1的轉錄活化作用，抑制膽汁酸的生成；此外，FXR還通過上調BSEP的表達促進肝臟分泌膽汁酸，并使膽汁酸轉變為膽汁，從而增加膽汁酸的排泄[13]。

本研究首次發現，二陳湯可激活NAFLD大鼠肝臟FXR，進而上調SHP及BSEP，抑制CYP7A1的表達，從而降低肝臟及血清BA水平，改善肝臟脂肪病變情況，且二陳湯激活FXR信號通路的程度呈劑量依賴性。綜上所述，本研究為臨床二陳湯治療NAFLD提供了一定的理論支撐。