一株產黃色素細菌的篩選鑒定及其產黃色素培養條件優化

尤田，嚴佳佳，彭亞彬，何灣灣，王德培，高強

（教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，生物工程國家級實驗教學示范中心，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

色素在日常生活與工業生產中有著重要的作用[1]。天然黃色素多來源于動物、植物、礦物質和微生物[2]；微生物黃色素則多產于細菌、酵母、絲狀真菌和微藻，在來源可控、性質穩定和易于下游加工等方面優于植物和動物色素[1-3]。近年來已報道多種產黃色素的真菌、細菌（如紅曲霉菌），已發現的其產黃色素種類有44種，其中Takahashi等[4]研究的紅曲黃色素黃單胞菌素A和黃單胞菌素B混合物，已經實現產業化；粒毛盤菌產胞外脂溶性四環三萜類衍生物黃色素對多數食品添加劑的穩定性良好[5]；海膽共生菌鞘氨醇單胞菌產黃色素易溶于不同極性的常見有機溶劑中，對光穩定性好[6]；藤黃微球菌產黃色素具有抗氧化、抗菌、抗輻射作用[7]等。可見天然微生物來源黃色素具有生理活性與保健功能，如抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗糖尿病、抗肥胖、抗炎等作用[8]，并廣泛應用于食品、化妝品、制藥等行業中[1，9]，在國內外市場上有著廣泛的應用前景[10]。然而，除少數天然、半天然紅曲黃色素可大規模生產、銷售外，天然黃色素市場上多為植物提取類黃色素，未見其他種類微生物天然黃色素產品[11]。因此，篩選新的高產優質黃色素菌株以及開發、生產安全、廉價、優質的天然微生物黃色素具有廣闊的應用前景與經濟潛力。

本研究從蘆葦根部土壤中分離到一株產黃色素細菌，對細菌種屬進行鑒定，并對其所產黃色素的性質及其合成色素的培養條件進行研究，為進一步開發利用此菌株生產黃色素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母浸出粉、胰蛋白胨：英國Oxoid公司；葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖：天津北方天醫試劑公司；氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、甘油、可溶性淀粉：天津市化學試劑一廠；大豆蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白粉、豆粕粉、黃豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、尿素：天津市永大化學試劑開發中心；甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；DNA聚合酶：武漢金開瑞生物工程有限公司。除特殊標注外，其它試劑均為分析純。

LB培養基：5 g/L酵母浸出粉、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化鈉。

1.2 儀器與設備

DELTA320型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；TCL-12型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀儀器有限公司；NU-T5型紫外分光光度計：天津市華偉科技有限公司；DL-820D型超聲波振蕩器：宏富信精密科技（北京）有限公司；BX-43型光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；伯樂T100型PCR基因擴增儀：上海皓莊儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產黃色素細菌的篩選

取1g蘆葦根部土壤加入到50 mL滅菌的LB液體培養基中，37℃、180 r/min振蕩培養12 h；取1 mL菌懸液富集培養，將富集菌液稀釋106倍，取100 μL稀釋液涂布于LB固體培養基上[12]，培養一段時間后出現亮黃色菌落，挑取菌落分離純化3次。挑取單菌落至LB固體斜面培養基上，編號BX-1菌株，置于4℃冰箱備用。

1.3.2 菌株的鑒定

從斜面上挑取BX-1單菌落至滅菌的LB液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養 12 h，取 10 μL 菌液進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細胞形態。

取菌液稀釋并置于基因擴增儀中98℃裂解10min，以裂解菌液為模板，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株16S rRNA基因進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增[13]。PCR 體系：模板1 μL、上游引物27F和下游引物1492R各1 μL、DNA 聚合酶 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 程序：95 ℃預變性 5 min、95℃變性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸45 s并循環30次、72℃再延伸10 min。PCR產物取2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，將產物送至金唯智公司測序。測序結果通過NCBI數據庫進行同源性對比分析以明確菌株的種屬關系，選取同源性高的16S rRNA基因，并通過MEGA7軟件以鄰接法構建系統發育樹[14]。

1.3.3 黃色素提取與光譜特性分析

刮取LB固體培養基上的BX-1菌落0.1 g，加入甲醇溶液2 mL，在40℃水浴條件下超聲裂解15 min，8 000 r/min離心5 min，獲得黃色素提取液[15]。以甲醇為空白對照，用紫外分光光度計對甲醇黃色素提取液進行全波段掃描。

1.3.4 固態培養條件優化

1.3.4.1 不同培養溫度對BX-1菌株產黃色素的影響

取2 μL BX-1活化菌液點種于LB固態培養基上，并分別放置于 37、30、28、20 ℃溫度下培養 240 h。因胞內色素產量與其菌體量呈正相關，故以菌落直徑、菌落顏色變化和初步提取胞內色素OD438nm值作為試驗分析依據。每隔48 h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.4.2 不同光照條件對BX-1菌株產黃色素的影響

取2 μL BX-1活化菌液點種于LB固態培養基上，并分別放置于白熾燈光與黑暗無光條件下培養240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5 固態培養基優化

1.3.5.1 不同碳源對BX-1菌株產黃色素的影響

在LB固體培養基的基礎上，分別添加1%葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、甘油、可溶性淀粉，共10種不同的碳源。取2 μL BX-1活化菌液點種于添加不同碳源的固態培養基上培養240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5.2 不同氮源對BX-1菌株產黃色素的影響

在LB固體培養基的基礎上，分別添加1%酵母浸出粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、蛋白粉、豆粕粉、黃豆餅粉、花生餅粉、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、尿素，共13種不同的氮源。取2μLBX-1活化菌液點種于添加不同氮源的固態培養基上培養240 h，每隔48h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5.3 不同初始pH值對BX-1菌株產黃色素的影響

用4 mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液分別調節培養基初始 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。取 2 μL BX-1 活化菌液點種于不同初始pH值的固態培養基上培養240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5.4 最適碳、氮源種類與磷元素濃度正交試驗

根據碳、氮源單因素試驗分別選取3種對BX-1菌株產黃色素影響效果最好的碳、氮源，碳源：1%可溶性淀粉、1%谷氨酸鈉、1%葡萄糖。氮源：1%酵母浸出粉、1%豆粕粉、1%牛肉膏。查閱文獻[16]可知磷酸二氫鉀與硫酸鎂對細菌產黃色素有明顯的促進效果。故選取0.10%、0.15%、0.20%磷酸二氫鉀與3種碳源、3種氮源，使用Minitab 18正交設計軟件，設計L9（33）正交試驗，以確定最佳碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度。分別在固態培養基上培養240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。正交試驗設計見表1，L9（33）正交試驗分組見表2。

表1 L9（33）碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度正交試驗設計Table 1 L9（33）Orthogonal experimental design of carbon and nitrogen source types and potassium dihydrogen phosphate concentration

表2 L9（33）碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度正交試驗分組Table 2 L9（33）Orthogonal test grouping table of carbon and nitrogen source types and potassium dihydrogen phosphate concentration

續表2 L9（33）碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度正交試驗分組Continue table 2 L9（33）Orthogonal test grouping table of carbon and nitrogen source types and potassium dihydrogen phosphate concentration

1.3.5.5 最適碳、氮源、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗

根據1.3.5.3與1.3.5.4的試驗結果，選取不同濃度的谷氨酸鈉、豆粕粉和硫酸鎂，與不同初始pH值，使用Minitab 18正交設計軟件，設計L9（34）正交試驗，以確定最適谷氨酸鈉、豆粕粉和硫酸鎂濃度與初始pH值。分別在固態培養基上培養240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態、大小與顏色變化，每組3個平行。正交試驗設計見表3，L9（34）正交試驗分組見表4。

表3 L9（34）谷氨酸鈉、豆粕粉、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗設計Table 3 L9（34）Orthogonal test grouping table of concentrations of sodium glutamate，soybean meal powder，magnesium sulfate，and initial pH value

表4 L9（34）谷氨酸鈉、豆粕粉、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗分組Table 4 L9（34）Orthogonal experimental design of concentrations of sodium glutamate，soybean meal powder，magnesium sulfate，and initial pH value

1.4 數據處理

所有試驗均設置3組平行，結果取平均值，并使用Origin 9.0版軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 產黃色素菌株的篩選結果

對從土壤中分離獲得的亮黃色菌株以三區劃線法分離轉接純化3次，在LB培養基上篩選出分離純化后的亮黃色菌株，結果見圖1。

圖1 BX-1菌株Fig.1 BX-1 strain

由圖1可知，菌株編號為BX-1。在LB培養基上，BX-1菌落呈圓形凸起、表明光滑、邊緣整齊。BX-1菌株所產黃色素為胞內色素，無向培養基滲透現象。

2.2 BX-1菌株的鑒定結果

對BX-1菌株進行革蘭氏染色，BX-1菌株革蘭氏染色鏡檢顯微放大圖見圖2。

圖2 BX-1菌株革蘭氏染色鏡檢顯微放大圖Fig.2 Microscopic magnification of Gram staining of BX-1 strain

由圖2可知，在1 000倍顯微鏡下觀察，BX-1菌株呈短桿狀、密集堆疊排列、無芽孢，為革蘭氏陽性細菌。

對BX-1菌株16S rRNA基因進行PCR擴增，結果見圖3。

圖3 BX-1菌株16S rRNA基因PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis of 16S rRNA gene of BX-1 strain

由圖3可知，擴增產物條帶于1 500 bp處明亮清晰。將PCR擴增序列送至金唯智公司測序。擴增產物測序結果經NCBI數據庫進行同源性比對，選取同源性較高的16S rRNA基因序列，構建系統發育樹，結果如圖4所示。

圖4 基于16S rRNA序列BX-1菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of BX-1 strain based on 16S rRNA sequence

由圖4可知，BX-1菌株與鹽生谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola）的親緣關系最近[17]，處于系統發育樹的同一分枝，確定BX-1菌株為G.halophytocola，即鹽生谷氨酸桿菌。

2.3 黃色素提取與光譜分析結果

BX-1菌體經超聲波破碎，甲醇提取胞內黃色素，全波段掃描提取液結果見圖5。

圖5 BX-1菌株胞內黃色素紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of intracellular yellow pigment of BX-1 strain

由圖5可知，BX-1菌株胞內黃色素共有3個吸收峰，分別處于411、438、467 nm，其中438 nm處吸收峰最高。

葉黃素標品的紫外吸收光譜見圖6。

圖6 葉黃素標品紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of lutein standard

紫外吸收光譜有助于確定色素的結構[18]，由圖6可知，葉黃素標品的紫外吸收光譜與BX-1菌株胞內黃色素的光譜特性相似。推測BX-1菌株產胞內黃色素可能為接近葉黃素的類胡蘿卜色素。

2.4 BX-1菌株產黃色素最適固態培養條件優化結果

2.4.1 不同培養溫度對BX-1產黃色素的影響

按1.3.4.1中的方法在不同溫度下培養BX-1菌株，菌落直徑測量結果見圖7。

圖7 BX-1菌株在不同培養溫度下的菌落直徑與產黃色素OD值Fig.7 Colony diameter of BX-1 strain at different culture temperatures and OD value of yellow pigment

由圖7可知，在20℃與37℃培養條件下，菌株生長均較為緩慢；在30℃與28℃培養條件下生長較快、菌苔厚實。肉眼觀察菌落顏色，可知培養至240 h時，只有20℃培養條件下菌落呈現亮黃色。其它溫度下，菌體生長呈現出部分淺黃色或乳白色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見20℃條件下培養的BX-1菌株產黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于其它溫度條件。故推測，BX-1菌株為溫敏型黃色素產生菌[19]，可能存在黃色素合成溫度調控元件，低溫環境時啟動相關基因的表達轉錄[20]。考慮試驗條件與資源能耗的合理利用，選擇20℃作為BX-1菌株產黃色素的培養溫度。

2.4.2 不同光照條件對BX-1產黃色素的影響

BX-1菌株經不同光照條件培養的菌落直徑與產黃色素OD值見圖8。

圖8 BX-1菌株經不同光照條件培養的菌落直徑與產黃色素OD值Fig.8 Moss diameter of BX-1 strain cultured under different light conditions and OD value of yellow pigment

由圖8可知，白熾燈光與黑暗無光條件下BX-1菌株培養至240 h均可快速生長，白熾燈光照培養生長較快，黑暗條件生長較慢。肉眼觀察菌落顏色，可見白熾燈光照條件下，BX-1菌株培養至48 h即產生黃色素，至240 h菌落呈亮黃色且菌苔厚實；黑暗條件下培養至144 h時菌落才呈現黃色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，白熾燈光照培養的BX-1菌株產黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于黑暗組。

由圖8可知，光照的刺激會誘導BX-1菌株大量合成黃色素。光是自然界的能量來源，也是調節生命活動的重要信號，光能影響細菌的生長發育、生理周期及次生代謝產物的產生[21]。Mohana等[22]研究表明生存在高輻射環境下的藤黃微球菌所產黃色素可吸收紫外線來保護自身。故BX-1菌株受可見光光照刺激時，合成黃色素相關代謝途徑可能會更加活躍，產生大量黃色素以對抗外部環境變化。

根據培養BX-1菌株時的菌落形態變化發現，菌株培養超過240 h后，菌落呈現老化現象，故統一培養觀察至240 h，以保證試驗的穩定性與準確性。綜上，BX-1菌株產黃色素最適固態培養條件優化結果為BX-1菌株放置于20℃光照培養240 h。

2.5 BX-1菌株產黃色素最適固態培養基優化結果

2.5.1 碳源對BX-1產黃色素的影響

不同碳源培養240 h的BX-1菌株的菌落直徑測量結果見圖9。

圖9 BX-1菌株在不同碳源培養基上的菌落直徑Fig.9 Bacterial moss photos of BX-1 strain cultured on different carbon sources

由圖9可知，BX-1菌株具有多種碳源適應性，培養至240 h均可快速生長。其中，以可溶性淀粉作為碳源的BX-1菌株生長最快，菌落直徑最大；其次為蔗糖、葡萄糖、果糖、谷氨酸鈉；以檸檬酸鈉、乙酸鈉為碳源的BX-1菌株生長緩慢。肉眼觀察菌落顏色，可見培養至240h，在谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、可溶性淀粉作為碳源的培養基上BX-1菌落均呈現亮黃色且菌苔厚實；BX-1在其他7類碳源上菌落顏色較淺，呈白色或淺黃色。

因此，BX-1菌株最適產黃色素碳源為可溶性淀粉。BX-1菌株可產生淀粉酶來分解利用可溶性淀粉以促使菌落快速生長，同時在分解淀粉的代謝過程中可促使菌株積累次生代謝產物黃色素[23]。

2.5.2 不同氮源對BX-1產黃色素的影響

不同氮源培養的BX-1菌株，菌落直徑測量結果見圖10。

圖10 BX-1菌株在不同氮源培養基上的菌落直徑Fig.10 BX-1 bacterial moss diameter on different nitrogen source medium

由圖10可知，BX-1菌株對多種有機氮源均可很好利用，其中以大豆蛋白胨為氮源時，BX-1菌株長勢最快，菌落直徑最大；豆粕粉、黃豆餅粉、花生餅粉等有機氮源也可促使菌株快速生長；BX-1菌株在無機氮源尿素、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨中生長最緩慢。肉眼觀察菌落顏色，可見培養至240 h時，以牛肉膏、酵母浸出粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨、豆粕粉、黃豆餅粉為氮源時，BX-1菌落呈現亮黃色且菌苔厚實；在其他氮源上，BX-1菌落則呈現白色、乳白色或淺黃色。

BX-1菌株利用天然有機蛋白質作為氮源可積累大量黃色素，能夠利用無機氮源生長但產黃色素量較低。可見其黃色素積累可能受天然有機蛋白質中某些氨基酸分子或小肽的誘導，促使胞內黃色素的快速代謝合成[24]。大豆蛋白胨可以促使菌株快速生長但不誘導菌株產黃色素，所以初步選擇豆粕粉作為氮源。

2.5.3 初始pH值對BX-1產黃色素的影響

不同初始pH值培養基上培養的BX-1菌落直徑測量結果見圖11。

圖11 BX-1菌株在不同初始pH值培養條件下的菌落直徑Fig.11 BX-1 bacterial moss diameter under different initial pH conditions

由圖11可知，BX-1菌株在pH6.0～11.0范圍內均可快速生長。在初始pH值為6.0時，BX-1菌株生長最快，菌落直徑最大；在初始pH值為6.5～8.5時，菌落直徑相近無明顯差異。在初始pH值大于10.0或小于6.0時，BX-1菌株生長緩慢，菌落直徑較小。肉眼觀察菌落顏色，可見培養至240 h時，在不同初始pH值下BX-1菌落均呈現不同程度的黃色。初始pH值為6.0～8.5與10.0時菌落呈亮黃色，其他初始pH值下菌落顏色較淺。

由此可知，BX-1菌株在pH6.0～10.0范圍內均可產黃色素。說明BX-1菌株有著極廣泛的酸堿適應性，在偏酸環境下更有利于菌株的生長，但在中性偏堿環境下更有利于菌株合成積累黃色素。綜合菌株生長與產黃色素兩個因素，初步選擇pH6.0作為最適初始pH值。

2.5.4 最適碳、氮源種類與磷元素濃度正交試驗結果

為研究不同碳、氮源交互作用對BX-1菌株產黃色素的影響，分別選擇對BX-1菌株產黃色素較好的3種不同碳源、氮源，并與不同濃度磷酸二氫鉀進行正交試驗。BX-1菌落直徑測量結果見圖12。

圖12 BX-1菌株L9（33）正交試驗菌落直徑Fig.12 Colony diameter of BX-1 strain L9（33）in orthogonal experiment

由圖12可知，9組正交試驗BX-1菌株菌落直徑均高于對照組（0組，LB培養基），說明正交試驗添加的碳、氮源與磷酸二氫鉀可以有效促使BX-1菌株積累黃色素。其中，以第5組最佳，即1%谷氨酸鈉、1%豆粕粉、0.2%磷酸二氫鉀，菌落直徑明顯高于其他組。肉眼觀察菌落顏色，可見培養至240 h，1～6組試驗組與對照組BX-1菌落均呈亮黃色，菌苔厚實致密。7、8、9組中BX-1菌落則呈現部分淺黃色。

正交試驗分析結果見圖13。

圖13 BX-1菌株L9（33）正交試驗分析結果Fig.13 Results of orthogonal experiment of BX-1 strain L9（33）

由圖13可知，均值主效應圖中縱坐標均值的均值數據分析顯示，B氮源最高點B2與最低點B3差值最大，C磷酸二氫鉀最高點C3與最低點C1差值最小，所以氮源對BX-1菌株的生長影響最為明顯，碳源次之，磷酸二氫鉀影響最小；圖13分析預測可促使BX-1菌株生長產黃色素的最佳點分別是A2谷氨酸鈉、B2豆粕粉、C30.20%磷酸二氫鉀，所以正交試驗結果分析的最適組合為碳源谷氨酸鈉、氮源豆粕粉、0.20%磷酸二氫鉀，與正交試驗組中的最佳組合（第5組）一致。由圖13可知，磷酸二氫鉀濃度增加對BX-1菌株產黃色素呈正向促進作用，且圖中沒有出現拐點，需增設磷酸二氫鉀濃度單因素試驗以找出最適值。

增設磷酸二氫鉀0.20%～0.35%濃度，觀察其對BX-1菌株生長和產黃色素的影響，結果見圖14。

圖14 BX-1菌株在不同磷酸二氫鉀濃度下培養的菌落直徑與產黃色素量OD值Fig.14 Moss diameter of BX-1 strain cultured under different potassium dihydrogen phosphate concentrations and OD values of yellow pigment

由圖14可知，磷酸二氫鉀濃度為0.25%～0.30%時，BX-1菌落直徑大小相近，均大于另外2組。肉眼觀察菌落顏色，可見0.20%～0.35%濃度的磷酸二氫鉀培養至240 h的BX-1菌落均厚實且呈亮黃色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見0.25%磷酸二氫鉀濃度組的BX-1菌株所產黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于其他組。

由此得出，BX-1菌株最適培養基組成為1%谷氨酸鈉、1%豆粕粉、0.25%磷酸二氫鉀。相比于可溶性淀粉與葡萄糖，谷氨酸鈉可以直接進入三羧酸循環，更有利于被BX-1菌株吸收利用，為菌株生長與合成黃色素提供能量；豆粕粉來源廣泛、價格便宜且富含各類營養物質，尤其含有多種氨基酸與小分子多肽類物質，易于吸收利用，可以使菌株快速合成并積累黃色素；磷是輔酶、輔基、腺嘌呤核苷三磷酸等物質的組成成分，能調節代謝流向與次級代謝產物的合成，在合適的濃度下能促使BX-1菌株高產黃色素[25]。

2.5.5 最適碳、氮源、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗結果

在不同谷氨酸鈉、豆粕粉、硫酸鎂濃度和不同初始pH值正交組合下培養的BX-1菌落直徑測量結果見圖15。

圖15 BX-1菌株L9（34）正交試驗菌落直徑Fig.15 Coat diameter of BX-1 strain L9（34）in orthogonal experiments

由圖15可知，第4組a2b1c2d3組合，即谷氨酸鈉3%、豆粕粉3%、硫酸鎂0.05%、初始pH值6.0條件下所培養的BX-1菌落直徑最大，明顯高于其他組合。肉眼觀察菌落顏色，可見9組BX-1菌株培養至240 h均呈現亮黃色。

正交試驗分析結果見圖16。

圖16 BX-1菌株L9（34）正交試驗分析結果Fig.16 BX-1 strain L9（34）orthogonal experimental analysis results

由圖16可知，均值主效應圖中縱坐標均值的均值數據分析顯示，a谷氨酸鈉濃度最高點a2與最低點a1差值最大，c硫酸鎂濃度最高點c1與最低點c3差值最小，所以谷氨酸鈉濃度對BX-1菌株的生長影響最大，豆粕粉濃度與初始pH值次之，硫酸鎂濃度對BX-1菌株生長影響程度最小；圖16分析預測可促使BX-1菌株生長產黃色素最佳點分別是a2谷氨酸鈉3%、b1豆粕粉3%、c1硫酸鎂0.1%、d2初始pH值7.0，所以正交試驗分析結果最佳組合為3%谷氨酸鈉、3%豆粕粉、0.1%硫酸鎂、初始pH7.0，即a2b1c1d2組合。與正交試驗中的最佳組第4組a2b1c2d3組合存在差異，需試驗驗證以篩選最優組合。均值主效應圖中未出現豆粕粉濃度的拐點，無法確定最適豆粕粉濃度，需補做試驗加以確定。

BX-1菌株L9（34）正交驗證試驗菌落直徑與產黃色素量OD值見圖17。

圖17 BX-1菌株L9（34）正交驗證試驗菌落直徑與產黃色素量OD值Fig.17 BX-1 strain L9（34）orthogonal validation test moss diameter and OD value of yellow pigment

由圖17可知，不同組合驗證試驗所培養的BX-1菌落直徑相近。肉眼觀察菌落顏色無差別，兩組菌株培養至240 h均呈現亮黃色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見正交試驗分析所得a2b1c1d2組合產黃色素在438 nm處OD值明顯高于正交試驗組中的第4組a2b1c2d3組合。a2b1c1d2組合相較于a2b1c2d3組合硫酸鎂濃度更高，初始pH值7.0為中性。研究表明中性偏堿環境更適于多數細菌的生長代謝，偏酸環境會對細菌生長有抑制作用；鎂離子能調控信號傳遞、參與蛋白質的合成，是細菌新陳代謝過程中必不可少的微量元素[17]。上述試驗結果表明，0.1%硫酸鎂與中性初始pH值組合更能促使BX-1菌株大量合成黃色素。

BX-1菌株在不同豆粕粉濃度下培養的菌落直徑與菌株產黃色素量OD值見圖18。

圖18 BX-1菌株在不同豆粕粉濃度下培養的菌落直徑與菌株產黃色素量OD值Fig.18 Moss diameter of BX-1 strain cultured in different soybean meal concentrations and OD value of yellow pigment

由圖18可知，在1%～3%濃度范圍內，豆粕粉濃度增加對BX-1菌株產黃色素呈正向促進作用，推測最適豆粕粉濃度應大于等于3%，故分別以2%、3%、4%、5%濃度豆粕粉培養BX-1菌株。如圖18所示，當豆粕粉濃度為3%時，BX-1菌落直徑最大，明顯高于其它組。肉眼觀察菌落顏色，菌苔均呈現亮黃色無明顯差別。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見3%豆粕粉濃度的BX-1菌株所產黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于其它濃度。

由此可見，最適碳氮、源、硫酸鎂濃度與最適初始pH值正交試驗的最優結果為3%谷氨酸鈉、3%豆粕粉、0.1%硫酸鎂、最適初始pH7.0。

3 結論

本研究以一株從蘆葦根部鹽堿地土壤中分離篩選出的產黃色素菌株BX-1為研究對象，以LB培養基為基礎優化培養基，通過形態學觀察發現BX-1菌落呈圓形凸起、表明光滑、邊緣整齊、亮黃色、產胞內黃色素。經由革蘭氏染色鏡檢與分子生物學方法鑒定出BX-1菌株為不產芽孢的短桿狀革蘭氏陽性細菌，鹽生谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola）。對BX-1菌株胞內黃色素進行提取，可知該黃色素易溶于甲醇，為脂溶性色素，紫外光譜掃描顯示其在411、438、467 nm 3處有吸收峰，438 nm處吸收峰最高，與葉黃素光譜特性相似，推測BX-1黃色素可能為接近葉黃素的類胡蘿卜素，其提取純化產物及分子結構還需大量試驗分析驗證。培養溫度與光照條件的單因素試驗表明，BX-1菌株最適生長溫度為30℃，合適產黃色素溫度為20℃，即BX-1菌株為溫敏型黃色素產生菌，產黃色素需低溫誘導以開啟相關調控元件，同時也需要外部光照刺激菌株大量合成黃色素，故BX-1菌株最適固態培養條件為20℃光照培養240 h。設計碳、氮源、初始pH值、無機鹽的單因素與正交試驗，通過記錄分析菌株在不同條件下的菌落生長直徑、肉眼觀察菌落顏色變化以及測量比較不同條件生長BX-1菌株產黃色素在438 nm處OD值，得出最適BX-1菌株生長與合成黃色素的固態培養基組成為3%谷氨酸鈉、3%豆粕粉、0.5%酵母浸出粉、1%氯化鈉、0.25%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂、初始pH7.0。上述研究結果鑒定了BX-1菌株的種屬，初步確定了促使BX-1菌株產黃色素的培養條件與培養基組成以及BX-1黃色素的部分性質，為BX-1菌株產黃色素的進一步開發利用以及BX-1黃色素結構的研究分析提供參考。