DNA酶生物傳感器在食源性致病菌檢測中的研究進展

閆夏萌，張蘊哲，盧鑫，徐慧，張偉，3，4，袁耀武*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北農業大學理工系，河北 滄州 061100；3.河北農業大學生命科學學院，河北 保定 071001；4.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室，河北 保定 071000）

近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒事件逐年增加，人類食用被致病菌污染的食品可能會引起胃腸炎、腦膜炎、敗血癥等疾病，嚴重時會危及生命[1]。目前常見的食源性致病菌有致病性大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌等，它們廣泛存在于水產品、乳制品中，會引發各種嚴重疾病[2]。2019年在南非由單核細胞增生李斯特菌感染暴發的食源性疾病，導致多人死亡[3]；2020年，寧夏報告了因食用被鼠傷寒沙門氏菌污染的牛肉造成多人發病[4]。因此，實現快速、準確、靈敏的食源性致病菌檢測，對預防公共衛生安全和食品安全至關重要。

各國針對各類食品基質中微生物最高含量制定了相應標準，我國則依據GB 4789.1—2016《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗總則》為食品安全提供參考標準[5]。其中傳統培養法檢測周期長、程序繁瑣，不適合快速篩查[6]。基于抗原-抗體特異性相互作用的免疫學方法操作簡單，但靈敏度和準確性不足[7]。隨著分子生物學技術發展，相繼開發了多種基于核酸擴增的方法，在病原體檢測中發揮了至關重要的作用。目前，常用的核酸擴增技術包括聚合酶鏈式擴增（polymerase chain reaction，PCR）技術、滾換擴增技術（rolling circle amplification，RCA）等。分子生物學技術憑借其檢測靈敏、特異性強、靈敏度高等優點而被廣泛應用。

隨著指數富集配體的系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）的發展，除了通過人工篩選發現的適體，還獲得了具有催化功能的DNA序列，這些催化DNA分子通常被稱為DNA酶（DNAzyme）[8]。自1994年首次報道DNA酶以來，已從DNA文庫中篩選和鑒定出數百個具有良好催化活性的DNA分子[9]。DNA酶憑借其易于合成修飾、成本低廉、良好的熱穩定性和化學穩定性等優勢，被廣泛應用于致病菌檢測。

本文綜述近年來基于DNA酶技術開展食源性致病菌檢測的研究進展和2種不同DNA酶機制，并從分類及應用范圍進行介紹，旨在介紹DNA酶技術檢測食源性致病菌研究的發展現狀，為新型食源性致病菌檢測技術開發提供參考。

1 DNA酶機制分類

功能性核酸（functional nucleic acids，FNA）是通過SELEX技術從隨機DNA或RNA序列文庫中篩選得到的單鏈寡核苷酸序列，主要包括適配體和DNA酶兩種[10-11]。DNA酶是一類具有酶特性的FNA，主要表現為RNA切割活性、DNA連接酶活性、DNA水解活性和DNA激酶活性。其中，基于模擬辣根過氧化物酶活性（horseradish peroxidase，HRP）和核酸切割DNA酶活性（RNA-cleaving DNAzyme，RCD）應用最為廣泛[12]。

1.1 基于模擬辣根過氧化物酶活性

作為一種分子報告元件，DNA鏈憑借其獨特的二級結構，在輔因子的協助下模擬天然酶催化各種氧化反應，產生可監測信號[12]。目前，模擬HRP活性研究中G-四鏈體（G-quadruplex）技術應用最為廣泛。富含鳥嘌呤（G）的DNA序列通過形成分子內G-四鏈體，可以與血紅素（Hemin）緊密結合，形成G-四鏈體-Hemin DNA 復合物（GQ-DNAzyme，GQ），表現出 HRP 活性[13]。GQ-DNAzyme與蛋白酶相比具有制造簡單、成本低、儲存方便、穩定性高等優點[14]。

當血紅素與G-四鏈體結合，G-四鏈體能為血紅素提供軸向配體和疏水環境，催化O-O不對稱斷裂，類似于HRP中遠端組氨酸的功能[15]。G-四鏈體還為血紅素提供了一種平面結構，促進了氫的交換，提高其穩定性和催化活性[16]。GQ-DNAzyme與蛋白酶相比，成本低且容易獲得[17]。Luo等[18]開發了一種基于PCR和DNAzyme技術的幽門螺桿菌檢測方法，利用特殊設計的引物使PCR產物的3'端含有形成DNAzyme的G-四鏈體序列，血紅素與G-四鏈體結合后形成GQDNAzyme，可催化 H2O2介導的 2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸轉化為綠色自由基陽離子，顏色會發生變化，該方法可通過肉眼檢測低至100 pg/μL的基因組DNA。基于DNAzyme開發的檢測技術因其良好的特異性和靈敏度而被廣泛用于病原微生物的檢測。此外，G-四鏈體還可以同熒光染料結合，也顯示出較大的發展潛力。

熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發射出另一波長大于吸收光光波的物質，它們大多是含有苯環或雜環并帶有共軛雙鍵的化合物[19]。憑借優異的光物理性能、良好的生物相容性以及易于合成和修飾等優點廣泛用于致病菌檢測，但熒光染料的性能也受多種因素（如溫度、pH值、光照、核酸類型、分子性質）影響。研究發現，G-四鏈體與某些特異性結構陽離子熒光染料通過靜電相互作用、π堆積或與G-四鏈體結構的環、槽或磷酸骨架的氫鍵相互作用增強熒光信號[20]。此外，G-四鏈體的高熱穩定性能夠避免染料間的批次差異[21]。目前，同G-四鏈體結合并產生熒光信號（主要是熒光增強）的熒光染料見表1[22]。其中，菁類染料及其衍生物硫磺素T、卟啉類染料N-甲基卟啉二丙酸IX等化合物應用最為廣泛[23]。Chen等[24]開發了一種基于碲化鎘量子點和N-甲基卟啉二丙酸IX的雙熒光可視化方法用于檢測致病性大腸埃希氏菌，該方法可檢測低至10 CFU/mL的致病性大腸埃希氏菌，能實現致病菌的實時檢測。

表1 常用于G-四鏈體染料按作用類型分類Table 1 Classification of common G-quadruplex dyes according to action mechanism

基于DNAzyme檢測技術在致病菌檢測方面已取得重大進展，但仍存在活性不足、輸出信號不穩定等問題。目前常用的DNAzyme活性調節方法有：1）改變G-四鏈體序列，使其拓撲結構變化[25]；2）篩選合適陽離子，使G-四鏈體結構變化，影響其與血紅素的結合[26]；3）在G-四鏈體的3'端添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，提高其催化活性[27]；4）添加三磷酸腺苷穩定催化過程中產生的自由基以提高DNAzyme催化活性[28]。此外，研究還發現血紅素本身具有類HRP活性，產生背景信號，降低方法靈敏度。Zhang等[29]通過篩選一系列染料后發現血紅素抑制劑（SYBR Green I，一種DNA染色染料）可以抑制背景信號，只需添加0.84 μmol/L SYBR Green I，50 nmol/L血紅素的背景就會被抑制30倍以上，為調節DNAzyme活性開辟了新思路。

1.2 基于核酸切割活性

核酸切割DNA酶活性（RNA-cleaving DNAzyme，RCD）是mRNA加工過程中發現的一種核酸切割DNA-zyme[30]。當體系中存在靶物質時，RCD可以催化RNA在DNA序列特定位點進行切割（如3'端磷酸二酯鍵），從而破壞mRNA轉錄過程。作為分子識別元件，RCD具有識別細菌生物標記物、RNA切割和熒光生成等功能，再結合各種信號轉導方式，開發出多種檢測方法[31]。Zhang等[6]通過在體外選擇，使用來自給定微生物的粗制細胞外基質作為復合靶標，繞過傳統鑒別方法中目標菌株的分離和鑒定步驟。針對目標細菌粗制細胞外基質組分的龐大DNA文庫來生成細菌特異性的DNAzyme傳感器，開發出便捷的分析方法來直接檢測目標微生物。Shen等[32]開發了一種具有熒光信號生成能力的DNAzyme，即RNA切割熒光DNA酶。該研究將致病性大腸埃希氏菌培養物中的粗制細胞外基質作為復合靶標，通過切割靶物質特定位點，使熒光團與猝滅劑分離，產生熒光信號。該方法靈敏度較高，可檢測低至100個致病性大腸埃希氏菌細胞。

2 基于DNAzyme在生物傳感器中的分類與應用

生物傳感器由識別元件、受體和傳感層組成，識別元件特異性識別目標分析物（病原菌），在傳感層傳導下產生可測量的生物識別信號。基于不同生物傳感構件構建的生物傳感器能有效發揮其作用并在致病菌檢測方面顯示突出優勢[33]。

2.1 比色生物傳感器

比色法是通過肉眼直接觀察顏色深淺或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的一種定量檢測方法，具有操作簡單、成本低等優勢[34]。根據制備比色傳感器的材料或試劑的類型不同，可分為以下4個：1）基于靶誘導的顆粒間距離、尺寸、形態或組成變化的等離子體納米粒子（如銀、金納米粒子）的顏色變化[35]；2）光子晶體對目標的熒光調節或顏色變化[36]；3）天然酶、酶模擬物、人工酶或納米酶催化的 3′，3′，5′，5′-四甲基聯苯胺 （3'，3'，5'，5'-tetramethylbenzidine，TMB）[37]；4）通過非酶反應直接或間接引起的著色產物的產生或顯色劑的顯色變化[38]。

Qin等[39]開發了一種基于DNAzyme和不對稱重組酶聚合酶擴增的可視化檢測方法，在正向引物（F）的5'末端修飾G-四鏈體互補序列，當體系中存在靶標時，引物特異性識別并結合靶標，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA。當低濃度的反向引物（R）耗盡，將以指數方式生成大量含有G-四鏈體序列的單鏈DNA。此時體系中加入血紅素與含有G4序列的產物結合，產生的G-四鏈體-Hemin DNAzyme可高效催化H2O2與TMB反應，使溶液呈藍色。該方法在較短時間內，通過溶液顏色變化實現對克羅諾桿菌的特異性檢測，檢出限低至2.2 CFU/mL。Yin等[40]基于基因組編輯工具CRISPR-Cas12a的反式切割活性，實現了對沙門氏菌特異性invA基因的高靈敏檢測，結果可通過肉眼或手機定性定量檢測。比色傳感器因其操作方便、可視化檢測而受到人們的青睞，在醫療診斷、蛋白質檢測、毒素和食源性病原體檢測方面提供了一個簡單、快速、靈敏的檢測方法。然而與熒光、化學發光等其他檢測方法相比，比色傳感器靈敏度和特異性較低，檢出限相對較高，僅適用于現場快速檢測。

2.2 熒光生物傳感器

近年來，熒光傳感器技術憑借其優異的檢測性能得到快速發展。分析無需昂貴的設備和儀器即可實現原始樣品或預濃縮樣品中的靶物質的測定，從而被廣泛應用于細胞成像、金屬、有機物、酶、細菌等物質的分析檢測中[41-42]。

根據分子的熒光特性，許多具有固有熒光特性的生物分子與配體結合，利用分子熒光行為的變化實現檢測。依據檢測要求不同，需使用不同的熒光標記或探針，追求信號的進一步放大。DNAzyme作為一種信號轉換放大技術，可將檢測信號轉換為熒光信號并實現進一步放大。如Zhou等[43]將DNAzyme介導的RNA切割（DNAzyme-mediated RNA cleavage，DRC）、組裝介導的鏈釋放（assembly-mediated strand release，ASR）、催化發夾組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）與分子間G-四鏈體相結合建立了一種雙DNAzyme檢測方法。將先前報道的RCD的DRC反應，命名為EC1。在致病性大腸埃希氏菌存在的情況下，RNA切割熒光DNAzyme與EC1結合形成RFD-EC1復合物，該復合物能特異性識別并結合致病性大腸埃希氏菌，RCD裂解其底物DNA3，產生P1和P2兩個DNA片段。當DNA4/DNA5復合物與DNA1-3結合時，形成四路連接，DNA 5從DNA 4/5復合物中游離出來，觸發CHA反應，使發夾結構H1、H2相互雜交，形成分子間G-四鏈體，與原卟啉IX結合，激發熒光。不存在靶標時，DNA 3保持完整，不與DNA分子1、2和4/5相互作用，不發生后續反應，無熒光響應。該方法可檢測低至50 cells/mL致病性大腸埃希氏菌，且無需蛋白酶參與。

Zhou等[44]建立了一種簡單、高效的DNAzyme熒光磁珠生物傳感器，基于磁珠、DNA酶和光學發光3種信號放大策略用于致病性大腸埃希氏菌O157：H7的檢測。致病性大腸埃希氏菌特異性RCD可以特異性識別粗細胞內混合物中的靶蛋白，從而引起其構象變化，并誘導滾環擴增產生銅納米團簇并使之發光。這種級聯放大設計可以捕獲樣本中的微弱信號，巧妙解決了食源性致病菌檢測中信號弱、靈敏度低的問題，該生物傳感器在10 CFU/mL～1 000 CFU/mL呈現良好的線性范圍，檢測限為1.57 CFU/mL，為生物傳感器的發展提供了新思路。

2.3 電化學生物傳感器

電化學檢測依靠化學物質與固定探針（例如DNA）在電極間的相互作用來達到檢測目的，因其較高的靈敏度與尺寸小等優勢廣泛用于致病菌檢測。電化學生物傳感器主要包含3個類型：依賴于電極修飾、固液相反應放大阻抗信號進行檢測的阻抗生物傳感器[45]、依靠在電極上發生氧化還原反應產生電流、電壓變化的電流/伏安生物傳感器以及其他類型的電化學生物傳感器[46-47]。在檢測方面，3種類型的電化學生物傳感器對于致病菌檢測并無不同，只是信號轉換和放大方面存在差異。

典型的電化學生物傳感器由特異性結合目標的生物受體、換能器元件和數據分析器組成。在生物受體和目標物相互作用時，信號以電子的形式產生，利用數據分析的傳感器對該信號進行電子測量[48]。Guo等[49]開發了一種基于RCA和模擬辣根過氧化物酶活性的DNA酶的致病性大腸埃希氏菌檢測技術，首先將致病性大腸埃希氏菌多克隆抗體固定在電極表面，在靶物質（致病性大腸埃希氏菌）存在下，致病性大腸埃希氏菌特異性識別被捕獲在電極表面。加入適配體-引物探針，探針與表面捕獲的致病性大腸埃希氏菌結合。隨后探針引物游離序列部分參與后續的RCA反應，產生了大量含G-四鏈體結構的長DNA分子。體系中游離的血紅素與G-四鏈體分子結合折疊形成DNAzyme結構，催化H2O2產生電化學響應。該方法與傳統電化學方法相比，大大提高了生物傳感器的靈敏度，檢測限低至8 CFU/mL。此外，Bai等[50]還將RCA與繭狀DNA納米結構相結合，開發了一種致病性大腸埃希氏菌O157：H7的特異性檢測方法。通過RCA產生大量的G-四鏈體序列，利用血紅素進行信號放大。該方法在10 CFU/mL～106CFU/mL呈現良好的線性范圍，檢測限為10 CFU/mL。

2.4 表面等離子體共振

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是表面增強拉曼的重要增強機理之一，由于金屬納米粒子的尺寸效應及量子效應通過激發光照射能引起表面等離子共振，從而大大增強拉曼散射信號，達到痕量檢測的目的[51]。SPR技術以其所需樣本容量小、檢測快速以及低成本而備受關注。到目前為止，SPR已成功用于多種生物分子（核酸、小分子、蛋白質等）的檢測。SPR傳感器利用納米材料和生物材料實現對金屬膜上各種物質的檢測[52]。然而，傳統的SPR樣品通道間由于排列緊密，存在相互干擾的情況，無法檢測到折射率的微小變化，限制了SPR的進一步應用，尤其是對復雜基質中痕量靶標的檢測[53]。因此，許多研究人員一直致力于采用新型傳感器結構來提高SPR傳感器的靈敏度。如Yu等[54]開發了一種名為“DNAzyme集等離子體納米傳感器”用于檢測致病性大腸埃希氏菌，該方法將致病性大腸埃希氏菌特異性RCD作為分子識別元件，酶響應等離子體納米粒子的局部表面等離子體共振作為信號讀數，通過雜交鏈式反應（hybridization chain reaction，HCR）的級聯信號放大過程和磁珠上的酶催化2個傳感元件，實現肉眼檢測小于50 CFU/mL的致病性大腸埃希氏菌。

Xia等[55]利用自催化多組分脫氧核酶（multi-component DNAzyme，MNAzyme）切割和HCR開發了一種新型SPR生物傳感器實現金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和致病性大腸埃希氏菌的快速靈敏檢測。該方法將修飾在磁珠上的MNAzyme作為分子識別和信號放大元件，與SPR傳感膜上HCR介導的納米線自組裝相結合將信號進一步放大，檢測限分別低至67、57 CFU/mL和61 CFU/mL，表現出優異的性能和高靈敏度。

2.5 其他

除了上述基于DNAzyme在致病菌檢測的應用，DNAzyme也可同納米材料、微流控技術和免疫學技術等相結合，應用于致病菌檢測。當納米材料（石墨烯、氧化石墨烯、磁性納米材料等）和DNAzyme聯用，將DNAzyme特異性識別的優勢同納米材料的信號轉導能力相結合，可進一步提高檢測靈敏度，拓寬DNAzyme生物傳感技術應用范圍。Zheng等[56]開發了一種基于DNA與銀納米團簇（DNA-AgNCs）相結合的熒光檢測技術。其中DNAzyme作為識別元件，DNA-AgNCs復合物作為熒光信號元件，實現了致病性大腸埃希氏菌的超靈敏檢測。微流控技術因其體積小、分析速度快以及低樣品、試劑消耗等優點而廣泛用于多重樣品的同時分析。如Yu等[57]將含靶標特異性適體的Fe3O4納米金磁珠（Fe3O4@Au）同磁性DNA編碼探針相結合，利用微流控技術建立了一種新型適體傳感器，該檢測可在50 min內定量檢測2種靶標物質，提高檢測效率。Chen等[58]將多分支DNA納米結構修飾的探針與微流控芯片相結合，僅需微量樣品，經3 min分離即可實現多靶標同時檢測。目前，各種新興技術的開發正處于蓬勃發展的階段，與DNAzyme生物傳感器的聯用將進一步推動檢測技術的應用與發展。

3 結語

本文綜述了目前常用于致病菌檢測的2種不同DNAzyme技術，并從分類、技術特點及應用范圍3個方面進行介紹。與其他生物傳感器相比，基于DNAzyme設計的傳感器靈敏度高、特異性強，在致病菌檢測領域具有突出優勢和廣泛的應用前景。但DNAzyme的應用仍有一定的局限性，總結為以下幾個方面：1）DNAzyme催化活性不足。盡管有相關研究可以提高由G-四鏈體組成的DNAzyme的活性，但與蛋白酶的活性相比，其穩定性和催化效率還是有很大的差距；2）特異性識別G-四鏈體的染料篩選。染料可以特異性結合G-四鏈體，具有高組織穿透能力和高發射率。但存在著高背景信號和光漂白等限制，降低檢測靈敏度；3）現場操作困難。目前研究大多在實驗室內進行，如何使DNAzyme在現場檢測（如開發試紙條）和體內測試等臨床應用中發揮穩定作用是當前面臨的主要挑戰。

4 展望

為解決以上問題，未來DNAzyme的探索應致力于以下幾點。首先，需要對目前選擇的DNAzyme進行更加詳細的研究，尤其是金屬離子與目標分析物的之間作用，利用其變構作用激活DNAzyme，而此過程需要金屬離子參與，應更深入探索它們的目標識別機制；其次，目前用于檢測致病菌的DNAzyme僅用作識別靶物質特異性位點，但理論上可以使用任何靶物質來分離適配體，因此可以進行體外選擇以衍生出更多的致病菌特異性RCD過程。需要對DNAzyme進一步表征，確認結合、截斷和突變位點，未來有望分離和表征出更好的DNAzyme；最后，基于核酸與納米材料的相容性，DNAzyme在生物成像和納米材料方面也具有廣闊的應用前景。結合納米技術和DNA納米材料可以進一步濃縮目標分析物并擴大信號，可以設計利用DNAzyme來識別目標，與納米材料結合進行信號轉導，進一步提高病原菌的檢測靈敏度。隨著科學研究和技術的不斷創新和發展，DNAzyme將以更為簡單、便捷的方式廣泛應用于食品中的致病菌檢測和環境監測領域，對保障公共衛生安全具有重要的現實意義和參考價值。