基于人工神經網絡優化黑木耳紅棗發酵乳及其抗氧化分析

張劍林，張亮亮，姜露熙，裴龍英，王寒博，孫博，梁睿武，房丹丹

（新疆理工學院食品科學與工程學院，新疆 阿克蘇 843100）

發酵乳是以鮮牛乳或乳制品為主要發酵原料，經一定時間及溫度發酵而成的乳產品，其風味獨特、營養豐富[1]。發酵乳中含有大量益生菌，能夠有效地阻止有害細菌的繁殖，以此降低人體腸道內有害細菌及有毒物質含量，起到調節人體腸道菌群及增強人體自身免疫力的作用[2]。黑木耳作為食用菌，將其作為調味品加入乳品、飲料中等，可提升產品營養價值與抗氧化特性，并伴有更多的味覺感受[3-5]。紅棗作為鼠李科棗屬植物，富含有機酸、多糖、環磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）等活性物質，具有補氣血、健脾益胃的功效[6-8]。黑木耳與紅棗相結合，能促進總抗氧化能力系數的提高[9]。人工神經網絡在發酵乳研究中未見報道。因此，黑木耳紅棗發酵乳通過乳酸菌發酵，結合響應面設計和人工神經網絡優化能夠簡單且快速地獲得模型最佳值，以此制成一款新型高附加值且獨特風味的發酵乳飲料[10-11]。

人工神經網絡通過調整輸入層、輸出層、隱含層中有關聯的相關神經元所對應的閾值，反映相互之間的非線性關系[12-15]。由于發酵乳產品成分及工藝的多元性，且發酵工藝參數與產品各屬性指標間的關系大多是非線性的，因而人工神經網絡能夠較好適用于發酵乳產品屬性的模擬。因此，本研究以酸度為衡量指標，研究多因素條件作用下的黑木耳紅棗發酵乳工藝條件，應用人工神經網絡建立并擬合發酵乳工藝，通過模型建立篩選、驗證最佳發酵工藝參數，以期為發酵乳的高附加利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗：新疆阿克蘇市溫宿縣；鮮牛乳：新疆天潤生物科技股份有限公司；黑木耳、M30乳桿菌：新疆理工學院實驗3號樓502實驗室；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）試劑：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：北京化工廠；硫酸亞鐵：天津市光復科技發展有限公司；過氧化氫：開原化學試劑一廠；水楊酸：天津市華東試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BPH-9402精密恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV759紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；LDZM-80L立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；JMS-50膠體磨：廊坊市冠通機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

紅棗汁、黑木耳粉、牛乳→復配→黑木耳紅棗乳→膠體磨處理→巴氏殺菌→接菌發酵→黑木耳紅棗發酵乳

1.3.2 黑木耳紅棗汁的制備

選擇新鮮、無機械損傷及蟲蛀、色澤光亮的當年季灰棗。將紅棗于溫水中加一定量蔗糖洗去表面灰塵，再用水清洗1遍，瀝干后去核，切成小碎塊[16]。添加3倍水煮沸30 min后過濾備用，將粉碎過80目篩的黑木耳粉加4倍紅棗汁過濾后制成黑木耳紅棗汁。

1.3.3 發酵

將M30乳桿菌固體培養基從冰箱取出，在MRS肉湯培養基中接入挑取的單菌落，37℃培養48 h，經過多次活化使總活菌數為2.7×107CFU/mL，留作接種液備用。黑木耳紅棗乳殺菌后，接入M30乳桿菌，設定不同恒溫溫度后在培養箱中培養一定時間，測定發酵液酸度及相應指標。

1.3.4 單因素試驗

以酸度、活菌數、蛋白質含量作為評價指標，分別考察接種量（2.5%、4.5%、6.5%、8.5%、10.5%）、發酵時間（24、30、36、42、48h）、發酵溫度（30、33、36、39、42℃）、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比（3∶1、2∶1、3 ∶2、1∶1、1∶2）對黑木耳紅棗發酵乳的影響。

1.3.5 黑木耳紅棗發酵乳工藝參數優化

選用酸度作為黑木耳紅棗發酵乳的考察指標，選擇接種量、發酵時間、發酵溫度、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比作為黑木耳紅棗發酵乳工藝影響因素進行優化試驗，各參數水平如表1所示。

表1 黑木耳紅棗發酵乳因素與水平Table 1 Coding table of factors and levels of the fermented milk of black fungus and red jujube

1.3.6 遺傳算法尋優設計

通過遺傳算子，選擇、交叉、變異，采取MATLAB遺傳算法工具箱進行遺傳算法以進行全局多點尋優[17]。人工神經網絡模擬運算對黑木耳紅棗發酵乳過程中的4個因素（接種量、發酵溫度、發酵時間、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比）在各自加入量范圍內采取人工神經網絡模擬運算，以此模型的輸出值構建個體適應度函數進行整體尋優。酸度值的浮動變化對個體適應度值的影響較大。通過實際情況進行初始種群數、變異概率、交叉概率和進化代數的選取，相關參數的設定根據實際而定[18-19]。黑木耳紅棗發酵乳神經網絡模型示意圖見圖1。

圖1 黑木耳紅棗發酵乳神經網絡模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of neural network model of the fermented milk of black fungus and red jujube

1.3.7 抗氧化能力測定

參照文獻[20-21]的方法對DPPH·清除率、羥基自由基清除率進行測定。

1.3.8 活菌數和酸度的測定

參考文獻[22-23]對活菌數和酸度進行測定。

1.4 統計分析

采用Origin 2018對單因素圖表進行繪制，通過Design-Expert 8.0設計27組試驗，且每一組做3次平行試驗，采用Matlab 2017b進行模型構建。

2 結果與分析

2.1 不同因素條件對黑木耳紅棗發酵乳的影響

接種量對黑木耳紅棗發酵乳的影響見圖2。

圖2 接種量對黑木耳紅棗發酵乳的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖2可知，當其它條件不變時，從總體上看酸度變化趨勢呈先上升后趨于平穩的趨勢，活菌數無明顯變化，蛋白質含量略有起伏，其現象原因可能是M30乳桿菌接種量的多少與反應環境中菌體生長相關性較大，當發酵乳的接種量大于6.5%時，發酵乳所能利用的活菌數是有限的，致使酸度幾乎無明顯增長。因此，選擇最適接種量為6.5%。

發酵時間對黑木耳紅棗發酵乳的影響見圖3。

圖3 發酵時間對黑木耳紅棗發酵乳的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，酸度變化呈先上升后趨于平緩的趨勢，可能是由于M30乳桿菌的接入使菌體大量生長繁殖促使酸度增大，當發酵至36 h時，M30乳桿菌的生長消耗了大量的碳源使乳酸菌的生長受到阻礙，導致活菌數變化減少。因此，選擇最適發酵時間為36 h。

發酵溫度對黑木耳紅棗發酵乳的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對黑木耳紅棗發酵乳的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖4可知，當發酵溫度高于39℃時，酸度浮動變化減緩，原因可能是M30乳桿菌的生長對較高溫度的耐受性較低，不利于其生長，從而會影響產酸特性。故選擇最適發酵溫度為39℃。

黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比對黑木耳紅棗發酵乳的影響見圖5。

圖5 黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比對黑木耳紅棗發酵乳的影響Fig.5 Effect of the ratio of black fungus and red jujube juice to fresh milk on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖5可知，黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比對酸度影響較為明顯，當黑木耳紅棗汁的占比減少時，酸度呈先上升后趨于穩定的趨勢，而活菌數總體呈小幅上升的趨勢，可能是牛乳中的營養物質更有利于M30乳桿菌的生長。因此，選擇最適黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比為3∶2。

2.2 酸度試驗結果

各參數下黑木耳紅棗發酵乳酸度如表2所示。共計29組試驗，每組做3組平行，用于人工神經網絡模型的構建。

表2 不同參數下黑木耳紅棗發酵乳的酸度Table 2 Acidity of the fermented milk of black fungus and red jujube under different parameters

2.3 誤差反傳（error back proragation，BP）神經網絡模型的構建

2.3.1 BP神經網絡模型參數

神經網絡模型的訓練及構建使用Matlab 2017b軟件完成。通過工具箱對神經網絡訓練的每一過程的迭代次數中訓練數據集采取70%、15%、15%隨機歸類為訓練部分、驗證部分和測試部分進行迭代訓練[24-25]。通過建模選擇隱藏神經元個數為10，神經網絡模型構建較好。

神經網絡預測值和期望值之間的誤差采用均方誤差（mean-square error，MSE）函數表示，公式如下。

黑木耳紅棗發酵乳的研究中，通過每組試驗的實際值及神經網絡輸出的預測值，來評價酸度在神經網絡預測中準確度，若模型預測性能越好，則期望值和預測值越接近。

2.3.2 神經網絡模型構建的均方誤差評估

神經網絡模型構建的準確性建立在MSE評估的基礎上。MSE值越小，所建立的模型越成功，試驗數據所表現出的精確度越高[26-27]。黑木耳紅棗發酵乳神經網絡模型的MSE值見圖6。

圖6 黑木耳紅棗發酵乳神經網絡模型的MSE值Fig.6 MSE value of the fermented milk of black fungus and red jujube with neural network model

式中：n為參與評價的樣本個數；yi為第i個神經網絡的輸出值為該輸出值對應的期望值。

如圖6所示，隨著訓練步數的增加，MSE誤差逐漸趨近于最佳值，對應誤差為0.041 569，同時驗證誤差也趨于最佳值，當神經網絡模型迭代至第7次時，訓練結果趨于平穩，說明該模型達到擬合要求[28-29]，可用于黑木耳紅棗發酵乳工藝擬合研究。

2.3.3 神經網絡模型相關系數的評估

黑木耳紅棗發酵乳模型構建的相關系數指標見圖7。

圖7 黑木耳紅棗發酵乳模型構建的相關系數指標Fig.7 Correlation coefficient index for model construction of the fermented milk of black fungus and red jujube

如圖7所示，通過統計訓練、驗證、測試及所有數據的目標值和輸出值，并計算出相關系數[30-31]。各組數據的相關系數R、目標值及神經網絡模型的輸出值呈顯著的正相關關系，進一步確定了神經網絡模型構建的成功。

2.4 人工神經網絡模型性能測試

通過對所構建的神經網絡模型選擇收集的9組試驗數據進行預測值與實際值隨機驗證[32-33]。以試驗測得的實際酸度與神經網絡預測的值進行比較，結果見圖8。

圖8 構建黑木耳紅棗發酵乳模型性能的驗證Fig.8 Validation of the model of the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖8可知，試驗測定獲取的酸度與神經網絡模型預測值具有變化一致的趨勢。因此，進一步說明通過此方式構建的神經網絡模型所輸出的預測值具有較高可行性。

2.5 遺傳算法尋優

黑木耳紅棗發酵乳遺傳算法的尋優結果見圖9。

圖9 黑木耳紅棗發酵乳遺傳算法的尋優結果Fig.9 Optimal results of genetic algorithm for the fermented milk with black fungus and red jujube

由圖9所示，通過采用Matlab 2017b軟件對黑木耳紅棗發酵乳進行工藝尋優，當遺傳運算迭代至127次時，模型所對應的酸度預測值與實際值擬合度最佳，此時試驗因素（黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比、發酵溫度、發酵時間、接種量）編碼分別為1.428、38.800、36.600、0.067，所對應黑木耳紅棗發酵乳酸度理論值為75.12°T，與實際所測值無明顯差異，該模型工藝優化結果準確。

2.6 抗氧化結果分析

不同濃度黑木耳紅棗發酵乳與未發酵組抗氧化性能的對比見圖10。

圖10 不同濃度黑木耳紅棗發酵乳與未發酵組抗氧化性能的對比Fig.10 Comparison of antioxidant properties of the fermented milk of black fungus and red jujube and unfermented milk with different concentrations

如圖10所示，黑木耳紅棗發酵乳未發酵組、發酵組的DPPH自由基、羥基自由基清除率隨樣液體積濃度的變化均呈先增長后趨于平穩的趨勢。對于黑木耳紅棗發酵乳發酵組而言，經過不同梯度的處理后，當樣液體積濃度分別為0.6、0.8 mL/mL時，黑木耳紅棗發酵乳的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率分別為81.30%、73.42%，均達到較高的清除效果，較發酵前分別提高了12.04%、13.52%，其發酵前后差異明顯，在發酵過程中，抗氧化性有所增強，其可能原因是由于乳酸菌在發酵過程中使游離態酚類物質的占比增加[34]，進一步增強黑木耳紅棗發酵乳抗氧化性。

3 結論

本試驗以黑木耳粉、紅棗汁、鮮牛乳為原料，通過乳酸菌發酵制成黑木耳紅棗發酵乳，采用DPPH自由基、羥基自由基清除率評價發酵制品的抗氧化能力。根據發酵溫度、發酵時間、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比、接種量4個影響因子為單因素試驗，結合Box-Behnken試驗的因素水平和響應值，將黑木耳紅棗發酵乳的4個因素及對應酸度通過Matlab 2017b軟件構建神經網絡擬合其之間的非線性關系，模型預測性和準確性較高，能夠反映發酵溫度、發酵時間、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比、接種量與酸度之間的關系，通過與遺傳尋優相結合，確定黑木耳紅棗發酵乳的最佳工藝條件為發酵溫度38.8℃、發酵時間36.6 h、接種量6.70%、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比為3∶2.1，對應最佳酸度為75.12°T。在此條件下，黑木耳紅棗發酵乳DPPH自由基、羥基自由基清除率分別為81.30%、73.42%，較發酵前分別提高了12.04%、13.52%，試驗結果為黑木耳紅棗發酵乳的綜合開發利用提供參考。