沙棘果渣多糖-納米銀復合粒子的制備及其抑菌活性

王薇，曹雯

（哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150028）

我國沙棘資源豐富，種植面積占全世界沙棘種植總面積的99%以上[1-2]。目前沙棘果主要應用于果汁的生產，榨汁后會產生20%的沙棘果殘渣。據報道，我國沙棘產業每年可產生近百萬噸的沙棘果渣[3-4]。這些果渣包括果皮、種子、殘余果肉等，在這些果渣中仍然含有很多的有效物質，如黃酮、維生素B1、維生素B2、維生素C、維生素E、氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鞣質、糖、三萜及甾體類等[5]。這些被廢棄的果渣不僅會造成資源的浪費，而且還會造成環境的污染。研究表明，沙棘果渣中的主要成分為天然多糖，且植物多糖是一種具有良好生物活性的天然抗菌劑和天然生物防腐劑。目前在工業生產中，已經有很成熟技術可以提取出副產物中的多糖[6]。

納米銀作為一種新型抗菌活性材料，以其自身抗菌功能特性較好、抗菌譜較廣泛，且抗菌不容易引起宿主細胞感染產生抗耐藥性反應等優點受到廣泛關注[7-10]。由于天然多糖的生物相容性極佳，當其與納米銀協同使用時能夠減少納米銀的用量，從而使納米銀的生物毒性降低[11-15]。因此，本試驗以富含多糖的沙棘果渣為原料，選擇大腸桿菌和白色葡萄球菌為食源性致病菌的代表，用單因素試驗優化合成沙棘果渣多糖-納米銀工藝流程，并研究沙棘果渣多糖-納米銀對兩種致病菌的抑制效果，為沙棘果渣的開發利用提供參考，同時可以為尋找新的可替代傳統化學抑菌劑的植物源抑菌劑提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣多糖：哈爾濱商業大學生物催化與發酵實驗室自制；牛肉膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨：北京索萊寶科技有限公司；瓊脂：北京蘭杰柯科技有限公司；大腸桿菌、白色葡萄球菌：哈爾濱商業大學生物催化與發酵實驗室；NaCl：天津市鼎盛鑫化工有限公司；氫氧化鈉：天津市大陸化學試劑廠；硝酸銀：天津市科密歐化學試劑開發中心；鹽酸：廣東省精細化學品工程技術研究開放中心。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

H2050R高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；W201B恒溫水浴鍋：上海申勝生物技術有限公司；UV5100B型紫外/可見分光光度計：上海元析儀器制造有限公司；PerkinElmer100傅立葉紅外光譜：美國PerkinElmer公司；Nano-ZS90馬爾文激光粒度儀：英國馬爾文儀器有限公司；JJ200精密電子天平：美國雙杰兄弟有限公司；FDU-1200真空冷凍干燥機：東京理化器械株式會社；LDZX-50KB高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LRH-70F恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SMP6酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；MIRA4掃描電鏡：泰思肯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗設計

將濃度為50 mmol/L的硝酸銀溶液和1 mg/mL沙棘果渣多糖溶液按0.5∶1的體積比混合，并在pH7和25℃條件下反應4 h，然后用波長365 nm的紫外光照射10 min輔助生成納米銀。在上述工藝條件基礎上，以對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響為指標，進行單因素試驗。分別考察反應時間（4、8、12、16、20、24 h）、反應溫度（25、30、35、40、45 ℃）、硝酸銀和沙棘果渣多糖的體積比（0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0 ∶1、2.5∶1）、pH 值（7、8、9、10、11）、紫外照射時間（10、20、30、40、50、60 min）對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響。反應完成后10 000 r/min離心30 min，反復離心2次，去除上清液，收集沉淀，得到棕褐色沉淀即沙棘果渣多糖-納米銀復合粒子，凍干后置于-4℃冰箱備用。

1.3.2 表征分析

1.3.2.1 紫外可見光譜分析

將1.3.1制得的沙棘果渣多糖-納米銀溶液使用UV5100B型紫外/可見分光光度計進行分析，檢測波長范圍為300 nm～800 nm。

1.3.2.2 傅里葉紅外光譜分析

分別將沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-納米銀樣品冷凍干燥后得到的固體粉末用傅立葉紅外光譜儀測定。波長掃描范圍為4 000 cm-1～500 cm-1。

1.3.2.3 粒徑分析

用馬爾文激光粒度儀進行粒徑的檢測。

1.3.2.4 掃描電鏡分析

將少量沙棘果渣多糖-納米銀溶液滴于硅片表面，待樣品干燥后，使用MIRA4掃描電鏡觀察顆粒形態。

1.3.3 抑菌試驗

1.3.3.1 制備方法

參考李琴琴[16]的方法制備納米銀，將0.02 mol/L硝酸銀溶液和3%聚乙烯吡咯烷酮溶液1∶1（體積比）混合，然后室溫24℃攪拌2 h，最后在攪拌的同時，逐滴滴加10 mL的0.01%硼氫化鈉溶液，即得到納米銀溶液。

用無菌水將沙棘果渣多糖、化學法制得的納米銀和單因素試驗制得粒徑最小的沙棘果渣多糖-納米銀這3種樣品稀釋成不同濃度。

1.3.3.2 抑菌試驗方法

抑菌試驗采用牛津杯瓊脂板擴散法[17]。本試驗以白色葡萄球菌和大腸桿菌為試驗菌株。取適量菌液在固體培養基表面涂勻，將牛津杯（內徑7.8mm）放置在平板上，然后添加 100 μL 不同濃度（5、10、15、20 μg/mL）的沙棘果渣多糖溶液、納米銀溶液和沙棘果渣多糖-納米銀溶液，置于37℃的恒溫培養箱中培養，24 h后觀察測量抑菌圈直徑并記錄結果。

1.3.4 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的確定

在96孔板中分別添加100 μL的大腸桿菌和白色葡萄球菌菌懸液，再分別添加100 μL不同濃度（1、2、3、4、5、6 μg/mL）的沙棘果渣多糖-納米銀溶液。將 96孔板置于37℃下培養24 h，每間隔1 h通過酶標儀測每孔在600 nm處的吸光值。每孔的最大吸光值和最小吸光值之差（陽性對照組的吸光值差值是最大的）可直接反映出細菌生長的情況，吸光值差值在負值區域表明其對應的處理能完全抑制供試菌的生長，吸光值差值為0時對應的抑菌劑濃度為最低抑菌濃度。根據公式（1）計算吸光值差值（ΔOD）。

式中：ODmax為最大吸光值；ODmin為最小吸光值。

1.4 數據處理

采用SPSS 2019對數據進行統計分析，Origin 2019進行繪圖，以上所有試驗均重復3次，結果取平均值，并以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同反應時間對沙棘果渣多糖-納米銀形成的影響

當反應時間分別為 4、8、12、16、20、24 h 時，對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響見圖1。

圖1 不同反應時間對復合顆粒紫外可見光譜和粒徑的影響Fig.1 Effects of different reaction times on UV and particle size of composite particle

如圖1A所示，在波長為420 nm處出現一個較強的吸收峰，為納米銀的特征吸收峰，表明在沙棘果渣多糖的還原作用下，硝酸銀被還原成單質狀態的納米銀。隨著反應時間的延長，紫外吸收峰逐漸升高，反應16 h后，增加幅度基本不變。這可能是由于反應時間越長，沙棘果渣多糖對硝酸銀還原反應越充分，而當反應時間達到16 h后，還原反應基本完成，所以16 h后，峰值的增加幅度基本不變。如圖1B所示，生成的沙棘果渣多糖-納米銀復合粒子的粒徑隨著反應時間的延長而減小。這是由于反應時間過短，反應不充分，影響了納米銀復合粒子成核，造成粒子的粒徑過大。反應時間越長，反應越充分，所以粒子粒徑越來越小。在反應時間為24 h時生成的沙棘果渣多糖-納米銀粒徑最小，最小粒徑為32.17 nm。所以選擇反應24 h為最佳反應時間。

2.1.2 不同反應溫度對沙棘果渣多糖-納米銀形成的影響

當反應溫度分別為 25、30、35、40、45 ℃時，對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響見圖2。

圖2 不同反應溫度對復合顆粒紫外可見光譜和粒徑的影響Fig.2 Effects of different reaction temperatures on UV and particle size of composite particle

如圖2A所示，當反應溫度為25℃～35℃時，隨著反應溫度的增加，紫外吸收峰也在增加，并在35℃時達到一個最大值。當反應溫度為35℃～45℃時，隨著反應溫度的增加峰值逐漸降低。因為溫度會改變反應速度，溫度越高反應速度越快，生成的沙棘果渣多糖-納米銀復合粒子也增加，但溫度過高可能使硝酸銀轉化為氧化銀，所以溫度過高峰值越低[18-19]。因此，35℃為最佳反應溫度。如圖2B所示，沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑先減小后增大，但不同反應溫度對粒徑的整體影響不大，在35℃時生成的沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑最小，最小粒徑為76.9 nm。這是由于溫度會影響粒子布朗運動，溫度過高布朗運動加快，會加速納米銀粒子的團聚[20]。結合紫外-可見吸收光譜以及實際成本及設備維修率等問題，選擇最佳反應時間為35℃。

2.1.3 不同硝酸銀和沙棘果渣多糖的體積比對沙棘果渣多糖-納米銀形成的影響

當硝酸銀和沙棘果渣多糖的體積比分別為0.5∶1、1.0 ∶1、1.5 ∶1、2.0∶1、2.5 ∶1時，對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響見圖3。

圖3 不同體積比對復合顆粒紫外可見光譜和粒徑的影響Fig.3 Effects of different volume ratios on UV and particle size of composite particle

如圖3A所示，隨著硝酸銀溶液體積的增加，紫外吸收峰也在增大，在硝酸銀溶液與沙棘果渣多糖溶液體積比為1.0∶1時峰值達到最大值，之后隨著硝酸銀溶液體積的增加，峰值逐漸減小。所以硝酸銀溶液與沙棘果渣多糖溶液體積比為1.0∶1為最佳反應條件。如圖3B所示，以0.5∶1的體積比制備的沙棘渣多糖-納米銀顆粒尺寸最小，其最小顆粒直徑為55.3 nm。當硝酸銀溶液與沙棘果渣多糖溶液的體積比為1.0∶1時的粒徑與體積比為0.5∶1時的粒徑大小相差甚微。研究表明，硝酸銀的含量會影響粒徑的大小，硝酸銀含量過多，生成的粒子容易聚集，造成粒子粒徑過大；而硝酸銀含量低，生成的粒子逐漸變成球形，且粒徑逐漸變小[21]。所以硝酸銀含量越低，所生成沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑越小。結合圖3A結果，選擇體積比1.0∶1為最佳反應條件。

2.1.4 不同pH值對沙棘果渣多糖-納米銀形成的影響

當 pH 值分別為 7、8、9、10、11 時，對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響見圖4。

圖4 不同pH值對復合顆粒紫外可見光譜和粒徑的影響Fig.4 Effect of different pH values on UV and particle size of composite particle

如圖4A所示，隨著pH值的增加，紫外吸收峰也在增大，在pH9時峰值達到最大值，隨后隨著pH值的增加峰值減小。可能是因為隨著pH值的升高，沙棘果渣多糖的還原性增強，促使Ag+還原成單質銀。但pH值過高導致單質銀過多，造成納米銀含量低，進而峰值下降。同時可看出，強堿性條件下峰值更高，弱堿性條件下峰值較低。如圖4B所示，在反應溶液pH9時生成的沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑最小，最小粒徑為96.78nm。不同pH值反應溶液所制得的沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑相比于其他單因素條件下所制得的沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑較大，原因可能是在調節pH值時，由于硝酸銀在堿性條件下容易生成氧化銀，導致反應液不穩定。綜上所述，pH9為最佳反應條件。

2.1.5 不同紫外照射時間對沙棘果渣多糖-納米銀形成的影響

當紫外照射時間分別為 10、20、30、40、50、60 min時，對沙棘果渣多糖-納米銀的紫外可見光譜和粒徑影響見圖5。

圖5 不同紫外照射時間對復合顆粒紫外可見光譜和粒徑的影響Fig.5 Effect of different UV irradiation times on UV and particle size of composite particle

如圖5A所示，隨著紫外照射時間的延長，紫外吸收峰也隨之增加。如圖5B所示，紫外照射時間越長，所制得的沙棘果渣多糖-納米銀的粒徑越小，當紫外照射時間達到40 min后，納米銀粒徑幾乎不變。當紫外照射60 min時，其粒徑最小，為44.54 nm。結合紫外可見吸收光譜，在紫外照射時間為60 min時，峰值最高。因此，選擇紫外照射60 min為最佳反應條件。

2.2 沙棘果渣多糖-納米銀結構表征

2.2.1 粒徑和掃描電鏡分析

通過單因素試驗結果，確定反應溫度35℃、pH9、硝酸銀溶液與多糖溶液的體積比1.0∶1、反應時間24h、紫外照射60 min條件下反應制得的納米銀粒徑最小，將該條件下制得的沙棘果渣多糖-納米銀用于掃描電鏡和粒徑表征，結果如圖6所示。

圖6 沙棘果渣多糖-納米銀的掃描電鏡和粒徑分析圖Fig.6 SEM image and particle size image of seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle

由圖6可知，沙棘果渣多糖-納米銀粒子的粒徑平均粒徑為31.77 nm，其形狀多呈類球狀。圖6B中峰（1）的平均粒徑在69.14 nm，相對強度為80.3%，表明在沙棘果渣多糖-納米銀溶液中，更多顆粒呈單分散分布。然而，峰（2）的相對強度為19.7%，表明很少有顆粒是多分散的，并且在某些地方出現團聚。

2.2.2 紅外光譜分析

將沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-納米銀進行紅外表征，旨在找出沙棘果渣多糖中參與還原納米銀的相關有機基團。沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-納米銀的紅外光譜見圖7。

圖7 沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-納米銀的紅外光譜Fig.7 Infrared spectrogram of seabuckthorn pomace polysaccharides and seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle

如圖7所示，在3 312 cm-1附近的特征寬吸收帶為沙棘果渣多糖中羥基的拉伸振動，在形成沙棘果渣多糖-納米銀后特征峰紅移至3 296 cm-1處，并且特征峰面積有所降低，這可能由納米銀和沙棘果渣多糖結構中羥基之間的相互作用引起的[22]。在沙棘果渣多糖的紅外光譜中，在2 918 cm-1處對應于C-H的對稱和非對稱伸縮振動，該峰在沙棘果渣多糖-納米銀的紅外光譜中明顯減弱，且1 543 cm-1處出現一個代表C=C伸縮振動的新峰，說明納米銀的生成過程與沙棘果渣多糖中亞甲基有關[14]。在1 632 cm-1處可能是酰胺的羰基拉伸模式。在1 308 cm-1和1 297 cm-1處的尖峰是由于沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-納米銀中羧基功能的對稱拉伸所致。1 014 cm-1和1 002 cm-1處的峰值歸因于醇和醚鍵的C-O-C拉伸[23-24]。

2.3 抑菌試驗結果

不同濃度的沙棘果渣多糖、納米銀和沙棘果渣多糖-納米銀對大腸桿菌和白色葡萄球菌進行牛津杯抑菌試驗，結果如圖8所示。

圖8 沙棘果渣多糖、納米銀和沙棘果渣多糖-納米銀對大腸桿菌和白色葡萄球菌的抑菌圈直徑Fig.8 Inhibition zone diameter of seabuckthorn pomace polysaccharides，nano silver，and seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle against Escherichia coli and Staphylococcus albus

由圖 8 可知，當濃度在 5 μg/mL～20 μg/mL 時，化學法制成的納米銀和沙棘果渣多糖-納米銀對大腸桿菌有很好的抑制作用，且沙棘果渣多糖-納米銀的抑制效果最好。兩種納米銀抑菌作用都隨著濃度的增加而增強，且整體對大腸桿菌的抑制作用強于白色葡萄球菌。Kvítek等[25]研究表明納米銀具有很強的抑菌活性，特別是對革蘭氏陽性菌，這可能是由于細菌細胞膜的結構和化學組成的不同。但在此濃度下，沙棘果渣多糖對兩種供試菌均沒有呈現抑制區域。

2.4 沙棘果渣多糖-納米銀最低抑菌濃度（MIC）的確定

通過文獻[26]可知，尺寸更小、表面積更大的納米銀顆粒具有更高的殺菌性能，因其可以增大細菌細胞膜的通透性從而導致細胞死亡。所以本試驗測定31.77 nm粒徑的沙棘果渣多糖-納米銀對兩種供試菌的MIC值，結果見圖9。

圖9 沙棘果渣多糖-納米銀對兩種供試菌的MICFig.9 MICs of seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle against the two strains

由圖9可知，沙棘果渣多糖-納米銀能明顯抑制影響大腸桿菌和白色葡萄球菌的生長，且抑菌性隨著復合納米顆粒的濃度升高而增強，ΔOD值在負值區域表明能完全抑制供試菌的生長。在相同濃度下，沙棘果渣多糖-納米銀對大腸桿菌的抑制作用比對白色葡萄球菌的抑制作用強。大腸桿菌的最小抑制濃度為4 μg/mL，白色葡萄球菌的最小抑制濃度為6 μg/mL。

3 結論

本文采用沙棘果渣多糖還原硝酸銀中的銀單質，以制備沙棘果渣多糖-納米銀，并通過單因素試驗得出，1 mg/mL沙棘果渣多糖溶液和50 mmol/L硝酸銀溶液，在硝酸銀和沙棘果渣多糖體積比1.0∶1、反應溫度35℃、pH9時反應24 h后，在365 nm紫外燈下照射60 min條件下，生成的沙棘果渣多糖-納米銀含量最高，粒徑最小。經粒度儀和SEM分析可知沙棘果渣多糖-納米銀多為球形，最小平均粒徑為31.77 nm。對比分析沙棘果渣多糖、化學法制備的納米銀和沙棘果渣多糖-納米銀三者對大腸桿菌和白色葡萄球菌的抑菌效果，結果表明在較低濃度下，沙棘果渣多糖-納米銀的抑菌效果優于化學法制的納米銀，而沙棘果渣多糖對白色葡萄球菌沒有明顯抑制作用。兩種納米銀對大腸桿菌的抑菌圈直徑均大于白色葡萄球菌的抑菌圈直徑，這說明大腸桿菌比白色葡萄球菌對兩種納米銀更敏感。沙棘果渣多糖-納米銀的最低抑菌濃度測定試驗得出對大腸桿菌的MIC為4 μg/mL，對白色葡萄球菌的MIC為6 μg/mL。因此該法成功制備的沙棘果渣多糖-納米銀具有良好的抑菌性能，可以為新型抑菌劑在食品行業中的開發和應用提供參考。