我國不同利用方式土壤四環素類抗性基因積累的研究

龔小雅，宋建宇，吳鳳芝

（東北農業大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

農田土壤中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）外源輸入的主要方式是污水與再生水的灌溉[1]以及畜禽糞便作為有機肥的施用[2]。目前污水處理系統可去除氨氮和總磷等物質，但無法有效去除高濃度的ARGs，從而使得農田灌溉再生水中ARGs 濃度較高[3]。此外，應用于畜牧養殖業的抗生素有90%不能被動物腸道吸收，其會以原形或者代謝物的形式隨動物糞便排出體外[4]，因此，畜禽糞便中積蓄著大量ARGs，隨著有機肥替代化肥農業技術的推行[5]，畜禽糞便以有機堆肥的形式廣泛施用于農田。ARGs從再生水和有機堆肥這兩種“源”通過灌溉和施用的方式輸入到農田土壤的“庫”[6-7]，導致大量ARGs 在農田土壤積累[8]，這些ARGs 通過受污染作物和地下水系統重新進入食物鏈，對人體健康造成危害[9-10]。因此，探討土壤中抗生素抗性基因絕對豐度的變化，以此揭示抗性基因在土壤中的積累情況具有重要意義。

影響ARGs 積累的因素包括氣候、土壤空間屬性、有機肥來源和用量[11]。長三角紅壤農田土壤中總ARGs相對豐度范圍為2.26×10-4～1.16×10-1[12]，東北黑土地區農田土壤中總ARGs 絕對豐度范圍是2.59×107～1.14×108copies·g-1[13]。還有研究發現，施用畜禽糞便的農業土壤中ARGs 的水平顯著提高[14-15]，其中，設施菜田土壤ARGs 的種類和豐度高于農田土壤[16]，施加有機肥的農田土壤ARGs 數量和豐度顯著高于施加化肥的農田土壤，并在施肥10 a 后ARGs 數量顯著增加[11]。研究表明，在水稻田施用畜禽糞便幾十年后，土壤中ARGs 的豐度較未施用畜禽糞便的稻田顯著增加[17]，因此，土壤ARGs的積累量隨著年份的增加出現累加效應。

在農田土壤中，幾乎所有類別的ARGs 均顯著增加，尤其是四環素類（Tetracyclines）抗生素抗性基因增加最多[18]。四環素類抗生素抗性基因是一種新型的環境污染物[19-20]，在銀川、重慶和沈陽的設施菜地和露地中均有檢出，且設施菜地的四環素類抗生素抗性基因含量顯著高于露地[21-22]。四環素類抗性基因已經廣泛存在于農田土壤中[23]，但對于四環素類抗生素抗性基因的探究多集中于狹窄范圍的農田土壤中的積累和遷移，其結果依賴于特定的實驗地點和條件，其結果雖有同一性，但因土壤利用方式和利用年限的差異，各地土壤無法進行比較，對全國各地四環素類抗生素抗性基因積累情況的判定也仍有較大偏差，對廣泛地理范圍下不同農業土地利用方式和不同年限土壤抗生素積累的研究遠遠不夠。因此，本研究利用普通PCR 和qPCR 熒光定量技術，對不同地區、不同利用年限下的設施、露地菜田和糧田土壤中抗性基因絕對豐度進行研究，明確不同利用方式以及不同年限的土壤中抗性基因積累特征，為農業安全生產提供參考。

1 材料與方法

試驗土壤樣品中抗生素抗性基因的檢測在東北農業大學園藝園林學院農業農村部東北地區園藝作物生物學與種質創新重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

試驗土壤于2017 年7—8 月取自我國黑龍江（HLJ）、吉林（JL）、遼寧（LN）、內蒙古（NMG）、新疆（XJ）、甘肅（GS）、云南（YN）、江蘇（JS）、湖北（HB）、廣東（GD）、海南（HN）、山西（SX）、河南（HEN）、山東（SD）共計14 個省份具有代表性的不同種植年限（1～3、7～10 a 和15 a 以上）和不同土地利用方式（設施菜田、露地菜田和露地糧田）的土壤，取土深度為去除表面土壤后的5～20 cm。每個省份選取設施菜田（S）、露地菜田（L）和露地糧田（D）3種不同土地利用方式和3個種植年限的9種土壤作為研究對象，即9個處理。根據具體取樣地點的氣候環境以及我國土地資源的劃分情況將14 個取樣地區又劃分為5 個地區[24-25]，即黑龍江、吉林、遼寧和內蒙古劃分為北部地區，甘肅和新疆劃分為西部地區，江蘇和湖北劃分為長江地區，山西、河南和山東劃分為中部地區，海南和云南劃分為南部地區。

1.2 樣品采集與處理

選取14 個地區不同種植年限的典型溫室蔬菜田（1～3、7～10 a、＞15 a）、鄰近溫室的露地菜田以及糧田，在每種利用方式處采用5 點取樣法采集深度為5～20 cm 的耕層土壤，土樣過2 mm 篩，去除樣品中的殘根、植株殘體和石塊等雜質，每5 點混合為一個土樣，作為一次重復，重復3 次，共計378 個（14 個地區×3 種土壤利用方式×3 種使用年限×3 次重復）土壤樣品。將土樣放入無菌自封袋中，帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存，用于提取土壤DNA。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤總DNA的提取

取0.25 g 土壤樣品，用Power Soil?DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，美國）按說明提取DNA。每個土壤樣品平行提取3 次，提取的溶液混合后待用。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取土壤中的DNA。使用NanoDropND-1000 UV-Vis 分光光度計（Thermo Scientific，Rockwood，TN，美國）檢測提取物的DNA濃度和質量（A260/A280）。

1.3.2 普通PCR定性和qPCR定量分析

本研究選擇了4種四環素類抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）進行定性PCR 檢測。在IQ5 實時PCR 系統（Bio-Rad Lab，LA，美國）中測定4 種四環素類抗性基因的豐度。所用引物設計主要來源于已發表的文獻[26-29]，引物序列及目標基因片段大小如表1 所示。引物由邁浦生物科技公司（Map Bio，上海）設計。

表1 四環素類抗性基因引物序列Table 1 Primers of tet resistance genes

普通PCR 定性檢測的反應體系為25 μL，包括12.5 μL Taq PCR Master Mix，10.5 μL 無菌去離子水，0.5 μL 上游引物（10 μmol·L-1），0.5 μL 下游引物（10 μmol·L-1）和1 μL 模板DNA。普通PCR 反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火延伸30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

qPCR 定量檢測的反應體系為10 μL，主要包括5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix，3.0 μL 無菌去離子水，0.5 μL上游引物（10 μmol·L-1），0.5 μL下游引物（10 μmol·L-1）和1 μL 模板DNA。qPCR 反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，T℃退火30 s（表2），72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸7 min。溶解曲線在65 ℃至95 ℃之間，每5 s增加0.5 ℃，期間停留30 s。

表2 qPCR 的退火溫度Table 2 qPCR annealing temperature

1.4 數據分析

采用Excel 2010 進行數據處理，采用SPSS（Version 19.0）對試驗的原始數據進行差異顯著性分析，使用Graphpad Prism 7繪圖。不同省份同一利用方式和同一年限土壤中四環素類抗性基因絕對豐度的差異分析，以14 個省份作為方差的分析因素，通過單因素方差實現。箱線圖分析采用R 軟件ggplot2 包，線性回歸分析采用R軟件ggplot2和ggsci包[30]。

2 結果與分析

2.1 不同土壤中抗性基因的定性檢測

在14 個省份的1～3（以3 a 表示）、7～10 a（以7 a表示）和15 a 以上（以15 a 表示）的設施菜田土壤、露地菜田土壤和露地糧田土壤中四環素類抗性基因的檢出率均為100%（表3）。

表3 不同地區土壤中四環素類抗性基因的檢出情況Table 3 Detection of tet in soil from different areas

2.2 同一利用方式下不同年限土壤四環素類抗性基因差異分析

2.2.1tetM絕對豐度差異分析

糧田土壤中的絕對豐度范圍為1.60×104～1.95×106copies·g-1，3、7 a 和15 a 露地糧田土壤中tetM絕對豐度均在黑龍江地區最高，在河南地區最低（圖1a）。露地菜田土壤中的豐度范圍是9.98×104～5.97×106copies·g-1，3、7 a 和15 a 露地菜田土壤中豐度均在黑龍江地區最高，均在湖北地區最低（圖1b）。設施菜田土壤中的豐度范圍是3.45×105～1.04×107copies·g-1，3、7 a 和15 a 設施菜田土壤中豐度均在黑龍江地區最高，3 a設施菜田土壤中為海南地區最低，7 a為河南地區最低，15 a為湖北地區最低（圖1c）。tetM的絕對豐度在黑龍江地區的15 a設施菜田土壤中最高，在河南地區的15 a糧田土壤中最低。

圖1 不同地區同一利用方式土壤中tetM絕對豐度的差異Figure 1 Difference of absolute abundance of tetM in soils with the same utilization pattern in different area

2.2.2tetO絕對豐度差異分析

糧田土壤中絕對豐度范圍是1.11×105～2.18×106copies·g-1，在3、7 a和15 a糧田土壤中tetO的絕對豐度均在江蘇地區最高，均在遼寧地區最低（圖2a）。露地菜田土壤中豐度范圍為3.79×105～2.48×107copies·g-1，3、7 a和15 a露地菜田土壤中豐度均在黑龍江地區最高，均在甘肅地區最低（圖2b）。設施菜田土壤中豐度范圍為1.76×106～6.36×107copies·g-1，3、7 a 和15 a設施菜田土壤中豐度均在黑龍江地區最高，均在甘肅地區最低（圖2c）。tetO的絕對豐度在黑龍江地區的15 a 設施菜田土壤中最高，在遼寧地區的7 a 糧田土壤中最低。

圖2 不同地區同一利用方式土壤中tetO絕對豐度的差異Figure 2 Difference of absolute abundance of tetO in soils with the same utilization pattern in different area

2.2.3tetQ絕對豐度差異分析

在糧田土壤中tetQ的絕對豐度范圍為5.25×103～2.40×105copies·g-1，3、7 a 和15 a糧田土壤中絕對豐度最高地區均為黑龍江地區，最低均為湖北地區（圖3a）。露地菜田土壤中豐度范圍為1.16×104～6.64×105copies·g-1，3 a 露地菜田土壤中豐度最高地區為黑龍江地區，7 a為廣東地區，15 a為甘肅地區，3、7 a和15 a露地菜田土壤中豐度最低地區均為湖北地區（圖3b）。設施菜田土壤中豐度范圍為3.96×104～3.71×106copies·g-1，黑龍江地區的3 a 和7 a 設施菜田土壤tetQ的豐度均最高，15 a 為甘肅地區，3、7 a 和15 a 設施菜田土壤中湖北地區的豐度顯著低于其他地區（圖3c）。tetQ的絕對豐度在甘肅地區的15 a設施菜田土壤中最高，在湖北地區的15 a糧田土壤中最低。

圖3 不同地區同一利用方式土壤中tetQ絕對豐度的差異Figure 3 Difference of absolute abundance of tetQ in soils with the same utilization pattern in different area

2.2.4tetW絕對豐度差異分析

在糧田土壤中tetW的絕對豐度范圍為2.16×103～1.64×105copies·g-1，3 a糧田土壤中絕對豐度最高地區為云南地區，7 a和15 a為海南地區，3、7 a和15 a糧田土壤中絕對豐度最低地區均為新疆地區（圖4a）。露地菜田土壤豐度范圍為1.32×104～8.00×105copies·g-1，3 a和7 a露地菜田土壤中豐度最高地區為廣東地區，15 a為黑龍江地區，3、7 a和15 a露地菜田土壤中豐度最低地區均為新疆地區（圖4b）。設施菜田土壤中豐度范圍為6.07×104～2.74×106copies·g-1，3 a 和7 a 設施菜田土壤豐度最高均為黑龍江地區，15 a為吉林地區，3 a設施菜田土壤豐度最低地區為江蘇地區，7 a和15 a為新疆地區（圖4c）。tetW的絕對豐度在吉林地區的15 a設施菜田土壤中最高，在新疆地區的3 a糧田土壤中最低。

綜上，四環素類抗性基因的絕對豐度范圍是2.16×103～6.36×107copies·g-1，tetM和tetQ中都有9個地區是15 a以上設施菜田的豐度最高。tetO和tetW中都有10個地區是15 a以上設施菜田的豐度最高，豐度最低的均在糧田土壤中，四環素類抗生素抗性基因豐度在15 a以上設施菜田最高的比例為67.9%（圖1～圖4）。

圖4 不同地區同一利用方式土壤中tetW絕對豐度的差異Figure 4 Difference of absolute abundance of tetW in soils with the same utilization pattern in different area

2.3 同一地區與同一利用年限下不同利用方式四環素類抗生素抗性基因差異分析

2.3.1tetM差異分析

北部地區設施菜田土壤的tetM絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，且露地菜田顯著高于露地糧田土壤（圖5a）。長江、南部、西部和中部地區設施菜田土壤的tetM絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地糧田土壤間無顯著差異（圖5b～圖5e）。

圖5 北部、西部、長江、中部和南部地區不同利用方式土壤中tetM的差異Figure 5 Differences of tetM in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.3.2tetO差異分析

北部、南部和中部地區設施菜田土壤的tetO絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，且露地菜田顯著高于露地糧田土壤（圖6a、圖6c 和圖6e）。長江和西部地區設施菜田土壤的tetO絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地糧田土壤間無顯著差異（圖6b和圖6d）。

圖6 北部、西部、長江、中部和南部地區不同利用方式土壤中tetO的差異Figure 6 Differences of tetO in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.3.3tetQ差異分析

北部和南部地區設施菜田土壤的tetQ絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，且露地菜田顯著高于露地糧田土壤（圖7a 和圖7c）。長江、西部和中部地區設施菜田土壤的tetQ絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地糧田土壤間無顯著差異（圖7b、圖7d和圖7e）。

圖7 北部、西部、長江、中部和南部地區不同利用方式土壤中tetQ的差異Figure 7 Differences of tetQ in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.3.4tetW差異分析

北部、南部和中部地區設施菜田土壤的tetW絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，且露地菜田顯著高于露地糧田土壤（圖8a、圖8c 和圖8e）。長江和西部地區設施菜田土壤的tetW絕對豐度顯著高于露地糧田和露地菜田土壤，而露地菜田和露地糧田土壤間無顯著差異（圖8b和圖8d）。

圖8 北部、西部、長江、中部和南部地區不同利用方式土壤中tetW的差異Figure 8 Differences of tetW in soils with different utilization patterns in the north，west，Yangtze River，central and southern region

2.4 不同利用方式下土壤四環素類抗性基因與利用年限的線性分析

設施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW基因與土壤利用年限呈顯著線性正相關關系（圖9），而露地糧田和露地菜田土壤的4 個四環素類抗性基因與土壤利用年限無顯著線性相關。

圖9 四環素類抗性相關基因與利用年限的線性回歸Figure 9 Linear regression between tetracycline resistance genes and soil planting life

3 討論

施用有機肥能夠增加土壤中抗生素抗性基因的豐度，并帶入土壤中本沒有的抗生素抗性基因[18，31-32]。本研究選取了在土壤環境中經常被檢出的4 種四環素類抗生素抗性基因（tetM、tetO、tetQ和tetW）作為本試驗的目標基因，對其存在情況進行PCR 檢測，從來自14 個省份的土壤中均檢出了上述基因，這一結果與前人研究基本一致[33]。這可能是由于攜帶不同抗生素抗性基因的移動遺傳元件廣泛存在，且參與抗生素抗性基因的擴散[34]，tet基因的宿主范圍廣，更容易在土壤中傳播[35]。這也意味著四環素類抗性基因已經廣泛分布于不同類型的農用土壤中，具備潛在土壤和環境污染風險。抗生素的肆意濫用使抗性基因通過多種途徑傳播進入到環境中，并通過食物鏈循環等因素進入人體，從而產生危害[36-37]。

由于我國不同省份的蔬菜播種面積明顯不同[33，38]，施肥量的差異[39]和土壤特性的區域差異[40]都會導致不同地區抗生素抗性基因有很大差異[36]。在本試驗中，14個地區3種不同利用方式下土壤中四環素類抗生素抗性基因存在顯著差異，但是均表現為設施菜田土壤中各抗性基因的絕對豐度顯著高于相同年限下糧田和露地菜田土壤。糧田和露地菜田土壤中大量施用化肥，而設施菜田多施用有機肥[41]，這可能導致其土壤中抗生素的污染程度加劇，大量的抗生素抗性基因積累[6-7]。北部、西部、長江、中部和南部地區設施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ、tetW均高于露地菜田和露地糧田土壤。一方面，設施菜田與露地菜田和糧田相比，具有很好的種植優勢，設施菜田每年可以種植多茬作物，因此施用有機肥的次數增多，從而導致設施菜田土壤中抗生素抗性基因的絕對定量值高于露地菜田和糧田土壤[36]；另一方面，相對于露地菜田和糧田，設施菜田屬于相對封閉的環境，不受外界因素的影響，從而有利于抗性的積累，這也可能是設施菜田土壤中四環素類抗性基因的絕對豐度高于露地菜田和糧田土壤的原因[42]。從本試驗結果來看，各地區土壤中四環素類抗生素抗性基因的絕對豐度存在顯著差異。栽培方式也是影響抗性基因污染程度的因素之一[40]。抗生素抗性基因獨特的空間分布格局可能受土壤共存污染物、土壤特性和天氣條件的區域性差異的影響[42]。因此我國不同地區ARGs的污染水平不同主要是由于人類活動、土壤類型和天氣條件所造成的[43]。

本試驗的研究結果表明，四環素類抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）的絕對豐度在設施菜田3 a 的土壤中顯著低于設施菜田7 a和15 a的土壤，可見，其抗性基因會隨土壤利用年限的增加而在土壤環境中積累，這與前人的研究結果一致[44]。長期的糞便施用會使土壤中養分含量顯著提升，從而提高土壤中微生物的數量[45]。本課題組利用本試驗土壤測定土壤養分，發現設施菜田3 a的土壤中的養分含量顯著低于設施菜田7 a 和15 a 的土壤[46]。隨著宿主細菌多樣性的增加和細菌間遺傳物質的交換，無論是來自共生菌群間還是來自于外界環境的潛在抗生素抗性基因，均能夠增加土壤微生物區系對抗生素的抵抗能力，隨之使抗生素抗性基因豐度顯著提升[47]。因此，造成本試驗結果的原因可能是設施菜田3、7 a和15 a土壤中微生物的數量不同，導致微生物區系對抗生素的抵抗能力不同，使得抗生素抗性基因的豐度存在差異。

將14個省份分為5個地區，發現北部和南部地區的設施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW的絕對豐度顯著高于露地菜田和露地糧田土壤，同時露地菜田顯著高于露地糧田土壤，西部、長江和中部地區設施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ的絕對豐度顯著高于露地菜田和露地糧田土壤，但露地菜田和露地糧田土壤間無顯著差異。土壤的空間屬性成為最可能影響抗生素抗性基因積累的因素[11]。對相同土壤進行微生物區系分析，發現土壤pH 的降低導致細菌群落的隨機聚集[48]，促使土壤環境中抗生素抗性基因的積累和傳播，土壤酸度對土壤中抗生素的吸附和解吸行為具有重要作用[49]，因此，不同地區的土壤性質也會影響抗性基因豐度。

此外，對不同利用方式下土壤中4 個四環素類抗性基因與土壤農作年限進行線性分析，發現設施菜田土壤中tetO、tetQ、tetW基因的絕對豐度隨土壤利用年限的增加而積累，但露地菜田和糧田土壤的抗生素不存在這種線性關系。這一方面反映了土地利用方式影響四環素類抗性基因的積累，露地菜田和糧田土壤抗性基因獨特的空間分布格局可能受土壤共存污染物、土壤特性和天氣條件的區域性差異的影響[42]，因此，受年限的影響不顯著。另一方面，由于設施菜田受到更少的外界因素影響，四環素類抗性基因表現為逐年積累的趨勢，在設施菜田內更容易探究抗生素積累污染情況與年限的關系。

4 結論

（1）糧田、露地菜田和設施菜田土壤中四環素類抗性基因（tetM、tetO、tetQ和tetW）的檢出頻率均為100%。

（2）tetM、tetO、tetQ和tetW在設施菜田土壤中的絕對豐度均顯著高于糧田和露地菜田土壤。各地區3、7 a和15 a的設施菜田土壤均顯著高于相同年限下的糧田和露地菜田土壤，且設施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW基因與年限存在顯著正相關關系。

（3）設施菜田抗生素抗性基因總體上隨年限增加呈累積趨勢，不同年限的露地菜田間以及糧田土壤間均無顯著差異。

（4）北部、西部、長江、中部和南部地區設施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ、tetW的絕對豐度顯著高于露地菜田和露地糧田土壤，北部和南部地區的設施菜田土壤的tetO、tetQ、tetW的絕對豐度顯著高于露地菜田和露地糧田土壤，同時露地菜田顯著高于露地糧田土壤，西部、長江和中部地區設施菜田土壤的tetM、tetO、tetQ的絕對豐度顯著高于露地菜田和露地糧田土壤，但露地菜田和露地糧田土壤間無顯著差異。