粗糙脈孢菌發酵豆渣產物的品質和抗氧化活性

趙秀芳，姚海燕，袁江蘭，康旭

（湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

豆渣是豆漿、豆腐等豆制品加工的副產物。我國每年可產生2 000多萬噸濕豆渣[1]，但新鮮豆渣水分含量高達80%[2]，不僅口感粗糙，而且極易酸化腐敗，因此，大部分豆渣經過直接干燥后用作動物飼料，也有一部分被直接丟棄[3]。分析表明，豆渣營養豐富，每100 g干豆渣含蛋白質約19.32 g、碳水化合物51.80 g、脂肪12.40 g，此外還含有大豆異黃酮、無機鹽、單糖、低聚糖和B族維生素等[4]。豆渣中還含有多種抗營養因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制劑等，直接食用可能引起腹瀉或胃腸紊亂，利用微生物發酵處理可以有效去除這些抗營養因子，因此微生物發酵可能會大幅提升豆渣品質，豐富豆渣的用途。

近年來有關豆渣發酵的研究較多，例如利用馬氏克魯維酵母發酵豆渣，豆渣粗脂肪、可溶性膳食纖維和多糖分別增加24.5%、15.8%和26.2%，植酸和胰蛋白酶抑制劑活性分別降低61.7%和92.7%，豆腥味明顯減少[5]。利用黑曲霉對豆渣進行發酵，氨基酸態氮含量為未發酵豆渣的3.23倍，纖維素酶活提升了2.02倍，半纖維素酶活提高了10.64倍[6]等。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）屬真菌門、脈紋孢菌屬，是粗壯串珠霉的有性世代，是一種能夠產生纖維素酶的可食用真菌[7]，有氣生菌絲，能產生黃色或橙紅色孢子。該菌能夠分解豆渣中部分粗纖維和大分子蛋白質，產生小分子單糖、雙糖、低聚糖、多肽、氨基酸等生理活性物質，使豆渣口感變細膩，提高豆渣的營養價值和綜合加工特性。釀酒酵母具有較好的發酵特性，其利用谷物發酵基質產生酶系，對谷物的營養和功能品質產生較大影響[8]；植物乳桿菌是工業生產中應用較多的發酵菌，具有優良益生保健功能和產細菌素的特性[9]，但在豆渣發酵中應用較少。本研究以粗糙脈孢菌為基礎發酵菌種，考察其與釀酒酵母、植物乳桿菌耦合對豆渣品質和抗氧化功能的影響，為豆渣類功能食品或食品、飼料、醫藥原輔料的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及主要試劑

新鮮豆渣：武漢遠大豆制品有限公司；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）：廣州納豆生物科技有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，菌種編號 CICC 1477）：湖北安琪酵母有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，菌種編號CICC 24809）：北京川秀國際貿易有限公司；干酪素、羧甲基纖維素鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、α-淀粉酶（100 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、鄰苯三酚：國藥集團化學試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸、5-磺基水楊酸：上海麥克林生化科技有限公司；考馬斯亮藍（G-250）：西安飛揚生物科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：德國BioFroxx公司；胰蛋白酶（豬胰）（250 U/mg）：Aladdin試劑（上海）有限公司；18種氨基酸標準品：美國Sigma公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHWS-250型低溫恒溫恒濕培養箱：合肥達斯卡特生物科技有限公司；UPI-11-5T型優普系列超純水器：四川優普超純科技有限公司；Bio-Rad Mini-PRO TEAN Tetra Cell蛋白電泳裝置：美國伯樂公司；K9860全自動凱氏定氮儀：山東海能科學儀器有限公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀：日本Hitachi公司；UV-2600型紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；CR-13型柯尼卡美能達色譜儀：日本大阪市美能達有限公司；Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵用孢子粉制備

將粗糙脈孢菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）中，在 30℃恒溫培養箱中培養48 h，收集孢子粉置于4℃冰箱備用。

1.3.2 發酵豆渣樣品制備

粗糙脈孢菌發酵豆渣：稱取含水量約為85%豆渣，100℃常壓蒸20 min，冷卻后置于超凈臺上，紫外滅菌15 min，按照豆渣質量0.01%接入粗糙脈孢菌孢子粉，攪拌均勻后置于30℃、相對濕度85%的恒溫恒濕培養箱中發酵，記為NF。以未發酵豆渣作為對照。

接入0.01%粗糙脈孢菌和0.01%釀酒酵母粉，記為NSF，其余制備條件相同。

接入0.01%粗糙脈孢菌孢子粉和0.01%植物乳桿菌菌粉，記為NLF，其余制備條件相同。

接入0.01%粗糙脈孢菌孢子粉、0.01%釀酒酵母粉和0.01%植物乳桿菌菌粉，記為NSLF，其余制備條件相同。

1.3.3 豆渣固態發酵前后纖維素酶活的測定

參考文獻[10]的方法測定纖維素酶活。分別取10 g新鮮發酵 0、24、36、48、60 h 的豆渣樣品于燒杯或試劑瓶中，充分搗碎，再加入200 mL預冷的pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液（含0.15 mol/L NaCl），冰浴攪拌提取1 h，低溫過濾，取1 mL濾液用相應的緩沖溶液適度稀釋后測定纖維素酶活。纖維素酶活單位定義：在（40±1）℃、催化反應的pH值條件下，每分鐘從5 mg/mL羧甲基纖維素鈉溶液中釋放1 μg還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位，結果以U/g表示。計算公式如下。

式中：c為試樣反應溶液中葡萄糖的上機濃度，mg/mL；c0為試樣空白反應溶液中葡萄糖的上機濃度，mg/mL；n為試樣溶液定容后的稀釋倍數；m為試樣質量，g；t為酶反應時間，min；100 為試樣定容體積，mL；180.2為葡萄糖摩爾質量，g/mol；1 000為轉化因子。

1.3.4 膳食纖維含量測定

參考GB 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》和文獻[11]中的方法測定發酵和未發酵豆渣不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）含量。

1.3.5 豆渣理化指標測定

將未發酵豆渣（unfermented okara，UF）即發酵0 h樣品和發酵 24、36、48、60 h 的 NF、NSF、NLF、NSLF 樣品凍干磨粉并過60目篩。不同發酵時間還原糖的測定采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[12]；發酵60 h樣品水解氨基酸和游離氨基酸含量參考文獻[13]中的方法測定。

1.3.6 聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）

參考文獻[14]中的方法，分別稱取一定質量發酵60h的豆渣蛋白至10mL離心管，未發酵豆渣蛋白為對照，溶于0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液中，保證蛋白濃度為10 mg/mL，將離心管在滾軸混勻儀上以50 r/min混樣1 h，使蛋白充分溶解，稀釋5倍，8 000 r/min離心15 min，取上清液備用。將上清液和含有巰基乙醇的上樣緩沖液按照體積比1∶1混合，煮沸5 min，冷卻后10 000 r/min離心2 min，取10 μL上樣，分離膠和濃縮膠濃度分別為12%和4%。

1.3.7 總酸測定

參考GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的方法對新鮮發酵60 h豆渣樣品進行總酸測定。

1.3.8 色度測定

不同發酵時間樣品分別凍干磨粉并過60目篩，參考文獻[15]中的方法測定 L*、a*、b*。

1.3.9 揮發性成分測定

采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[16]。取 7.5 g（精確至0.001 g）新鮮豆渣發酵60 h產物，置于40 mL頂空樣品瓶中，在80℃條件下平衡30 min，使用50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）纖維萃取頭進行固相微萃取，頂空吸附30 min，解吸5 min，每個樣品重復測定3次。

GC條件：CP-SIL 8型毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），升溫程序：40℃保持 2 min，先以 5℃/min升溫到120℃保持2 min，再以7℃/min的速率升到220℃保持5 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，進樣口溫度250℃，不分流。

MS條件：采集方式為選擇離子掃描，溶劑延遲7 min，質量范圍35 amu～395 amu，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，電離方式電子電離（electron ionization，EI），離子源能量 70 eV。

對匹配度大于70（最大值100）的揮發性成分根據NIST 08數據庫對化合物進行定性，面積歸一化法計算相對含量。

1.3.10 抗氧化活性測定

取不同發酵時間（36、48、60h）的豆渣干粉各2g，加入30 mL去離子水，28℃水浴攪拌1 h，然后8 000 r/min離心15 min獲得上清液，用去離子水稀釋20倍后待測。DPPH·清除率參考文獻[17]中的方法并稍作修改；羥基自由基（·OH）清除率參考文獻[18]中的方法測定；超氧陰離子自由基（·O2－）清除率參考文獻[19]中的方法并稍作修改。

1.4 數據處理

采用Origin 2017作圖，用SPSS 23.0對數據進行統計，采用單因素方差分析中的Duncan多重比較法進行顯著性分析（p＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 豆渣發酵過程纖維素酶活變化規律

豆渣發酵過程中的纖維素酶活變化見圖1。

圖1 豆渣發酵過程中的纖維素酶活Fig.1 Cellulase activity during okara fermentation

由圖1可知，4組發酵豆渣樣品的纖維素酶活均呈現先升高后降低的趨勢，其中NF和NSF纖維素酶活均在發酵48 h時達到峰值，分別為1 097.98 U/g和1 234.18 U/g。而NLF和NSLF均在36 h達到峰值，分別為1 126.70 U/g和1 056.94 U/g，隨后纖維素酶活逐漸降低。纖維素酶活能夠影響發酵產物中膳食纖維的含量，纖維素酶可以將基質中不溶性膳食纖維分解成單糖，從而導致不溶性膳食纖維含量降低，可溶性膳食纖維含量增加。纖維素酶主要由粗糙脈孢菌產生[20]，結果表明，釀酒酵母和植物乳桿菌參與發酵明顯加快了粗糙脈孢菌的生長和產酶進程，發酵后期可能因為pH值明顯降低，微生物的生長進入衰亡期，逐漸停止產酶，因此纖維素酶活下降。

2.2 發酵對豆渣膳食纖維和還原糖含量的影響

不同發酵豆渣中膳食纖維和還原糖含量差異見圖2。

圖2 不同發酵豆渣中膳食纖維和還原糖含量差異Fig.2 Differences of dietary fiber and reducing sugar contents in different fermented okara

由圖2A可知，未發酵豆渣（UF）中IDF含量最高，占豆渣干重69.85%，SDF含量最低，為4.05%。菌種耦合發酵 60 h后，NF、NSF、NLF、NSLF 樣品中 IDF 與未發酵豆渣相比均顯著降低（p＜0.05），分別為55.04%、43.27%、52.11%、41.09%，SDF含量明顯提高。NSLF組IDF含量降低明顯，推測釀酒酵母和植物乳桿菌能夠協同促進粗糙脈孢菌產生更多纖維素酶，導致IDF被分解得更多，這與2.1中纖維素酶活變化規律基本一致。

由圖2B可知，隨著發酵時間延長，還原糖含量逐漸增加，而NSF組在發酵后期還原糖含量有明顯下降趨勢。在發酵36 h～48 h釀酒酵母參與的發酵有利于還原糖的積累，含量最高分別達到了（59.50±2.45）mg/g，繼續發酵至終點（60 h）時，還原糖降低為53.40 mg/g左右。粗糙脈孢菌在發酵過程中產生的大量纖維素酶作用于發酵基質中的IDF，分解產生低分子的還原糖，因此還原糖含量增加，IDF含量降低，SDF含量增加。NLF和NSLF組還原糖積累量較低，這是由于植物乳桿菌消耗還原糖用于自身生長繁殖的速率高于釀酒酵母[21]。

2.3 不同發酵豆渣氨基酸差異分析

發酵豆渣水解氨基酸組成和含量變化見表1。發酵豆渣游離氨基酸組成和含量見表2。

表1 發酵豆渣水解氨基酸組成和含量變化Table 1 Composition and content of hydrolyzed amino acids of fermented okara

表2 發酵豆渣游離氨基酸組成和含量Table 2 Composition and content of free amino acids of fermented okara

由表1、表2可知，發酵后4組豆渣的水解氨基酸以及游離氨基酸均顯著增加（p＜0.05）。NF、NSF、NLF、NSLF水解氨基酸含量分別為UF的1.87、1.99、1.88、1.83倍，必需氨基酸含量分別為128.37、135.22、129.67、121.87 mg/g，較 UF（46.33 mg/g）分別提高了 63.91%、65.74%、64.27%、61.98%，經過發酵后豆渣中必需氨基酸含量均能達到水解氨基酸的20%以上，豆渣營養品質明顯提高。

由表2可知，UF游離氨基酸總量為（2.24±0.07）mg/g，而4組發酵豆渣的游離氨基酸明顯增加，分別為 UF 的 13.16、10.93、16.97、14.69 倍，其中以NLF組增量最大。食品中呈鮮味氨基酸主要是谷氨酸和天冬氨酸，甜味氨基酸主要來源于丙氨酸和甘氨酸等。NLF組谷氨酸含量最高為2.07 mg/g，是UF的12.94倍；NLF組丙氨酸含量最高約為1.10 mg/g，是UF的6.88倍。這一結果表明植物乳桿菌參與的發酵對豆渣的滋味和營養提升作用更加明顯。發酵促進蛋白質的降解，明顯促進豆渣內呈結合狀態活性物質的溶出與釋放。水解氨基酸和游離氨基酸含量的變化與Vong等[22]的研究結果基本一致。

2.4 SDS-PAGE分析

發酵60h的豆渣蛋白SDS-PAGE電泳如圖3所示。

圖3 發酵豆渣蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE of fermented okara protein

由圖3 UF條帶可以看出，豆渣中主要有7S和11S兩種抗原蛋白[23]。7S蛋白包括α、α'、β三種亞基，分子量從上到下分別為82 kDa的α'亞基、71 kDa的α亞基、55 kDa的β亞基，11S蛋白包括38 kDa和30 kDa的酸性亞基、22 kDa的堿性亞基。與未發酵豆渣相比，4種發酵豆渣樣品7S蛋白均明顯發生降解，幾乎看不到條帶，11S蛋白38 kDa條帶酸性亞基降解較充分，11S蛋白亞基的降解程度明顯低于7S蛋白亞基。發酵后豆渣中抗原蛋白消失或含量減少，豆渣的致敏性明顯降低。各發酵樣品在10 kDa～15 kDa出現顏色較深的新條帶，這可能是由于微生物將大分子蛋白質逐步降解為低分子蛋白質。與Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（KTI）條帶比較可知，發酵豆渣中胰蛋白酶抑制劑基本可以忽略。

2.5 發酵豆渣總酸含量

發酵豆渣總酸含量見圖4。

圖4 發酵豆渣總酸含量Fig.4 Total acid content of fermented okara

由圖4可知，發酵60 h后豆渣總酸含量相比未發酵豆渣均顯著增加（p＜0.05），分別可達 0.541、0.699、0.593、0.734 g/kg，釀酒酵母能利用豆渣基質中營養物質產生二氧化碳和乙醇，促進系統產生更多酶，因此有利于產生更多的有機酸、脂肪酸、氨基酸等酸性物質[24]，使總酸含量顯著增加（p＜0.05）。植物乳桿菌經過發酵主要產生乙酸、乳酸等有機酸，比較NLF和NF總酸含量發現，植物乳桿菌的引入對總酸含量的增加無明顯促進作用。

2.6 發酵豆渣感官質量差異分析

2.6.1 色度分析

豆渣發酵期間色度變化見表3～表5。

表3 豆渣發酵期間色度L*的變化Table 3 Change of chroma L*in okara during fermentation

表4 豆渣發酵期間色度a*的變化Table 4 Change of chroma a*in okara during fermentation

表5 豆渣發酵期間色度b*的變化Table 5 Change of chroma b*in okara during fermentation

由表3～表5可知，4組 L*均在68.27～74.26，均有較好的明亮度，這與粗糙脈孢菌的基本發酵特征有關。在本試驗條件下，經過觀察發現，粗糙脈孢菌在發酵前期產生肉眼可見的白色菌絲，發酵36 h時開始產生大量鮮亮的橙黃色孢子，從而導致發酵豆渣的L*均有明顯增加，即明度增加。NF、NSF、NLF組L*隨著發酵時間的延長而降低，NSLF組的L*在整個發酵過程均低于其它3組（除60 h）。

耦合發酵60 h的樣品紅色度（a*）明顯高于粗糙脈孢菌單菌種發酵樣品，特別是釀酒酵母參與耦合發酵尤為明顯，以3個菌種耦合發酵的樣品紅色度增加最快，最終紅色度最高。發酵36 h時NSLF組較另外3組呈現出顯著差異（p＜0.05），紅色度最高。4組樣品在發酵36 h時均能產生大量橙黃色孢子，并且紅色度隨著發酵時間的延長而增加，這與粗糙脈孢菌孢子富含類胡蘿卜素有關。4組樣品的黃色度（b*）表現出同紅色度（a*）相似的變化趨勢。

2.6.2 揮發性香氣成分

發酵60 h豆渣揮發性香氣成分分析見表6，不同種類揮發性成分相對質量分數見圖5。

表6 發酵60 h豆渣揮發性香氣成分分析Table 6 Analysis of volatile aroma components of okara fermented for 60 h

圖5 不同種類揮發性成分相對質量分數Fig.5 Relative mass fractions of different volatile components

由表6可知，發酵后揮發性香氣總量明顯增加，NSF組最高為72.57%，是UF組的1.59倍。NF組（Z）-α-紅沒藥烯含量最高為44.95%，是未發酵豆渣的30倍，該物質具有柑橘香、花香等風味。庚醛具有草本氣息、正辛醛具有玫瑰或橙皮香氣，這2種成分均僅在NF發酵組產生。發酵后1-辛烯-3-醇的含量明顯提高，NSF樣品最高，為14.72%，是UF的3倍，該物質具有令人愉悅的玫瑰和干草香氣。苯乙醇在未發酵樣品中未檢出，經過發酵后NSLF組含量最高為1.52%，其具有清甜的玫瑰花香味，酵母細胞能夠通過莽草酸途徑形成的苯丙酮酸脫羧脫氫形成苯乙醇[25]。苯甲醛、苯乙醇、辛酸乙酯等成分含量的增加也對發酵后豆渣香氣有貢獻。辛酸乙酯具有水果香味，在有釀酒酵母的發酵組出現，該成分在NSF組含量最高，為0.44%，酯類成分是由于釀酒酵母的作用下醇與酸的酯化反應產生的，由于酯類較低的氣味閾值[26]，其在較低含量時也能被感知。

由圖5可知，發酵豆渣中揮發性成分種類主要有醛類、醇類、酯類、烷烴類、芳香烴等。經過發酵后，醇類、烯烴類和芳香烴類揮發性成分相對含量明顯增加，醇類最高為NSF組21.96%，是UF的4倍，烯烴類最高為NF組50.52%，是UF的14倍。醛類、酯類、烷烴類和雜環類揮發性成分相對含量有所降低，推測酯類含量的減少可能是因為菌種利用酯類等營養物質進行自身代謝將其轉化成醇類物質等。豆渣在菌種作用下經過長時間發酵發生一系列生化反應，如羥醛縮合、蛋白質降解、醇酸縮合等[27]，產生出多種具有特殊香味的揮發性物質，這些化合物互相融合，使發酵產物具有獨特的風味。因此，粗糙脈孢菌協同釀酒酵母和植物乳桿菌耦合發酵對豆渣風味具有明顯提高作用。

2.7 菌種耦合發酵對豆渣抗氧化活性的影響

豆渣發酵期間抗氧化活性的變化見圖6。

圖6 豆渣發酵期間抗氧化活性的變化Fig.6 Changes in antioxidant activity during soybean dregs fermentation

由圖6可知，發酵后豆渣DPPH·清除率均能達到95%左右，而未發酵豆渣DPPH·清除率測定值僅為13%左右，表明發酵前豆渣沒有明顯的DPPH·清除能力，而各發酵樣品均具有很強的DPPH·清除能力，發酵后豆渣中還原糖含量明顯增加，還原糖可能提供電子使自由基形成穩定的物質，有效阻斷自由基鏈式反應[28]，豆渣抗氧化能力明顯提高。·O2－清除率也比未發酵豆渣有顯著提高（p＜0.05）。NF、NSF、NLF 三組的·O2－清除率均較高，并在發酵36 h達到峰值，分別為74.44%、86.03%及83.79%，之后隨著發酵時間延長而降低。從·OH清除率來看，在發酵 48 h時，NF、NSF、NSLF組·OH清除率達到最高值，發酵后期·OH清除率下降，可能是由于還原類物質在后期被微生物用于自身生長消耗。發酵豆渣過程中可能產生了類胡蘿卜素和抗氧化活性多肽等物質[29]，從而提高了豆渣的抗氧化能力，但需要進一步試驗確認。

3 結論

本文以粗糙脈孢菌為基本發酵菌種，耦合釀酒酵母和植物乳桿菌發酵鮮豆渣，探究豆渣的營養品質和抗氧化活性的變化，以獲得營養豐富、感官品質良好的功能性食品、飼料或醫藥輔料。豆渣發酵后，還原糖、總氨基酸、游離氨基酸、可溶性膳食纖維等功能活性物質含量明顯增加，豆渣的營養組成更有利于人體健康。NSLF組IDF被微生物明顯分解，IDF含量降低28.76%，SDF含量提高5.03%。植物乳桿菌參與的發酵對豆渣的滋味提升效果最好，粗糙脈孢菌協同釀酒酵母和植物乳桿菌耦合發酵能夠有效增加揮發性成分的種類并提高含量，發酵產物風味更加優良。發酵后豆渣的DPPH·清除能力、·O2-清除能力和·OH清除能力均明顯增加，抗氧化活性明顯增強。綜合分析認為，粗糙脈孢菌、釀酒酵母和植物乳桿菌耦合發酵豆渣能夠明顯改善豆渣的營養品質和抗氧化活性，本研究中豆渣經過發酵后營養成分明顯改善、豆渣利用價值有效提高，為開發以發酵豆渣為原輔料的功能性食品提供參考。