不同光照模式對卷枝毛霉類胡蘿卜素合成及相關基因表達的影響

孫麗娟，池銘，馬立杰，趙婧，周宏勝，2，3，凌軍，2，3，羅淑芬，2，3，周鑫，李國鋒，2，3，李鵬霞，2，3，4，張映曈，2，3*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.江蘇省農業科學院農業設施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；3.農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，江蘇 南京 210014；4.江蘇省高校園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014）

類胡蘿卜素是自然界廣泛存在的一類天然色素，包括β-胡蘿卜素、番茄紅素和葉黃素等[1]，是天然的強效抗氧化劑和自由基清除劑，具有保護視力[2]、預防肝硬化、肝癌[3]、提高自身抵抗力[4]等功效。目前，類胡蘿卜素的來源主要包括植物和微生物。相較于受季節影響大、生產成本高的植物來源，高效、低成本的微生物來源在未來的產業應用中極具潛力。藻類、真菌、細菌等微生物均能生產類胡蘿卜素，其中利用較多的是接合真菌[5-6]。在接合真菌中，卷枝毛霉（Mucor circinelloides）發酵條件簡單，有清晰的遺傳背景和完善的遺傳操作體系，常用作研究真菌類胡蘿卜素代謝機制的模式菌株[7]。

光是一種重要的環境因子，參與調控大多數物種的生長發育和生理過程，是真菌光反應機制所必需的信息源[8]。在許多生物體中，類胡蘿卜素的生物合成均受到光照調控[9-11]，在卷枝毛霉[12-13]、糞生糞殼菌（Sordaria fimicola）[10]、三孢布拉霉（Blakeslea trispora）[14]等微生物中光照均能促進次級代謝產物類胡蘿卜素的合成。在研究光照對類胡蘿卜素合成的影響時，所采用的光照模式大多是“持續恒定光照”[15]。然而，近期有研究發現非持續恒定光照可能對真菌類胡蘿卜素合成有積極的影響。例如，在三孢布拉霉中，高強度脈沖藍光照射（在黑暗培養結束后的12、24、36 h進行2 min的7.3 W/m2藍光照射，其余時間在黑暗條件下培養）誘導類胡蘿卜素合成的效果明顯[14，16]；在鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）中發現光暗周期的光照模式比持續增強和持續恒定的光照模式更能促進β-胡蘿卜素的積累[17]。這可能與生物為保持內環境穩態形成的一種內在“光適應”機制有關。即生物體受到持續一段時間的光刺激后，為保持內環境穩態系統的輸出水平又恢復到刺激之前[18-20]。這種現象在動植物和藻類中普遍存在，例如脊椎動物視覺系統對強光線照射的適應[18]、集胞藻PCC 6803（Synechocystic sp.PCC 6803）接受持續光照后葉綠素合成相關基因被明顯抑制[21]等。因此，推測作為最明顯的光應答反應，類胡蘿卜素代謝在“光適應”作用下面對持續和非持續恒定光照可能會呈現不同的應答模式[22]。

綜上所述，光信號對類胡蘿卜素合成的調控作用是一個復雜的過程，不同光照模式對類胡蘿卜素合成影響不同。在模式菌株卷枝毛霉中，目前的研究主要集中于持續光照對不同菌株類胡蘿卜素產量的影響[23-24]，有關不同光照模式及過程中可能產生的“光適應”對類胡蘿卜素產量及其代謝過程的研究尚未見報道。因此，本研究以卷枝毛霉CBS 277.49菌株為對象，研究不同光照模式下類胡蘿卜素產量的變化，并從基因水平解析不同光照模式及過程中可能產生的“光適應”對卷枝毛霉類胡蘿卜素代謝機制的影響，為闡明真菌類胡蘿卜素合成光誘導機制奠定基礎，同時為類胡蘿卜素工業發酵模式提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：卷枝毛霉（Mucor circinelloides）CBS 277.49。

YPG固體培養基[25]：1%蛋白胨、0.3%酵母提取物、2%葡萄糖和2%瓊脂粉，115℃下高壓滅菌21 min。用于菌株活化和產孢。

YNB固體培養基[26]：1.5 g/L硫酸銨、1.5 g/L谷氨酸、0.5 g/L酵母氮源、10 g/L葡萄糖、20 g/L瓊脂粉，115℃下高壓滅菌21 min后室溫25℃添加煙酸/硫胺素至1 μg/mL。用于菌體培養合成類胡蘿卜素。

β-巰基乙醇（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（分析純）：上海凌峰化學試劑有限公司；石油醚（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNAprep pure Plant Kit提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；HiScriptIII RT SuperMix for qPCR cDNA合成試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（PL202-L）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；全自動高壓滅菌鍋（IMJ-54A）：施都凱儀器設備（上海）有限公司；液氮研磨器（A11 Basic）：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1102）：上海天美科學儀器有限公司；真空冷凍干燥機（SCIENTZ-10ND）：寧波新芝生物科技股份有限公司；基因擴增儀（EDC-810）：東勝國際貿易有限公司；熒光定量聚合酶鏈式反應儀（CFX connect）：美國Bio-Rad公司；核酸蛋白測定儀（BioPhotometer plus）：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養條件

將卷枝毛霉（Mucor circinelloides）CBS 277.49菌液接種于YPG固體培養基，（26±2）℃活化24 h，轉移至光照條件產孢。用無菌水沖洗菌絲，經濾膜過濾后得到孢子液。通過血球計數板進行計數，并使用無菌水調整孢子懸浮液濃度為107個/mL。將孢子液接種至YNB固體培養基，于（26±2）℃黑暗培養60 h后進行不同光照模式處理。光照模式：1）黑暗處理：全程在黑暗條件下培養24 h；2）持續恒定藍光照射處理：在1 000 Lux藍光下持續照射培養24 h；3）光暗交替處理：采用藍光/黑暗間斷照射，光暗周期比為6 h∶6 h∶6 h ∶6 h，光照強度為 1 000 Lux；4）逐步提高光照強度：采用藍光照射，起始光強為250 Lux，之后每6 h提高250 Lux，至24 h。對應的光照時間軸如圖1所示。以上每種處理重復 3次，取樣時間點為 0、6、12、18 h和 24 h。收獲的菌絲立即用液氮冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱，以便于后續試驗。

圖1 不同光照模式對卷枝毛霉CBS 277.49類胡蘿卜素合成的影響試驗設計Fig.1 Experimental design of different light treatments on carotenoid biosynthesis in Mucor circinelloides CBS 277.49

1.3.2 生物量的測定

收集經不同光照模式處理后第0、6、12、18 h和24 h的菌絲體，使用真空冷凍干燥機凍干（-40℃、12 h）并且稱重。

1.3.3 類胡蘿卜素的分離與測定

類胡蘿卜素含量的測定采用紫外分光光度計法[26]，具體步驟：取0.02 g凍干樣品，加入2 mL甲醇和4 mL石油醚，渦旋振蕩；2 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液，轉移至干凈的離心管中；在原離心管中繼續添加2 mL石油醚抽提至菌體無色，合并石油醚層，體積記為V。測定溶液在453 nm處的吸光度A453。

式中：A453為溶液在453 nm處的吸光度；D為稀釋倍數；V為提取所用石油醚體積，mL；0.259 2為消光系數；m為樣品質量，g。

1.3.4 類胡蘿卜素合成相關基因相對表達量的測定

1.3.4.1 RNA的提取及cDNA的合成

取適量菌絲用液氮充分研磨，按照RNAprep pure Plant Kit提取試劑盒說明書提取RNA。提取完成后使用核酸蛋白測定儀和凝膠電泳檢測RNA的濃度和質量。以檢驗合格的RNA為模板，采用HiScriptIII RT SuperMix for qPCR cDNA合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成。

1.3.4.2 實時熒光定量分析

選用actin作為內參基因，測定mcwc-1c、carB和carRP基因在不同處理不同時期菌絲的相對表達量。使用熒光定量聚合酶鏈式反應儀進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試驗，反應體系（20 μL）為 10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ；0.4 μL 上游引物；0.4 μL下游引物；2 μL cDNA 模板；7.2 μL ddH2O。反應程序：95℃預變性 30 s；95℃變性 10 s；60℃退火 30 s；65℃延伸5 s；39個循環。引物序列信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.4 數據統計

所有數據進行3次平行測定，2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，采用Excel 2010、GraphPad Prism 8.4.2軟件進行數據處理及畫圖，使用SPSS 20.0單因素方差分析（one-way ANOVA）進行顯著性分析（P＜0.05為差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 不同光照模式對卷枝毛霉CBS 277.49菌落顏色和生物量的影響

光照處理對卷枝毛霉菌落形態有明顯影響。黑暗處理組的卷枝毛霉菌落無明顯的色素沉積，呈現白色。與黑暗處理相比，3組光照處理的菌落顏色均從白色轉變為橙黃色或暗黃色，暗示類胡蘿卜素的積累。其中，持續恒定的藍光照射處理后類胡蘿卜素即開始積累，表現出明顯的橙黃色；培養后期（12 h后）色素積累速度減緩，菌落外周形成淡黃色環狀菌帶。光暗交替處理組菌落呈年輪狀生長，24 h時呈現中心橙黃色、外圈淡黃色的形態。逐步提高光強模式下菌落內側顏色隨著培養時間延長而逐漸加深，培養結束時內側呈現暗黃色，外周有一圈新鮮的菌絲帶。生物量的測定結果見圖2。

圖2 不同光照模式下卷枝毛霉CBS 277.49的生物量Fig.2 Biomass of Mucor circinelloides CBS 277.49 exposed to different light treatments

由圖2可知，4種處理在6 h時生物量均明顯積累，隨后增長速度減緩。24 h時黑暗處理的生物量為（39.67±0.88）mg，而3個光照處理組積累的生物量均顯著高于黑暗處理（P＜0.05）。6 h～12 h持續恒定光照處理組的生物量顯著大于逐步提高光強處理組（P＜0.05），18 h后持續恒定光照處理組生物量的積累速度開始減緩，與其他兩組光照處理沒有明顯差異。至24 h時，光暗交替和逐步提高光強處理組生物量高于持續恒定的藍光處理組。

2.2 不同光照模式對卷枝毛霉CBS 277.49類胡蘿卜素含量的影響

不同光照模式下類胡蘿卜素含量變化趨勢如圖3所示。

圖3 不同光照模式下卷枝毛霉CBS 277.49類胡蘿卜素含量隨時間變化Fig.3 Carotenoid content of Mucor circinelloides CBS 277.49 exposed to different light treatments for different time periods

由圖3可知，黑暗處理組在培養過程中卷枝毛霉CBS 277.49的類胡蘿卜素積累緩慢，持續恒定光照處理組的類胡蘿卜素含量呈現先升高后下降的趨勢，光暗交替和逐步提高光強處理組則呈現持續上升趨勢。其中持續恒定光照處理組類胡蘿卜素含量在前6 h急劇增加，6 h～12 h時仍然保持上升趨勢，但上升速率低于前6 h。至12 h時，類胡蘿卜素含量達到峰值（3 599.30±111.77）μg/g，分別為光暗交替處理組、逐步提高光強處理組和黑暗處理組的1.21、1.65倍和22.07倍。然而，在12 h后持續恒定光照處理組的類胡蘿卜素積累呈現持續下降趨勢，至培養結束（24 h）時，含量僅為（1 915.90±95.83）μg/g。光暗交替處理組在前6 h類胡蘿卜素積累速率與持續恒定光照處理組類似，6 h后逐步下降，但類胡蘿卜素含量總體呈上升趨勢。逐步提高光強處理組的類胡蘿卜素積累速率在前6 h顯著低于光暗交替處理組（P＜0.05），雖然6 h后類胡蘿卜素含量明顯提升，但類胡蘿卜素含量仍顯著低于光暗交替處理組（P＜0.05）。培養24 h時，4個處理組類胡蘿卜素含量差異顯著（P＜0.05），類胡蘿卜素含量結果為光暗交替處理組＞逐步提高光強處理組＞持續恒定光照處理組＞黑暗處理組。以上數據表明，藍光能夠促進卷枝毛霉CBS 277.49的類胡蘿卜素合成，持續光照處理組在前期促進作用明顯，至培養結束（24 h）時，光暗交替處理組效果最佳，類胡蘿卜素含量達（3 728.78±48.09）μg/g。

2.3 不同光照模式對卷枝毛霉CBS 277.49中光感受器MCWC-1C編碼基因表達的影響

mcwc-1c基因編碼的MCWC-1C蛋白為藍光感受器，能夠感知藍光信號并激活下游類胡蘿卜素合成[27]。對卷枝毛霉CBS 277.49分別實施黑暗、持續恒定、光暗交替和逐步提高光強4種不同的藍光照射，不同光照模式下卷枝毛霉CBS 277.49藍光感受器編碼基因mcwc-1c表達水平隨時間變化結果見圖4。

圖4 不同光照模式下卷枝毛霉CBS 277.49藍光感受器編碼基因mcwc-1c表達水平隨時間變化Fig.4 Expression of mcwc-1c in Mucor circinelloides CBS 277.49 exposed to different light treatments for different time periods

由圖4可知，黑暗處理組mcwc-1c基因在培養期間一直保持低表達，而光照處理組則有不同程度變化。培養前期（0～6 h），在1 000 Lux藍光照射下，持續恒定光照組和光暗交替照射組mcwc-1c基因表達量明顯提升，為黑暗處理組的2.79倍和2.73倍，同時明顯高于逐步提高光強處理組（250 Lux藍光照射）；6 h后持續恒定光照處理組mcwc-1c基因表達量明顯下降，至培養結束（24 h）時，與黑暗處理組表達量相當，為光暗交替和逐步提高光強處理組的61.77%和50.16%。在整個培養期間，光暗交替處理組mcwc-1c基因表達量呈波動趨勢，在6 h時表達量最高。逐步提高光強處理組mcwc-1c基因表達量在培養前期呈緩慢上升趨勢，培養后期仍以較高水平表達，24 h時逐步提高光強處理組基因表達量和光暗交替處理組沒有顯著差異（P＞0.05）。以上結果表明，藍光能夠激活mcwc-1c的表達，且光強越強，激活作用越明顯；隨光照時間延長，持續恒定光照組mcwc-1c基因表達量水平明顯下降；光暗交替和逐步提高光強處理組mcwc-1c在整個培養期內保持較高水平的表達。

2.4 不同光照模式對卷枝毛霉CBS 277.49中類胡蘿卜素合成結構基因表達的影響

編碼八氫番茄紅素脫氫酶的carB基因以及編碼八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環化酶的carRP基因是卷枝毛霉類胡蘿卜素合成的關鍵結構基因[23，28-29]，藍光照射模式下受MCWC-1C的強烈誘導表達[30]。不同光照模式對卷枝毛霉類胡蘿卜素合成結構基因carB和carRP表達量的影響見圖5。

圖5 不同光照模式對卷枝毛霉類胡蘿卜素合成結構基因carB和carRP表達量的影響Fig.5 Expression of carB and carRP involved in carotenoid biosynthesis of Mucor circinelloides CBS 277.49 exposed to different light treatments

由圖5A可知，3組光照處理后carRP基因表達量與黑暗處理組相比均顯著增加（P＜0.05），且隨培養時間的延長均表現出先升高后降低的趨勢。培養前期（0～6 h），持續恒定光照處理組和光暗交替處理組carRP基因表達量明顯增加，12 h時達到峰值，為逐步提高光強處理組的1.88倍和1.68倍，為黑暗處理組的4.13倍和3.69倍。3組光照處理組在18 h的基因表達量均有所下降，其中持續恒定光照組下降最為明顯，其基因表達量僅為12 h的55.97%。18 h后，持續恒定光照組carRP基因表達量繼續下降，至24 h時僅為光暗交替處理組和逐步提高光強處理組的41.27%和40.53%。此時光暗交替和逐步提高光強處理組的carRP表達量與6 h相當。

由圖5B可知，結構基因carB表達量的變化與carRP基因類似，表明持續恒定的藍光照射在0～12 h顯著提高了carB基因的表達（P＜0.05）。12 h時，其表達量分別為黑暗處理組、光暗交替處理組和逐步提高光強處理組的2.68、2.98倍和2.05倍。12 h后持續恒定光照處理組carB基因的表達量驟然降低，至24 h時與黑暗處理組表達量相當。光暗交替處理組carB基因的表達量在培養期間呈現波動趨勢，在12 h后顯著高于持續恒定光照處理組（P＜0.05），與逐步提高光強處理組無明顯差異（P＞0.05）。逐步提高光強組carB基因始終以較高水平表達。以上結果表明，光照明顯上調了類胡蘿卜素合成結構基因的表達；12 h后持續恒定光照處理組結構基因表達量明顯下降；光暗交替和逐步提高光強處理組結構基因在培養后期雖然有所下降，但仍以較高水平表達。

3 討論與結論

本試驗以卷枝毛霉CBS 277.49為試驗材料，研究了不同光照模式對其生長發育和類胡蘿卜素合成的影響。結果表明，持續恒定、光暗交替、逐步提高光強的藍光處理下卷枝毛霉菌絲生物量較黑暗處理均顯著增加，說明光照在一定程度上能對卷枝毛霉的生長起調控作用，這與Luo等[31]研究的脈沖藍光照射能夠促進三孢布拉霉的生長，使其生物量明顯提升的結果一致。在類胡蘿卜素合成方面，黑暗處理組菌落顏色呈白色，而3種藍光處理組的菌落顏色為淡黃色或橙黃色。通過類胡蘿卜素含量的測定證實：3種光照處理組的類胡蘿卜素含量與黑暗處理組相比明顯提高。其中，持續恒定光照處理組類胡蘿卜素產量呈現先升高后下降的趨勢，而光暗交替和逐步提高光強處理組在12 h后繼續積累類胡蘿卜素，至24 h時兩組的類胡蘿卜素含量分別達到峰值。類似的結果在其他物種中也有報道[32-33]，例如在三孢布拉霉中，1.5 W/m2藍光照射0.5 h能夠產生大量的類胡蘿卜素，延長藍光照射時間不僅不能繼續促進類胡蘿卜素合成，還會影響三孢布拉霉中光反應，類胡蘿卜素合成停滯[29]。在鹽生杜氏藻中進行不同光照周期的培養，結果發現持續恒定的光照模式下類胡蘿卜素產量在培養前3 d明顯增加，之后保持平穩；而在14 h光照10 h黑暗的光照周期培養下類胡蘿卜素含量持續增加，與持續恒定光照模式相比提高了17.96%[17]。基于以上結果，推測在培養過程中進行持續恒定藍光照射使卷枝毛霉類胡蘿卜素合成出現了“光適應”，表現為受到外界光刺激后類胡蘿卜素含量驟然上升，但在一段時間之后類胡蘿卜素合成水平又恢復到刺激之前，阻礙了類胡蘿卜素的高水平積累。產生“光適應”的原因可能是因為持續高強度光照產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），對菌體造成氧脅迫，因而會消耗活性氧簇清除劑類胡蘿卜素來抵御ROS[16]。光暗交替和逐步提高光強的光照模式則因為光強隨時間不斷發生變化而變化，不易產生“光適應”，因而能夠繼續刺激類胡蘿卜素的合成。但光暗交替和逐步提高光強處理組后期的類胡蘿卜素積累速率逐漸下降，這可能是因為在該處理下菌體內也會積累一定的ROS。

為了進一步探索不同光照模式對類胡蘿卜素合成的作用機制，測定了類胡蘿卜素合成相關基因表達量。結果表明，在持續恒定的光照處理中，mcwc-1c基因受到強烈的藍光刺激后表達量顯著上調，光照持續12 h后，mcwc-1c基因的表達迅速降低。這種現象在Krobanan等[10]的研究中也有類似的報道，糞生糞殼菌中藍光感受器編碼基因Sfwc-1在光照刺激下表達量逐漸增加，60 min后基因的表達量開始下降。在糙脈孢霉（Neurospora crassa）[22]中，恒定光照 2 h后 wc-1 基因下調，藍光感受器WC-1蛋白合成受到抑制。光暗交替處理和逐步提高光強處理由于波動的光照模式，未產生“光適應”，12 h后mcwc-1c基因繼續以較高水平表達。下游類胡蘿卜素合成結構基因的表達受藍光感受器MCWC-1C調控影響類胡蘿卜素合成[34]。在本研究中，持續恒定藍光處理12 h后mcwc-1c基因表達明顯下調，導致結構基因carB和carRP基因表達量明顯降低。而光暗交替和逐步提高光強處理組由于mcwc-1c在12 h后仍以較高水平表達，carB和carRP也相應地保持較高的表達水平量，兩者之間差異不明顯，但因為培養前期光暗交替處理組具有較高含量的carB和carRP mRNA，因此光暗交替處理組的類胡蘿卜素終產量最高。該結果與不同光照模式下三孢布拉霉生產β-胡蘿卜素的結果一致，即過長的光照時間和過高的光照強度導致類胡蘿卜素合成結構基因出現短暫的高表達后迅速降低，間斷的藍光照射模式大幅度提升了類胡蘿卜素合成結構基因的轉錄水平，這種誘導效果能夠維持48h，對菌體類胡蘿卜素積累的促進效果最為明顯，是生產β-胡蘿卜素的最佳條件[14]。

研究結果表明卷枝毛霉在持續恒定光照12 h后產生“光適應”，類胡蘿卜素合成相關基因表達量均明顯下降，類胡蘿卜素合成停滯。光暗交替和逐步提高光強兩種光照模式避免了“光適應”的產生，能夠保持結構基因以較高水平表達，使類胡蘿卜素持續積累。在本試驗考察光強和培養時間范圍內，光暗交替處理組的類胡蘿卜素終產量最高。以上研究結果為未來微生物發酵法類胡蘿卜素的工業化生產提供新思路，同時為闡明真菌類胡蘿卜素合成光誘導機制奠定基礎。