發酵豆制品中生物胺的產生及控制研究進展

劉旭，王軍，課凈璇，馬艷莉，*，席曉麗，王印壯，谷曉東

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，河南 南陽 473004）

發酵豆制品是以豆類為主要原料，經過微生物發酵，再經調配制成的具有特殊風味和形態的食品或調味品。中國的傳統發酵豆制品包括醬油、豆豉、豆醬和腐乳4大類[1]。豆制品作為一種重要的蛋白質來源，受到中國、日本和韓國等亞洲國家人民的青睞。豆制品在發酵過程中會發生一系列生物化學變化，一些難降解的物質會轉變為易于被人體吸收的營養成分[2]，且發酵過程中還產生許多新的功能性物質，如活性肽、不飽和脂肪酸、大豆異黃酮以及不同種類的維生素等[3]。相關研究證明，發酵豆制品有許多的健康益處，包括抗癌、調節葡萄糖攝取、溶栓、促進消化和調節腸道菌群等功能。但有害菌可能在發酵過程中產生潛在的毒性代謝物，如生物胺（biogenic amines，BAs）等[4]。

BAs是一種具有生物活性的低分子堿性含氮有機化合物，存在于含有高蛋白質或游離氨基酸且受微生物或生物化學活性影響的食物中[5]。根據來源可分為內源性BAs和外源性BAs[6]，內源性BAs一般存在于水果等食物中，作為機體調節劑在細胞合成和維持細胞膜穩定中發揮作用；外源性BAs主要存在于發酵食品中。根據結構特點可以將BAs分成3類[7]，分別為脂肪族（尸胺、腐胺、精胺、亞精胺）、芳香族（β-苯乙胺、色胺）和雜環族（組胺、酪胺），根據胺基的數量，可分為單胺（酪胺、苯乙胺）和二胺（組胺，腐胺、尸胺）。BAs在細胞生長代謝中發揮著重要的生理作用[8]，少量攝入時能夠提高新陳代謝水平，促進生長發育、抗氧化和延緩衰老等，但當攝入的BAs達到一定量時就會對身體造成傷害，例如過量酪胺會引起頭痛和血壓升高。組胺被認為是毒性最強的胺[9]，高濃度的組胺會導致惡心、偏頭痛和心臟問題[10]。

目前我國尚未建立有關發酵豆制品中BAs含量的限量標準，一些國家對水產品等食品中BAs的限量進行規定，但各國的限量標準也不統一。美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）規定，水產品中組胺濃度不得超過50 mg/kg，酪胺含量不得超過100 mg/kg，在其他食品中組胺最高限量為50 mg/kg[11]。歐洲食品安全機構（European Food Safety Authority，EFSA）規定食品中組胺限量為 100 mg/kg[12]。我國國家標準只規定了魚類中的組胺含量，高組胺魚類如鮐魚、金槍魚和沙丁魚中組胺限量為400 mg/kg，而在其他海水魚類中，組胺限量規定為200 mg/kg[13]。此外，BAs在亞硝酸鹽存在條件下還可能轉化為潛在的致癌物N-亞硝胺[14]。發酵豆制品中的BAs問題較為嚴峻，因此要進一步改進發酵工藝控制BAs的產生，進一步提高發酵豆制品的食用安全性。

1 發酵豆制品中的BAs

1.1 發酵豆制品中BAs含量

發酵豆制品在中國有悠久的歷史，現階段市場上常見的發酵豆制品主要包括腐乳、豆豉、豆醬、醬油、納豆和韓國清谷醬等。大豆中含有豐富的蛋白質，在發酵過程中蛋白質在蛋白酶的作用下水解產生氨基酸、多肽等物質，氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下生成BAs，含量超標可能會帶來食品安全問題[15]。不同的發酵豆制品中BAs含量不同，具體含量如表1所示。

腐乳是以大豆為原料，經過研磨、制坯、前發酵、鹽腌、后發酵等加工工藝制成的調味品[16]。Liang等[17]研究了腐乳發酵過程中菌落演替和代謝產物的變化對BAs的影響，結果表明，發酵末期總BAs含量最高，且作為毒性最強的BAs，組胺含量為210.53 mg/kg，含量占總BAs的40%以上。Li等[18]通過檢測國內市場中6類腐乳樣品BAs含量發現，青方腐乳中組胺含量為616.28 mg/kg，明顯高于其他類型腐乳，食用后可能會對人體產生危害，因此不適宜每天過量食用腐乳。

醬油作為調味料在日常烹飪中發揮著重要作用，并且在韓國、日本和韓國廣受歡迎。Lu等[19]檢測了40種不同生產廠家的醬油，酪胺的檢出率最高為97.5%，其次為亞精胺（95%）、組胺（92.5%）、尸胺（82.5%）和精胺（80.0%）。不同廠家醬油中BAs含量不同可能與生產工藝和發酵方式有關。

豆豉是將大豆蒸熟后接種毛霉、米曲霉或根霉等發酵劑，然后經過鹽處理和后發酵過程制作而成。豆豉不僅蛋白質、脂肪和碳水化合物含量豐富，還含有多種生物活性物質（如豆豉纖溶酶和大豆異黃酮等）。Gong等[20]利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定豆豉中 BAs，在豆豉中檢測到3種BAs，分別為色胺、腐胺和尸胺，其中含量最高的為尸胺。另外，淡豆豉作為我國一種傳統藥食兩用的中藥材，富含大豆異黃酮和γ-氨基丁酸，具有解表、除煩、宣發郁熱的功能[21]，但對其BAs含量的報道較少。

豆瓣醬的發酵過程一般分為豆瓣預處理、制曲和加鹽發酵等多個階段。朱天傲等[22]測定12種市售豆醬中BAs的含量，結果表明，豆醬中的精胺、β-苯乙胺、酪胺平均含量最高，BAs總體差異較小。曾雪晴[23]的研究發現，腐胺、尸胺、組胺及酪胺是豆醬中主要的BAs，占BAs平均總量的76.4%。

納豆是經過枯草芽孢桿菌發酵的一種傳統功能性食品，營養價值高，因其具有預防心血管疾病的功效在日本較受歡迎。Kim等[24]的研究發現，在21種納豆產品中，β-苯乙胺和酪胺含量較高，其中有9種產品超過限量值，但總BAs含量均沒有超過有害水平（1 000 mg/kg）。納豆中BAs含量不僅受微生物的影響，還受原料的影響，但微生物的影響更大。

清谷醬是韓國傳統的發酵豆制品，具有很高的營養價值。Jeon等[25]對韓國清谷醬60個樣品中的BAs進行分析，結果表明，β-苯乙胺和酪胺含量較高，因此在清谷醬發酵過程中要注意控制酪胺的形成。不同發酵豆制品由于其發酵環境、發酵菌株和制作工藝等因素不同，導致BAs的含量差異較大。由于原料不同，商品運輸和儲存條件不同，導致檢測的發酵豆制品中BAs的含量情況不同[26]。食用過量的發酵豆制品有可能會引起BAs中毒，對身體造成傷害，因此在將發酵豆制品作為調味料時不宜過量使用。

1.2 BAs形成機理

BAs在生物體內主要是由氨基酸脫羧或酮和醛的胺基化和轉氨作用形成[27]。發酵豆制品中BAs主要是組胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺和亞精胺，分別由脫羧酶特異性的作用于組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸和鳥氨酸而形成[28-29]，具有產脫羧酶能力的微生物有芽孢桿菌、假單胞菌、大腸桿菌和沙門氏菌屬的病原體[30]。氨基酸脫羧有2種機制，一種是以5-磷酸吡哆醛為輔酶[31]，另一種則是利用丙酮酰基團輔助氨基酸脫羧酶，將氨基酸中相應的羧基脫去形成對應的胺。影響食物中BAs形成的3個因素：作為BAs前體物質的游離氨基酸含量；產氨基酸脫羧酶的微生物的生長；產胺微生物的適宜生長條件。食品中已經存在的BAs可以用單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）降解來減少BAs對食品的危害[32-33]。

1.3 BAs的檢測方法

目前，BAs的檢測方法主要有HPLC法、液相色譜質譜聯用法、氣相色譜法、毛細管電泳法、薄層色譜法和離子色譜法等。HPLC法具有檢測快速、靈敏度高的特點，是應用較廣泛的定性、定量檢測方法。李大偉等[34]以丹磺酰氯作為衍生劑，利用HPLC法檢測市售腐乳中的BAs含量，結果表明，8種主要的BAs能較好分離，并且定量限在0.60μg/g～1.83μg/g，靈敏度較高。Gil等[35]采用HPLC結合電位檢測法檢測酒精飲料中的10種BAs，測定準確度為86.4%～109.9%，該方法可以在25 min內檢測出10種BAs。Zhang等[36]利用液相色譜-質譜聯用法建立了豆制品等食品中6種BAs的快速檢測方法，結果表明，6種BAs的定量限為0.25 mg/kg～2.50 mg/kg，該方法無需進行衍生。Kamankesh等[37]利用電膜萃取和微萃取-氣相色譜-質譜聯用法測定魚罐頭中的BAs，發現腐胺、酪胺、組胺和尸胺的檢出限分別為 0.03、0.11、0.06、0.29 ng/g，該方法排除了樣品基體的干擾，提高了靈敏度，此方法可以準確、可靠的測定魚罐頭中BAs，也可用于測定其他食品樣品中的BAs含量。薄層色譜法操作簡便，不需要昂貴的設備，可以對多個樣品進行分析。Kounnoun等[38]使用丹磺酰氯作為衍生劑對魚類產品中組胺進行薄層色譜分析，測得回收率為93%～105%，檢測限為4.4 mg/kg，定量限為10.5 mg/kg，與高效液相檢測結果一致。

離子色譜法常用于陰、陽離子的分析，BAs是最弱離子，因此，可以用離子色譜法進行檢測[39]。Palermo等[40]利用離子色譜法和電導檢測方法檢測BAs，該方法分辨率和分離率較好，其檢出限為 23 μg/kg～65 μg/kg，加標空白樣品的定量限為65 μg/kg～198 μg/kg，并通過對葡萄酒、奶酪和金槍魚罐頭等真實樣品的分析，驗證了該方法具有較高的可行性。毛細管電泳分析速度快、分辨率較高，但與HPLC相比，其濃度檢測限較高。Mantoanelli等[41]利用丹磺酰氯對BAs進行衍生，利用毛細管區帶電泳對BAs衍生物進行分離，測得BAs的檢出限為7 μg/L～50 μg/L。BAs檢測方法如表2所示。

表2 BAs檢測方法Table 2 The analytical methods for the determination of BAs

續表2 BAs檢測方法Continue table 2 The analytical methods for the determination of BAs

2 影響BAs形成的因素

2.1 發酵菌種

豆制品在發酵過程中BAs的累積主要與微生物的生長有關，具有產脫羧酶能力的微生物可以促進BAs的積累[42]。Gardini等[29]從腐乳中分離出59株產胺菌株，其中接種熱帶芽孢桿菌（Bacillus tropicus）主要產生組胺、色胺和尸胺，接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）進行發酵產生酪胺和色胺。Kung等[43]測定了40種市售味增樣品中組胺含量并篩選了產組胺微生物。研究發現，所有BAs含量小于21.6 mg/kg，并分離出一株巴氏桿菌（Bacillus pasteuri）、一株枯草芽孢桿菌（Bacillus sp）、兩株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、兩株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、兩株大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）為產胺菌株。Tsai等[44]測定了26種市售豆豉樣品中的BAs并分析了產組胺菌株，結果表明，豆豉中大多數樣品的組胺含量大于50 mg/kg，超出FDA的標準限量值，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）為組胺產生菌。朱天傲[45]測定了市售蠶豆豆醬中的BAs，并從豆醬中分離出64株潛在BAs產生菌株，其中6株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能夠生成組胺，最高含量達到16.23 mg/L。因此接種具有較高產胺能力的菌株可能會產生較多的BAs，為發酵豆制品中BAs的積累創造了條件。不同種類發酵豆制品中產胺微生物見表3。

表3 不同種類發酵豆制品中產胺微生物Table 3 The different types of amine-producing microorganisms in fermented soybean products

2.2 pH值

pH值是影響發酵豆制品中BAs的重要因素，pH值可以通過影響微生物的生長，抑制酶的活性來影響BAs的產生[46]。在一定范圍內，pH值是影響微生物生長、降低氨基酸脫羧酶活性的重要因素，調節底物pH值是控制食品中BAs生物合成的重要途徑。在發酵過程中蛋白質降解使pH值降低，堿性氨基酸為抵抗酸性環境，在微生物產生的脫羧酶作用下脫羧轉化成BAs[47]。Yang等[48]研究了從酸魚中篩選出27株高產胺菌株的基因多樣性和pH值對菌株的影響，結果表明，在pH值為6.0時，腐胺產量最低，組胺產量最高，在pH值為4.5時，2種單一底物的腐胺總量高于混合底物的腐胺總量。pH值可以通過影響微生物的生長和氨基酸脫羧酶的活性來影響形成的BAs的類型和能力。因此，在酸性環境中會產生較少的BAs。

2.3 溫度

溫度是影響BAs積累的關鍵因素，溫度對腐乳中BAs含量有明顯影響[49]。溫度主要是通過影響微生物生長代謝和酶的活性來影響BAs的積累。在低溫下，發酵和貯藏降低了組胺、酪胺、腐胺、尸胺等的積累，這種減少可能是由于低溫使脫羧酶活性降低，但它們的含量隨著溫度的升高而增加[50]。Li等[51]的研究發現，在4、25、37℃中儲存腐乳，BAs含量為29.17 mg/kg～49.32 mg/kg、47.10 mg/kg～49.32 mg/kg、49.32 mg/kg～52.68 mg/kg，隨著溫度升高呈現上升的趨勢，可能是由于高溫將腐乳中的氨基酸分解成BAs。Sun等[52]研究不同發酵劑對發酵羊肉香腸在4℃和20℃保存中的BAs含量影響，發現發酵香腸中主要BAs為酪胺，貯藏期間濃度為8.02 mg/kg～229.88 mg/kg，酪胺含量在4℃貯藏中呈下降趨勢，保存溫度為20℃時隨著貯藏時間的延長含量不斷增加，20℃貯藏高于4℃貯藏時BAs含量，當溫度較高時，酪氨酸在發酵香腸中的積累較多。

2.4 混合調味料

在后發酵時加入的混合調味料也對發酵豆制品中BAs含量有一定影響?；旌险{味料可以通過抑制產胺微生物的生長和降低氨基酸脫羧酶的活性來減少BAs的積累。Lee等[53]研究在發酵豆醬的不同生產工藝和貯藏階段添加兒茶素和葡萄柚籽提取物對BAs的影響，結果表明，在發酵前添加3 g/kg兒茶素，BAs含量減少了29%，并且在貯藏前添加300 mg/kg葡萄柚籽提取物，豆醬在貯藏40 d后BAs總量下降大約5%，可能是因為添加劑抑制了氨基酸脫羧酶的活性。Qiu等[54]的研究發現，在腐乳后酵過程中添加乙醇的試驗組BAs含量極顯著低于未添加乙醇的對照組，乙醇對蛋白質水解和微生物活性的抑制作用是減少BAs產生的原因。Li等[55]研究了在腐乳后發酵時加入含有不同調味料對BAs的影響，結果表明，在后酵時加入2%的生姜粉對腐乳中組胺、酪胺和總BAs具有較好的抑制效果。Mah等[56]測定了生姜、大蒜等香料對韓國發酵鳀魚中BAs的影響，結果表明，大蒜提取物對BAs產生的抑制作用較強，腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺的含量分別降低了11.2%、18.4%、11.7%、30.9%和17.4%。Li等[57]研究了不同鹽濃度對醬油釀造過程中的BAs含量的影響，結果表明，在添加16%、19%和22%NaCl的醬油中，隨著NaCl濃度的增加，醬油中腐胺、組胺和尸胺的含量明顯降低，表明NaCl會通過影響發酵時的高滲透壓抑制產胺微生物的生長繁殖，破壞細菌細胞膜上的氨基酸脫羧酶。Chin等[58]在味增發酵過程中添加了5%和10%鹽，發現含有較低鹽的味增中BAs含量明顯高于高鹽味增。因此，加入不同的混合調味料可以影響產胺微生物的生長，從而減少BAs的積累，在進行豆制品發酵時要選擇合適的混合調味料。混合調味料添加對BAs形成影響見表4。

表4 混合調味料添加對BAs形成影響Table 4 The effect of mixture on BAs formation

3 BAs的控制

根據影響BAs產生的因素可以從以下3個方面來減少食品中的BAs含量：1）控制產胺微生物，選擇合適的發酵劑；2）控制氨基酸脫羧酶的活性，優化發酵條件和添加適當的食品添加劑；3）降解BAs，在發酵時接種降胺微生物。

3.1 選用不產胺的發酵菌株

選擇不產氨基酸脫羧酶的發酵劑來進行發酵，可以從源頭上控制BAs的含量。Tan等[59]研究了6種不同發酵劑快速發酵豆豉，結果表明，在最終的豆豉產品中只含有腐胺和亞精胺，且總BAs含量為22.47 mg/kg～40.95mg/kg，其中雅致放射毛霉產生BAs較少。Lan等[60]研究了單一菌株和復合菌株對納豆中BAs的影響，結果發現毛霉發酵降低了除組胺外的BAs含量，3株菌株發酵的納豆中腐胺和組胺含量有所增加，但其他BAs含量降低，特別是亞精胺和精胺，因此納豆中總BAs含量降低。Yang等[61]研究3種純種發酵劑雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）、五通橋毛霉（Mucor wutunkiao）和總狀毛霉（Mucor racemosus）發酵腐乳中BAs的變化，結果表明，不同的發酵菌株和發酵工藝對腐乳中BAs含量有不同的影響，總狀毛霉發酵腐乳產生的尸胺、亞精胺、精胺、組胺和酪胺水平顯著低于其他毛霉菌株混合發酵產生的BAs。Fong等[62]采用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota）和大腸埃希菌（Escherichia coli Nissle 1917）對黑豆進行發酵，結果顯示，在豆豉樣品中均未檢測到酪胺，發現發酵過程中使用的菌株是決定發酵食品中BAs含量的關鍵因素，培養期間的溫度和氧氣的存在對BAs的生成是至關重要的。Sun等[63]研究發現用木糖乳桿菌（Staphylococcus xylosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）混合接種干香腸，尸胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺、組胺和酪胺6種BAs的積累減少，其中2種菌的混合發酵BAs產生最少，且BAs濃度與腸桿菌數具有良好的相關關系，部分BAs與乳酸菌數呈負相關。因此，篩選出不產胺微生物，將發酵菌株進行優化后進行接種發酵，能夠抑制BAs的產生，可以從源頭上對BAs的含量進行控制。

3.2 抑制氨基酸脫羧酶活性

氨基酸脫羧酶是微生物產生BAs的必要條件之一，影響氨基酸脫羧酶活性的因素包括pH值、溫度、鹽的濃度等。pH值是影響氨基酸脫羧酶活性的重要因素，pH值較低時，氨基酸脫羧酶的活性也會受到抑制，氨基酸脫羧酶的最適pH值為4.0～5.5[38]。Kim等[64]研究貯藏溫度和時間對韓國米酒中BAs的影響，結果表明，在4℃條件下貯藏30 d僅檢測出少量腐胺，而20℃貯藏3、5、7 d均發現酪胺、組胺、苯乙胺、腐胺、尸胺的產生。Kim等[65]研究發現微生物在高鹽濃度下會產生較少的BAs，這是由于豆醬在高鹽環境下具有更高的滲透壓，微生物的生長受到抑制。因此，可通過優化發酵條件，降低氨基酸脫羧酶活性，減少BAs的產生。

3.3 接種降解BAs發酵菌株

Zaman等[66]從魚醬中分離出具有胺氧化酶活性的肉葡萄球菌 FS19（Staphylococcus carnosus FS19）和解淀粉芽孢桿菌 FS05（Bacillus amyloliquefaciens FS05），并將其分別作為發酵劑進行魚醬的發酵，結果表明，產品中組胺濃度分別降低了27.70%和15.40%。Kim等[67]在進行韓國清谷醬發酵時選擇了4株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），結果表明，利用地衣芽孢桿菌發酵的試驗組中7種BAs的含量顯著降低，并且產胺菌株蠟樣芽孢桿菌的生長也受到抑制。程淑敏等[68]將2株在培養基中具有較高BAs降解能力的菌株Wickerhamomyces anomalus和Miller-ozyma farinosa作為發酵劑進行醬油發酵，結果表明，2株菌對BAs生成均具有一定的抑制效果，Wickerhamomyces anomalus在組胺、酪胺和亞精胺的降解方面優于Millerozyma farinosa。馬宇霞等[69]從44種熏馬腸中分離篩選出6株具有BAs氧化酶活性的菌株，分別為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），并將它作為發酵劑加入熏馬腸中驗證降胺能力，結果表明，這些菌株明顯降低了組胺、酪胺、腐胺和尸胺的含量，可將6株菌株用于肉制品的發酵中。篩選具有降解BAs作用的微生物，并將其應用于發酵體系，是控制食品中BAs的合成和累積、減少食品中BAs含量的有效方法，對提高發酵豆制品品質和安全性具有重要意義。不同微生物對BAs降解作用見表5。

表5 不同微生物對BAs降解作用Table 5 The degradation of biogenic amines by different microorganisms

4 展望

發酵豆制品在我國有近兩千年的歷史，豆制品的發酵過程是在多種條件如發酵菌種、微生物菌群結構、發酵條件、原料和環境等共同作用下進行的，微生物代謝產生BAs，可能帶來食品質量安全隱患。目前發酵豆制品中BAs還沒有限量標準，需要根據人均發酵豆制品日攝入量和各國常用的不同類型發酵食品中BAs含量的信息，制定發酵豆制品中BAs的限量標準。一些研究對BAs的控制主要集中在改變發酵菌株，如使用一些不產胺或能降解BAs的菌株和優化發酵條件等方面，對不同發酵豆制品中BAs的形成原因、微生物菌群和BAs含量之間關聯機制、發酵過程中BAs變化規律還需要進一步研究。在今后的研究中，需要考慮發酵時間、pH值和溫度等環境因素的影響，并將發酵豆制品的生產過程進行標準化，達到抑制發酵豆制品中BAs產生的作用，提高發酵豆制品的食用安全性，推動發酵豆制品行業高質量健康發展。