超聲波輔助pH偏移處理對豬肝蛋白結構及乳化特性的影響

陸今明，彭松林，楊凱麟，耿宏慶，尚永彪，2*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶 400715）

豬肉是全球消費最多的肉類產品，與此同時豬肝、豬肺等副產品產量也隨之增加。豬肝中蛋白質含量高達20%且富含必需氨基酸，營養價值高。但因豬肝具有特殊的腥味且嘌呤和膽固醇含量較高，因此，在實際工業生產中豬肝通常會被加工成飼料，在食品工業中也僅有少量被加工成豬肝糜和豬肝香腸等產品，這影響了豬肝的開發利用，其價值難以得到充分的體現。豬肝蛋白（porcine liver protein，PLP）是豬肝的主要成分，豬肝蛋白資源的有效利用是豬肝資源開發的關鍵。然而，有研究報道從肝臟中分離的蛋白功能特性較差[1]，蛋白質的加工過程通常需要熱力干燥，因此會進一步降低其功能特性，阻礙了其在食品中的應用。

為擴大天然食品中蛋白質的應用，通常會采用物理、化學和生物方法改善蛋白功能特性。其中，超聲波被認為是改變液體介質中食品成分性質的一種非熱處理加工技術，超聲過程中產生的空化作用會改變蛋白質結構，空化和湍流的結合能減小蛋白的粒徑，且與傳統的熱處理相比，超聲對加工食品的營養和感官影響更小。丁景[2]研究超聲波對水溶性豬肝蛋白乳化特性的影響，發現隨著超聲波功率升高和時間延長，水溶性豬肝蛋白的乳化活性及其穩定性均表現先增加后減小趨勢。除物理處理外，pH偏移處理也能改變蛋白的結構及功能特性。pH偏移處理是將蛋白質暴露在堿性或酸性條件下一段時間使蛋白質發生去折疊，然后調節pH值至中性，使蛋白質發生重折疊，重新折疊的蛋白質往往不能恢復到原本構象，從而引起蛋白質結構與功能的變化。pH偏移處理是一種通過改變電荷的方式來調控蛋白分子間及分子內靜電排斥作用力，從而使蛋白發生結構改變的化學修飾方法。pH偏移技術對蛋白的營養價值破壞較小，過程操作簡單，參數易于控制。目前pH偏移處理技術的研究多用于植物蛋白改性領域[3]，在動物內臟蛋白質改性中的應用研究相對較少。Lu等[4]研究肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）在 pH11-7、pH11.5-7和 pH12-7堿性 pH 偏移條件的界面流變性能，結果表明與未處理MP相比，重折疊MP的分子變化導致蛋白質向O/W界面的吸附速度加快，被吸附的蛋白分子間相互作用增強，界面膜的彈性提高，表明堿性pH偏移調控界面行為可能是一種適用于食品工業中肉蛋白乳劑的開發方法。Lu等[1]研究不同pH值條件下琥珀酰化雞肝蛋白（chicken liver protein，CLP）結構與乳化特性之間的關系，結果表明隨著pH值的升高，CLP的溶解度和吸油能力增加，有利于其乳化性能的改善。

本研究將超聲波改性處理與pH偏移改性處理相結合，測定改性PLP的溶解度、表面疏水性、乳化特性、巰基含量、粒徑、Zeta電位、一級和三級結構等指標及其變化情況，為豬肝資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮豬肝：市售；透析袋（分子截留量8 000 Da～14 000 Da）：北京怡美妙科技有限公司；一級玉米油：山東三星玉米科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 試劑

無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、5，5'-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）、考馬斯亮藍R-250：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、甲醇、無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；鹽酸、酒石酸鉀鈉、冰醋酸：寧波大川精細化工有限公司；五水硫酸銅：廣東光華科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨：上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、牛血清蛋白：德國Biofroxx公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-16高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；JS39D-250多功能食品加工機：浙江蘇泊爾股份有限公司；XHF-D內切式勻漿機、SCIENTZ-1500F超聲波分散儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；EMS-20磁力攪拌水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；PowerPacTM Basic小型垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司；LGJ-10真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；PHS-4C+酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；F-2500熒光分光光度計：日本日立公司；BX53熒光正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬肝蛋白的提取

參照Steen等[5]的方法并稍作修改。用絞肉機將豬肝打成豬肝泥，隨后加入3倍體積的由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配制而成的緩沖溶液（0.05 mol/L、pH7.4），用勻漿機以10 000 r/min勻漿1.5 min；將勻漿物離心20 min（9 000 r/min、4℃）后過 4層紗布收集濾液，所得沉淀用絞肉機攪碎后繼續加入緩沖溶液，重復上述操作2次，將3次所得的濾液合并后用透析袋透析脫鹽48 h（4 h換水1次），冷凍干燥60 h即為豬肝蛋白，通過凱氏定氮法測定蛋白含量（N以6.25計算）為（87.67±0.80）g/100 g，用密封袋將PLP封好后置于-18℃冰箱保存備用。

1.3.2 豬肝蛋白濃度的測定

參考Cui等[6]的試驗方法，使用雙縮脲試劑測定PLP溶液蛋白質濃度。

1.3.3 樣品處理

用超純水配制10 mg/mL PLP溶液，冰水浴磁力攪拌30 min使其充分溶解。

pH偏移處理：用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH分別將PLP溶液的pH值調節至3和9，在冰水浴磁力攪拌下處理30 min，然后用相應的堿或酸將pH3和pH9的蛋白溶液pH值調至7，冰水浴磁力攪拌下平衡15 min，將處理樣品記為pH3-7和pH9-7。

超聲波處理：將蛋白溶液進行超聲波處理，超聲波頻率為20 kHz，變幅桿直徑15 mm，超聲功率300 W，超聲程序為工作3 s，停止3 s，處理總時長5 min。超聲波處理過程中對樣品進行冰浴降溫處理，處理完畢后蛋白樣品溫度均在30℃以下，記為U。

超聲波輔助pH偏移處理：將蛋白溶液pH值調整為3和9后進行超聲波處理，隨后用相應的堿或酸將溶液pH值調至7。冰水浴磁力攪拌下平衡15 min，記為pH3U-7和pH9U-7。

對照：蛋白溶液pH值調整為7后，在冰水浴磁力攪拌30 min。

所有處理完畢的蛋白樣品用塑封膜封口，置于4℃冰箱保存，72 h內使用。

1.3.4 蛋白溶解度的測定

參考Agyare等[7]的方法。將處理過的PLP溶液用超純水稀釋成2.5 mg/mL，冷凍離心15 min（5 500 r/min、4℃），取上清液，用雙縮脲法測定PLP溶解度。將離心前溶液中蛋白的濃度和離心后上清液蛋白的濃度（mg/mL）分別命名為C0和C1，蛋白溶解度計算公式如下。

1.3.5 表面疏水性的測定

參考 Yu 等[8]方法，采用 8-苯氨-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法測定PLP的表面疏水性并稍作修改。將PLP溶液濃度調至0.25 mg/mL，于4.0 mL蛋白溶液中加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液，避光振蕩均勻15 min后，用熒光光度計測定其熒光強度。設定激發波長390 nm，發射波長400 nm～600 nm，兩種狹縫寬度均為5 nm，電壓為400 mV。

1.3.6 乳化活性指數的測定

參考Pearce等[9]和Agyare等[7]的方法并稍作修改。配制2.5 mg/mL蛋白溶液，取2.0 mL大豆油和6.0 mL蛋白溶液于塑料離心管中，10 000 r/min勻漿30 s后立即從離心管底部吸取50 μL乳液，加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，混合均勻后用紫外可見分光光度計在500 nm處測定其吸光度，記作A0。以50 μL超純水加入5 mL 0.1%SDS溶液作為空白對照。PLP乳化活性指數（emulsifying activity，EAI）計算公式如下。

式中：ρ為油相體積分數（油的體積/乳化體系的體積）；φ為蛋白質濃度，0.0025g/mL；A0為乳化液在0 min時的吸光度；稀釋倍數為101。

1.3.7 乳液穩定性的測定

參考Lu等[1]的方法并稍作修改，使用紫外分光光度計于500 nm處測定30 min乳液的濁度（A500）值，以此來表示乳液的乳化穩定性。

1.3.8 乳液光學顯微鏡觀測

從均質好的乳液底部立即取出10 μL乳液置于熒光正置顯微鏡下，在10倍目鏡、10倍物鏡的視野條件下觀察并拍照。

1.3.9 活性巰基的測定

參考Beveridge等[10]與Gao等[11]的方法測定PLP中的游離巰基含量，并稍作修改。將PLP用緩沖液[0.086 mol/L三羥甲基氨基甲烷、0.09 mol/L甘氨酸和4 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），pH8]稀釋為濃度 1 mg/mL 的蛋白溶液。將3 mL蛋白溶液與0.03 mL 4 mg/mL 5，5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸[5，5'-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DNTB]溶液振蕩混勻，于30℃避光水浴30 min，使用紫外分光光度計于412 nm測定吸光度，以緩沖液和蛋白溶液為空白，活性巰基含量計算按公式如下。

式中：A412為蛋白溶液在412 nm處的吸光度；D為稀釋因子；C為蛋白質濃度，1 mg/mL；73.53由 106/1.36×104計算，其中 1.36×104為摩爾吸收率。

1.3.10 粒徑分布及Zeta電位的測定

參考吳佳[12]的方法并稍作修改。將所有樣品用超純水分別配制成1 mg/mL PLP溶液，用粒度分析儀測定，記錄其粒徑分布。Zeta電位測定：將所有樣品稀釋成1 mg/mL PLP水溶液，用粒度分析儀測定其電位。

1.3.11 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的測定

參考Li等[13]的方法并適當修改。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒制作濃度分別為12%、5%的分離膠與濃縮膠。將蛋白樣品（2.5 mg/mL）與上樣緩沖液按體積比4∶1混合密封后，于100℃煮沸5 min后待其自然冷卻。取20 μL注入濃縮膠泳道中，濃縮電壓為60 mV，分離電壓為80 mV。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色，然后脫色并使用照相機拍照。

1.3.12 紫外可見分光光譜的測定

參考王立等[14]的方法并稍作修改。配制0.25mg/mL PLP溶液，在室溫25℃條件對PLP溶液進行紫外可見光譜掃描，以超純水的光譜作為空白光譜。紫外條件：掃描范圍200 nm～500 nm，掃描速度300 nm/min，步長1 nm。

1.3.13 熒光光譜的測定

參考Gao等[11]的方法并稍作修改。用超純水配制0.25 mg/mL PLP溶液，用熒光分光光度計對PLP溶液三級結構進行分析。熒光條件：光程為1 cm的石英比色皿，激發波長為280 nm，發射光譜范圍為300 nm～460 nm，激發和發射狹縫寬度為5 nm，電壓為400 mV，掃描速度為300 nm/min。

1.3.14 數據處理

每個處理組進行3次平行試驗，結果以平均值±標準差表示。Excel 2016進行數據處理，Origin 2018 pro軟件進行繪圖，SPSS Statistics 25.0進行顯著性分析，P＜0.05表明結果具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助pH偏移處理對PLP溶解度的影響

蛋白質溶解度與蛋白質乳化性等功能特性密切相關，溶解度是蛋白其他功能性質的基礎。不同處理對PLP溶液溶解度的影響試驗結果見圖1。

圖1 超聲波輔助pH偏移處理對PLP溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on solubility of PLP

由圖1可知，不同pH偏移處理對PLP的溶解度有不同的影響，與對照組溶解度（41.76%）相比，pH9-7組溶解度顯著增加至53.60%（P＜0.05），其原因可能是堿性條件下破壞了蛋白的疏水相互作用，從而提升了蛋白溶解度；而pH3-7組使PLP溶解度顯著降低（P＜0.05），原因可能是酸性環境下，蛋白分子為適應環境發生了去折疊現象，在pH值調回中性的重折疊過程中，經過等電點時，蛋白顆粒間相互碰撞、聚集沉淀，形成較大顆粒，繼續調回中性時的電荷作用不足以使沉淀的蛋白再次溶解，從而降低了PLP的溶解度[15]。中性條件下進行超聲處理，PLP溶解度顯著提升至72.89%（P＜0.05）；經過酸性pH偏移處理的2個處理組中，超聲處理組與未超聲處理組相比，PLP溶解度有所提高但無顯著差異（P＞0.05）；經過堿性pH偏移處理的2個處理組中，超聲處理組與未超聲處理組相比，PLP溶解度得到顯著提升（P＜0.05），且與對照組相比PLP的蛋白質溶解度提高了近1倍，其原因可能是由于空化作用產生機械沖擊導致蛋白質結構部分展開，使疏水和靜電相互作用以及氫鍵等非共價相互作用遭到破壞，并且增強蛋白質和水分子之間相互作用[16]。以上結果表明，堿性pH偏移過程中結合超聲波處理，在提升蛋白溶解度方面具有協同作用。此試驗結果與Silventoinen等[17]研究pH偏移和超聲處理對大麥分離蛋白溶解度的影響中得到的結果類似。

2.2 超聲波輔助pH偏移對PLP表面疏水性的影響

表面疏水性的大小與蛋白質乳化特性密切相關，可以利用蛋白質暴露的疏水氨基酸殘基含量來表征蛋白質的疏水性[18]。超聲波輔助pH偏移對PLP表面疏水性的影響如圖2所示。

圖2 超聲波輔助pH偏移處理對PLP表面疏水性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on surface hydrophobicity of PLP

由圖2可知，相較于對照組，經過處理后PLP表面疏水性提升明顯。在僅pH偏移處理中，pH3-7組的表面疏水性較pH9-7組顯著增加（P＜0.05），表明PLP可能在酸性偏移過程中變性程度更大，重折疊程度更小，從而使表面疏水基團更多的暴露于蛋白質分子表面；pH9-7組表面疏水性較對照組差異顯著（P＜0.05），但增幅不及pH3-7組，可能是因為堿性環境下PLP未嚴重變性，使PLP具有較高的重折疊程度。唐小丹[19]在研究酸或堿處理對羅非魚水溶性蛋白表面疏水性的影響時也發現，與對照組相比，酸堿處理后羅非魚蛋白表面疏水性均有提高。pH3U-7組與pH3-7組表面疏水性未表現出明顯差異，酸性條件下的超聲，使PLP更能適應酸性環境，但在pH值調回中性的重折疊過程中，依然會產生聚集沉淀。單獨超聲處理（U）、堿性pH偏移條件下超聲（pH9U-7）明顯提高了PLP表面疏水性，超聲處理的加入使原本的蛋白聚集體分散，暴露出更多的疏水氨基酸，而堿性pH偏移條件下使PLP遠離等電點而具有較高的靜電互斥作用，超聲處理使PLP表面疏水性進一步增加。類似的研究結果也出現在超聲處理豌豆蛋白[20]中。

2.3 超聲波輔助pH偏移對PLP乳化活性的影響

乳化活性（EAI）的大小表示蛋白質在界面上吸附能力的強弱，是蛋白重要的功能指標。超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳化活性的影響如圖3所示。

圖3 超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳化活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on emulsifying activity of PLP

如圖3所示，相較于對照組，堿性pH偏移蛋白（pH9-7）的EAI顯著提高（P＜0.05），而酸性pH 偏移蛋白（pH3-7）的 EAI顯著降低（P＜0.05），其原因可能是pH3-7組降低了蛋白的溶解度，使其不能更好地包裹油脂[11]；堿性pH偏移條件下的PLP有更高的溶解度，有利于蛋白質在油水界面中更均勻、有效地展開和分散，從而提高蛋白的乳化活性[8]。對照組超聲處理的加入，使PLP的乳化活性顯著提高（P＜0.05），而在pH3U-7組條件下，乳化活性相較于pH3-7組有一定程度提高，但無顯著性差異（P＞0.05），pH9U-7組的乳化活性在pH9-7組的基礎上進一步提高。研究表明，超聲波改善蛋白質的乳化活性，是因為超聲能提高溶解度，使蛋白粒徑朝著更小的方向移動[11]。

2.4 超聲波輔助pH偏移對PLP乳液穩定性的影響

超聲波輔助pH偏移處理后PLP乳液穩定性如圖4所示。

圖4 超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳液穩定性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on the stability of PLP emulsion

如圖4所示，與對照組的乳液穩定性相比，pH3-7組顯著降低了乳液穩定性（P＜0.05），pH9-7組顯著提高了乳液穩定性（P＜0.05）；在pH偏移條件下，超聲處理顯著提高了乳液穩定性（P＜0.05），且pH3U-7組的乳液穩定性低于pH9U-7組乳液穩定性。超聲處理能提高蛋白質乳液穩定性，原因可能是超聲波破壞了使蛋白聚集的非共價鍵作用力，使蛋白質結構展開，暴露出較多的疏水基團，有利于其在油-水界面中的重排、相互作用以及在油-水界面中形成更穩定的膜[11]。以上結果說明堿性pH偏移聯合超聲可以提高PLP乳液穩定性，而酸性pH偏移處理不利于PLP乳液的形成與穩定。

2.5 超聲波輔助pH偏移對PLP乳液顯微結構的影響

通過顯微鏡觀察乳液液滴能直觀了解乳液粒徑的大小及分布情況，可以用來表征乳液的穩定性。超聲波輔助pH偏移處理后PLP乳液狀態如圖5所示。

圖5 超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳液顯微結構的影響（200 μm）Fig.5 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on microstructure of PLP emulsion（200 μm）

如圖5所示，對照組乳液液滴明顯大于超聲、pH9-7組和pH9U-7組，而pH3-7組形成的液滴較對照組大而零散分布，在超聲的作用下液滴粒徑有所減小，但零散分布的狀態沒有改變。與僅堿性pH偏移處理（pH9-7）蛋白乳液相比，堿性pH偏移-超聲復合處理（pH9U-7）的蛋白乳液液滴密度大，分布均勻，粒徑范圍變窄。通常情況下制成乳液的蛋白粒徑越小，其在乳液的界面覆蓋速度越快，吸附速率越高。此結果也證明了堿性pH偏移-超聲復合處理有更好的乳液穩定性。

2.6 超聲波輔助pH偏移對PLP活性巰基的影響

超聲波輔助pH偏移處理對PLP活性巰基的影響如圖6所示。

圖6 超聲波輔助pH偏移處理對PLP活性巰基的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on active sulfhydryl group of PLP

如圖6所示，pH偏移和超聲波處理均影響PLP中活性巰基（R-SH）的含量。與對照組相比，酸、堿性pH偏移均使活性巰基含量顯著下降（P＜0.05），酸、堿性條件下R-SH含量較低可能是由于二硫鍵的產生。在酸、堿性條件下，硫代基團更容易與巰基離子發生反應，加速氧化過程。在pH偏移條件下，超聲處理后PLP中R-SH含量均有一定程度降低，但無顯著差異（P＞0.05），這可能與超聲功率、處理時間有關[20]。僅超聲處理會使活性巰基顯著下降（P＜0.05），原因可能是超聲處理能誘導二硫鍵形成，同時超聲可以使水分子產生自由基[21]，進而可以氧化敏感官能團，如將R-SH氧化成亞磺酸[22]。Pezeshk等[20]在研究pH偏移處理結合超聲波處理對虹鱒魚副產物蛋白質結構和功能特性的影響時，發現超聲波使虹鱒魚副產物蛋白中R-SH含量出現不同程度下降。Figueroa-gonzález等[23]在研究超聲輔助pH偏移處理莧菜蛋白時，也發現酸堿性pH偏移均使活性巰基顯著降低，超聲處理進一步降低活性巰基含量，與本試驗結果一致。

2.7 超聲波輔助pH偏移對PLP粒徑分布和Zeta電位的影響

超聲波輔助pH偏移對PLP粒徑分布和Zeta電位的影響如圖7所示。

圖7 超聲波輔助pH偏移處理對PLP粒徑分布和Zeta電位的影響Fig.7 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on particle size distribution and Zeta potential of PLP

蛋白質粒徑的大小會影響蛋白質的溶解度和乳化性等功能特性。如圖7A所示，對照組粒徑主要集中在100 nm～1 000 nm和1 000 nm～10 000 nm，pH3-7處理組粒徑分布范圍明顯向右移動，其原因可能是PLP在酸性環境下，為適應環境蛋白分子發生去折疊，在pH值調回中性的重折疊過程中，經過等電點時，為疏水基團聚集創造了條件使其聚集沉淀，形成較大顆粒，繼續調回中性的過程中作用力不足以使沉淀的蛋白再次溶解；也有可能是PLP內部疏水基團暴露并通過疏水相互作用等作用力形成較大聚集體。而在pH9-7組及pH9U-7組中，蛋白的粒徑分布較對照組均明顯向左移動，其原因可能是在遠離等電點的堿性pH9條件下，蛋白質之間產生了更強的靜電斥力，阻礙了蛋白質聚集物的形成，并且超聲過程中產生的空化作用力及剪切力會使得蛋白質聚集體中的非共價鍵斷裂，導致蛋白粒徑減小。研究結果與Fang等[24]發現大豆分離蛋白在pH12堿性條件和超聲處理5 min的條件下蛋白粒徑減小的結論一致。

Zeta電位可以反映溶液蛋白的表面電荷大小，通常Zeta電位絕對值較高的體系，分子間的互斥效應明顯，不易發生聚集。如圖7B所示，觀察電位絕對值發現，與對照組（20.1 mV）相比，pH3-7組電位絕對值顯著下降至17.2 mV（P＜0.05），其原因可能是PLP粒徑增大，包埋了部分帶電氨基酸；而pH9-7組電位絕對值顯著增加到22.9 mV（P＜0.05），可能是由于堿性偏移條件下蛋白側鏈結構展開，使更多的帶電基團暴露。超聲后的PLP電位絕對值均比未超聲時有所增加，可能是由于超聲處理后破壞PLP非共價鍵作用，將更多帶電氨基酸暴露在蛋白分子表面。研究結果與Li等[13]在研究超聲-pH偏移處理菜籽蛋白時電荷變化趨勢基本一致。

2.8 超聲波輔助pH偏移對PLP SDS-PAGE的影響

SDS-PAGE能表示蛋白的種類及分子量分布情況。超聲波輔助pH偏移處理后PLP SDS-PAGE結果如圖8所示。

圖8 超聲波輔助pH偏移處理對PLP SDS-PAGE的影響Fig.8 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on SDS-PAGE of PLP

如圖8所示，觀察對照組發現，PLP分子量主要集中在 10 kDa～15 kDa與 25 kDa～200 kDa，在高于 40 kDa范圍內有較深的條帶，說明PLP有較高的分子量。與對照組相比，堿性pH偏移處理（pH9-7）同對照組相比無明顯差異，而pH3-7組蛋白電泳條帶變得模糊，濃縮膠頂部有更深的條帶，推測其原因可能是酸性pH偏移處理（pH3-7）形成的二硫鍵造成了蛋白質聚集，有研究報道酸性pH偏移-超聲處理莧菜蛋白也有類似高分子量蛋白質聚集體的形成[23]。pH3-7組、pH9-7組在超聲處理后，蛋白電泳條帶沒有明顯變化，說明超聲波輔助pH偏移處理并沒有改變蛋白一級結構。在研究超聲波處理紫貽貝蛋白[25]及烏賊蛋白[26]時也發現了超聲波處理并未導致蛋白一級結構發生變化。

2.9 超聲波輔助pH偏移對PLP三級結構的影響

超聲波輔助pH偏移處理PLP紫外光譜和內源熒光光譜如圖9所示。

圖9 超聲波輔助pH偏移處理對PLP三級結構的影響Fig.9 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on the tertiary structure of PLP

紫外光譜和蛋白質內源熒光光譜的變化反映了PLP三級結構的變化情況。如圖9A所示，對照組與處理組在290 nm處出現特征吸收峰，經超聲波輔助pH偏移處理后該特征吸收峰面積發生明顯改變，峰面積大小依次為pH3-7組、pH3U-7組、對照組、U組、pH9-7組和pH9U-7組，這可能是由于PLP經過超聲輔助pH偏移處理后PLP側鏈氨基酸結構遭到破壞，導致PLP三級結構改變，從而造成了紫外光譜的變化。如圖9B所示，對照組有最大的熒光強度，pH偏移處理的蛋白熒光強度均有所下降，且pH3-7組與pH3U-7組有更低的熒光強度，其原因可能是由于酸性pH偏移較堿性pH偏移的蛋白構象變化更大[27]；也可能是由于堿性pH偏移處理的蛋白未經過等電點的沉淀，具有更高的重折疊能力，因此內源熒光強度下降較小。所有pH偏移處理條件下，超聲處理均使PLP內源熒光強度進一步降低，說明蛋白質原先的聚集狀態被進一步改變，使通常包埋在蛋白質結構內的色氨酸殘基等疏水基團暴露在周圍的親水環境中，進而發生“熒光淬滅”現象，導致其熒光強度下降。相關研究也發現pH偏移-超聲波聯合處理會使虹鱒魚副產物蛋白熒光強度降低[20]。

3 結論

本試驗主要探究超聲波輔助pH偏移處理對豬肝蛋白（PLP）結構和乳化特性的影響，以期為豬肝蛋白作為乳化劑在食品中的應用提供參考。由試驗結果可知，相較于對照組，堿性pH偏移處理提高了PLP的乳化活性及乳液穩定性，處理后的PLP粒徑減小，溶解度及Zeta電位絕對值增大，在加入超聲復合處理后PLP結構及乳化特性的這一變化更為明顯；而酸性pH偏移及超聲波輔助酸性pH偏移處理均使PLP乳化活性與乳液穩定性降低，并且導致蛋白粒徑增大，溶解度與Zeta電位絕對值下降。酸堿pH偏移及超聲復合處理均使PLP的熒光強度及活性巰基的含量降低。綜上所述，超聲波輔助堿性pH偏移處理可以改善豬肝蛋白的乳化特性，改性后的豬肝蛋白有著作為乳化劑應用于食品工業中的良好前景。