基于網(wǎng)絡藥理學研究消渴平合劑治療氣陰兩虛型糖尿病的作用機制*

陳 浪 王應旻

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴”范疇，中醫(yī)注重整體觀念、辨證論治，中藥多靶點、多途徑的作用特點，對于糖尿病這類多因素致病的疾病有良好療效。消渴平合劑是我院院內(nèi)制劑，由黃芪、山藥、生地、麥冬、天花粉、丹參、菊花、枸杞子組成，具有益氣養(yǎng)陰、生津潤燥之功效，臨床應用療效顯著。但其作用的化學物質(zhì)及具體機制仍不清楚。本研究通過網(wǎng)絡藥理學對消渴平合劑的主要活性成分進行分析，并對其治療糖尿病的潛在作用靶點進行生物信息學分析，旨在為研究消渴平合劑治療糖尿病的機制提供研究思路，以期為臨床推廣使用提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 消渴平合劑中入選活性成分的篩選和靶點預測：檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)[1]和中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)[2]中消渴平合劑各項化學成分及靶點，參考各成分的毒藥物動力學(ADME)參數(shù)開展篩選工作。所設定的篩選條件如下：口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18[3，4]。利用Uni Prot疾病靶點標準化數(shù)據(jù)庫校正與活性成分相關的靶點蛋白，蛋白種屬設置為“homo sapiens（human）”，獲得靶點對應的標準基因名。

1.2 疾病靶點的檢索及獲?。和ㄟ^GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫，以“diabetes”為關鍵詞，限制檢索條件為“gene”與“homo sapiens”，獲得與糖尿病相關的疾病靶點基因。將所有靶點基因進行合并，剔除重復靶點基因，即為所需的疾病總靶點。

1.3 治療糖尿病潛在作用靶點的Venn分析：通過R語言獲得藥物靶點和疾病點的交集靶點，繪制韋恩圖，即為消渴平合劑治療糖尿病的潛在作用靶點。

1.4 繪制中藥復方調(diào)控網(wǎng)絡：利用網(wǎng)絡可視化軟件平臺Cytoscape3.8[5]構建“有效活性分子-靶基因”復方調(diào)控圖，其中圖中“節(jié)點”表示有效成分、靶基因，“邊”表示有效成分與靶基因之間的關系。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡構建和CytoNCA網(wǎng)絡拓撲分析：將Venn分析得到的交集靶點在線導入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，得到蛋白與蛋白間的相互作用信息，將獲得的數(shù)據(jù)信息導入Cytoscape軟件，生成PPI網(wǎng)絡圖。利用網(wǎng)絡拓撲分析插件CytoNCA篩選出上述交集網(wǎng)絡中自由度大于所有節(jié)點中心性（DC）、介度中心性（BC）、特征向量中心性（EC）、接近中心性（CC）即為關鍵基因。

1.6 GO和KEGG信號通路富集分析：使用R語言對上述關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析；節(jié)點越大代表顯著性越高，說明該通路的重要性越高。選擇前20條繪制柱狀圖、氣泡圖。

2 結果

2.1 消渴平合劑活性成分和靶點篩選：通過TCMP及TCMID數(shù)據(jù)庫檢索，并通過OB和DL篩選，獲得有報道的黨參有效成分65個，枸杞子45個，黃芪20個，生地4個，菊花20個，麥冬1個，山藥16個，天花粉2個，總計173個。相應的靶點3310個。

2.2 治療糖尿病潛在作用靶點的Venn分析：檢索數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點基因，GeneCards8758個、OMIM411個、PharmGkb314個，TTD37個，DrugBank50個，剔除重復后共計8960個，見圖1a；通過R語言繪制疾病和藥物交集基因共計228個，并繪制韋恩圖（圖1b），即為消渴平合劑治療糖尿病的潛在作用靶點。

圖1 韋恩圖

2.3 繪制中藥復方調(diào)控網(wǎng)絡：通過Cytoscape3.8繪制調(diào)控網(wǎng)絡。見圖2。

圖2 消渴平合劑活性成分-基因靶點調(diào)控網(wǎng)絡圖

圖2中方塊部分為藥物和疾病基因的交集基因，圓圈為消渴平合劑中藥物的活性成分。

2.4 PPI網(wǎng)絡建立：將Venn分析得到的228個交集靶點在線導入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，得到蛋白間的相互作用信息，將STRING數(shù)據(jù)庫中獲得的數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，通過插件cytoNCA對網(wǎng)絡進行拓撲分析。蛋白基因JUN，MYC，MAPK1，TP53等16個靶點即為消渴平合劑治療糖尿病的潛在作用靶點。見圖3。

圖3 消渴平合劑治療糖尿病的潛在作用靶點

2.5 GO和KEGG富集分析：通過R語言對228個基因進行GO和KEGG通路分析。GO分析基于細胞成分、生物過程和分子功能。通過分析確定了2966個GO項顯示顯著富集（FDR＜0.05）；其中2616個、118個、230個依次和生物過程、細胞成分、分子功能相關。選取前10個繪制柱狀圖，如圖4所示。

圖4 消渴平合劑治療糖尿病靶基因GO富集分析圖

通過KEGG通路分析來確定消渴平合劑在治療糖尿病中顯著影響的通路。我們確定了186個顯著富集的通路(FDR＜0.05)，包括AGE-RAGE通路、凋亡、內(nèi)分泌抵抗以及與IL-17等相關的通路。選取前30個繪制氣泡圖，如圖5所示。

圖5 消渴平合劑治療糖尿病KEGG信號通路富集分析圖

通過R語言pathview包繪制了消渴平合劑治療糖尿病的通路圖，如圖6所示，途徑靶點用白色標記，消渴平合劑治療糖尿病的靶點用紅色標記。通路圖顯示消渴平合劑參與了糖尿病的治療，包括AGE-RAGE通路、PI3K/AKT信號通路和Jak-STAT信號通路，有效靶點有34個。提示消渴平合劑可能通過調(diào)控多個方面發(fā)揮治療糖尿病的作用，其靶點可能定位于這些通路。

圖6 消渴平合劑通過介導AGE-RAGE信號通路治療糖尿病的示意圖

3 討論

消渴平合劑處方來源于我院省級名中醫(yī)史奎鈞主任中醫(yī)師，根據(jù)消渴病氣陰兩虛、燥熱津傷為主的病機特點，以丹溪消渴方為基本方加減而成，方藥由黃芪、山藥、生地、麥冬、天花粉、丹參、菊花、枸杞子組成，具有益氣養(yǎng)陰、生津潤燥之功效。既往研究[6,7]已表明消渴平合劑具有降糖、改善胰島β細胞功能、降低炎癥反應同時可減少尿蛋白，保護腎功能。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法探討消渴平合劑治療糖尿病的分子機制。利用173個有效化合物與228個疾病和藥物交集靶點構建了消渴平合劑的化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡調(diào)控圖，并進行PPI蛋白互作分析，結果表明，消渴平合劑的大部分化合物作用于多個靶點，其中槲皮苷、木犀草素、山奈酚分別作用于130、52和50個靶點。因此，它們很可能是消渴平合劑的關鍵多效性化合物。槲皮苷和山奈酚作為典型的黃酮類化合物，也已經(jīng)被證明對糖尿病有治療作用。趙海霞等[8]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過降低 TGF-β、Smad2/3、α-SMA、Snail 的表達，促進 E-cadherin的表達，從而抑制1型糖尿病小鼠腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。王興紅等[9]則發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過調(diào)控腎臟Wnt/β-catenin/GSK3β信號通路起到對糖尿病大鼠腎功能的保護作用。已有研究證明[10]，山奈酚可保護胰島β細胞損傷，朱文瑛等[11]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)山奈酚可通過調(diào)節(jié)P38 MAPK信號通路對高糖引起的SH-SY5Y細胞凋亡起到保護作用，對高糖引起神經(jīng)元損傷的研究具有較大意義。Li等[12]通過大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素通過調(diào)節(jié)Nrf2介導的氧化應激和NF-κb介導的炎癥反應來保護糖尿病小鼠的心臟組織。中藥是一個高度復雜的系統(tǒng)，含有大量的成分，中藥的治病作用是多種成分共同作用的結果。從調(diào)控網(wǎng)絡中也可以發(fā)現(xiàn)，消渴平合劑的多個化合物具有相同的靶點，或許可以提供協(xié)同效應。

我們將消渴平合劑治療糖尿病的靶點進行生物過程、細胞成分和分子功能三方面進行GO富集分析，研究結果表明生物過程方面主要涉及細胞對脂多糖、細菌源分子和金屬離子以及氧化應激的反應；細胞組分方面主要涉及RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子復合體、膜區(qū)域、突觸前膜、突觸后膜；分子功能主要涉及類固醇激素受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、細胞因子受體活性。胰島β細胞去分化被認為是T2DM胰島素分泌功能損傷的重要機制。諸多不同基因與蛋白信號途徑皆對胰島β細胞的損傷具有調(diào)節(jié)作用。有研究表明[13]，降糖三黃片可以通過下調(diào)Galectin-3、TIMP-1，抑制胰島β細胞去分化，保護胰島β細胞功能。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)Foxo1可以在細胞核內(nèi)競爭結合Pdx-1，基因的啟動子上游抑制轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制胰島β細胞的增殖。因此，消渴平合劑可能通過干擾這些生物學過程來調(diào)控胰島β細胞。

中藥復方具有多組分、多靶點、多途徑作用的特點。本研究中確定了186個顯著富集的通路，包括AGE-RAGE通路、凋亡、內(nèi)分泌抵抗以及與IL-17、病毒感染等。AGEs是在高糖環(huán)境下的代謝產(chǎn)物，RAGE是低親和力模式識別受體家族的重要成員，AGE-RAGE通過激活下游PI3K/AKT、Jak-STAT等信號通路來誘發(fā)炎癥、氧化應激和細胞凋亡等，對糖尿病腎臟細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞等均有影響[15]。我們有理由推測，消渴平合劑可能是通過抑制AGEs-RAGE通路激活下游通路，減少炎癥、氧化應激等相應靶細胞的損傷，從而減少糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)了與病毒感染相關的幾個信號通路的富集。有學者通過研究發(fā)現(xiàn)[16]病毒感染與糖尿病的發(fā)生也有一定的關系，病毒感染可能通過干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導、促進胰島素抵抗而影響疾病的進程。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)結腸癌、肺癌、乙肝等也顯著富集，提示這些通路與糖尿病也有一定的關聯(lián)性。

4 小結

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法預測消渴平合劑治療糖尿病的作用機制和分子靶點。槲皮苷、木犀草素、山奈酚調(diào)節(jié)與糖尿病相關的大多數(shù)靶點。消渴平合劑可能通過細胞對氧化應激、轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞凋亡等特定的生物學過程及相關的如AGE-RAGE、IL-17等信號通路來起到調(diào)節(jié)作用。JUN、TP53、MYC、STAT3、MAPK14、MAPK3、AKT1是消渴平合劑治療糖尿病的關鍵基因。