常壓室溫等離子體誘變與微生物微液滴培養選育谷胱甘肽高產菌株

凌思雨，王 洲，張會敏，李 闖，劉慶濤，劉 艷，薛正蓮

（安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽省工業微生物分子育種工程實驗室，微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽 蕪湖 241000）

谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的非蛋白類三肽化合物[1]，廣泛存在于大多數真核生物和某些原核生物中[2]。在生物體內具有還原型和氧化型兩種形式[3]，其中還原型谷胱甘肽占大多數，約為90%[4-5]。由于其具有抗氧化性[6]、清除自由基[7]、解毒[8]、美白[9]等功能，谷胱甘肽被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等行業[3,10]。因此，近年來國內外對谷胱甘肽的需求呈現出一種上升趨勢[11]。目前，酵母發酵法生產谷胱甘肽是工業生產上的主流，常用的生產菌種主要包括釀酒酵母[12-13]、產朊假絲酵母[14]和畢赤酵母[15]。

由于傳統的菌種選育方法過程繁瑣、效率低下[16]，由清華大學與天木生物科技有限公司合作研發的常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術可有效解決上述問題。ARTP誘變具有高突變率、操作簡單、誘變速度快且對環境無污染等優點[17-18]，是一種新型誘變技術，已被廣泛應用到各類微生物菌種篩選過程中[19]。同時，基于液滴微流控技術研發而成的一款全自動高通量微生物微液滴培養（microbial microdroplet culture system，MMC）系統具有高通量、微量化及自動培養和傳代等功能[20-21]，為菌種誘變之后的復雜篩選工作提供了一種高效方法[22-23]。目前，將ARTP與MMC聯合應用于菌種選育的相關研究還鮮見報道，因此具有一定的研究前景和理論價值。

為了獲得高產谷胱甘肽的畢赤酵母菌株，以實驗室保藏的1 株畢赤酵母BY-1作為出發菌株，首先通過ARTP誘變技術并結合梯度濃度1,2,4-三氮唑平板篩選方法，驗證在高質量濃度1,2,4-三氮唑抗性平板上生長菌株的谷胱甘肽產量，明顯高于低濃度1,2,4-三氮唑平板上生長的菌株。然后進一步以1,2,4-三氮唑作為篩選因子，利用MMC對經過誘變的菌株進行適應性進化，提高出發菌株對1,2,4-三氮唑耐受性的同時篩選出高產谷胱甘肽的畢赤酵母菌株。本實驗旨在將ARTP誘變技術與MMC適應性進化聯合應用于高產谷胱甘肽畢赤酵母菌株的選育，相比傳統的物理誘變、化學誘變和生物合成學手段相比，提供一種簡便高效的育種方式，具有廣泛的市場應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株，本實驗室命名為BY-1。

1.1.2 培養基

菌種培養用液體和固體培養基為酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L；固體培養基中額外添加20 g/L瓊脂粉。誘變菌株進行搖瓶培養所用液體培養基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，硫酸銨5 g/L，無水磷酸二氫鉀5 g/L，七水硫酸鎂5 g/L，氯化鈉0.1 g/L，氯化鈣0.1 g/L。培養基需115 ℃滅菌30 min后使用。

1.1.3 試劑

1,2,4-三氮唑、Tris-HCl緩沖液、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DTNB） 生工生物工程（上海）股份有限公司；40%乙醇溶液 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ARTP-IIS ARTP誘變育種儀 無錫源清天木生物科技有限公司；MMC-B2 MMC培養儀 洛陽華清天木生物科技有限公司；1510酶標儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；D3024高速微量離心機 大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；ZQZY-78BN恒溫培養搖床 上海知楚儀器有限公司；Mixer 4K微型旋渦混合儀 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 畢赤酵母ARTP誘變

1.3.1.1 BY-1菌株生長曲線制作及對數生長期的確定

將活化好的畢赤酵母菌（BY-1）轉移至裝液量為30 mL的250 mL搖瓶中，置于恒溫培養搖床中30 ℃、220 r/min過夜培養。將BY-1菌懸液濃度稀釋到OD600nm約1.0，轉入MMC專用進樣瓶，在MMC系統中創建液滴培養單元，并使用MMC系統自帶的光密度檢測裝置檢測液滴中BY-1菌株生長過程中OD600nm值的變化，用于制作生長曲線，以確定BY-1進入對數生長期的時間。

1.3.1.2 ARTP誘變致死率曲線的制作及最佳ARTP誘變處理時間的確定

取對數生長期的BY-1菌液，稀釋菌液濃度到OD600nm約為0.6～0.8。取10 μL稀釋好的菌液，將其均勻涂布在ARTP專用載片上，置于ARTP誘變育種儀中對BY-1菌株進行誘變處理[24]。ARTP誘變育種儀配備純度超過99.99%的氦氣；設置處理參數：入射功率120 W，氣體流量10 L/min，照射距離2 mm。設置不同誘變處理時間：40、80、120、160、200 s和240 s，并計算不同處理時間的菌株致死率，以繪制ARTP誘變致死率曲線。菌株致死率的計算方法為：將處理結束的載片裝入含有990 μL無菌生理鹽水中，經微型旋渦混合儀充分振蕩，以未經誘變處理過的菌液作為對照，稀釋成不同梯度后均勻涂布于YPD固體培養基。而后置于30 ℃培養箱中培養3～5 d，并計算致死率。根據ARTP誘變致死率曲線確定最佳誘變處理時間。致死率的計算公式如下：

1.3.1.3 1,2,4-三氮唑梯度濃度平板法篩選突變菌株

將熔化好的YPD固體培養基倒入直徑為9 cm的無菌培養皿中，傾斜一定角度（約15°），使得位于液面高處的培養基處于培養皿邊與皿底之間，待其凝固后，水平放置培養皿，將含有2 g/L 1,2,4-三氮唑的YPD培養基加入其中，制得含有不同質量濃度1,2,4-三氮唑（0～2 g/L）的固體平板。隨后將經過誘變并稀釋好的酵母菌液均勻涂布于梯度平板中，倒置于30 ℃培養箱中靜置培養3～5 d，觀察不同質量濃度梯度下菌體的生長情況，并驗證在高質量濃度抗性下生長的菌落與其谷胱甘肽產量是否正相關。

1.3.1.4 對數生長期初篩菌株在最佳ARTP誘變時間下的ARTP誘變

將經過ARTP誘變及梯度平板篩選獲得的優勢菌株，在最佳誘變時間下再次處理，隨后均勻涂布于YPD固體平板中，挑選單菌落用于后續MMC適應性進化。通過ARTP誘變和MMC篩選后獲得的畢赤酵母菌株，在30 ℃、220 r/min條件下進行搖瓶培養，測定其谷胱甘肽產量和細胞生物量，以優選高產谷胱甘肽的誘變菌株。

1.3.2 DTNB法測定谷胱甘肽產量

取2 mL搖瓶培養液，8000 r/min離心5 min后獲得上清液和細胞沉淀，使用上清液檢測胞外谷胱甘肽產量，使用細胞沉淀檢測胞內谷胱甘肽產量，本實驗谷胱甘肽總產量為胞外和胞內產量之和[25-26]。對于胞內谷胱甘肽的檢測需要額外使用40%乙醇溶液，30 ℃水浴破壁2 h，8000 r/min離心5 min后取上清液進行顯色反應。在pH 8.0的Tri-HCl緩沖液中，谷胱甘肽與DTNB反應可以生成黃色的5-硫代-2硝基苯甲酸，在波長412 nm處有最大吸收峰，利用酶標儀檢測OD412nm，通過標準曲線法檢測谷胱甘肽產量[27]。

1.3.3 細胞生物量的測定

取2 mL搖瓶培養液，8000 r/min離心5 min，棄上清液，而后用蒸餾水洗滌菌體3 次，85 ℃烘干至質量恒定，減去空離心管質量后除以搖瓶培養液體積2 mL即可得到細胞干質量（g/L）。

1.3.4 優選菌株的MMC適應性進化

將經過ARTP誘變且經過搖瓶培養證實生產性能較穩定的菌株BY-1-26，接入到YPD液體培養基中，30 ℃、220 r/min條件下過夜培養，調節OD600nm，使其控制在1.0以下。設置傳代方式（time）及傳代參數（24 h）后，在不同濃度梯度的1,2,4-三氮唑篩選因子條件下進行BY-1-26菌株的MMC適應性進化，實時檢測OD600nm以跟蹤菌株的適應性進化生長情況。隨著培養時間的延長，1,2,4-三氮唑濃度逐漸遞增，達到最高設定濃度時，將生長情況良好的液滴提取出來，通過平板劃線，分離單菌落后，作為下次實驗的出發菌株。

1.3.5 突變菌株遺傳穩定性分析

將最終經過篩選獲得的優勢菌株，經過固體平板劃線連續傳代7 次，于30 ℃、220 r/min條件下檢測每代的生長情況（生物量）及谷胱甘肽產量，驗證其遺傳穩定性。

1.4 數據處理

實驗數據采用Excel 2019進行處理，圖像采用Origin 2018進行繪制。實驗結果以表示。

2 結果與分析

2.1 畢赤酵母菌株的ARTP誘變篩選條件

BY-1畢赤酵母菌株為ARTP誘變的出發菌株，其具有代謝產生谷胱甘肽能力，已知其在搖瓶培養48 h可達到最高谷胱甘肽產量（胞內產量與胞外產量總量）（133.24±0.86）mg/L，對應生物量（15.22±0.21）g/L（圖1a）。圖1b為BY-1菌株在MMC培養中的生長曲線，不同液滴培養單元之間一致性良好，菌株BY-1從3 h起開始進入對數生長期，20 h后進入穩定期。進一步檢測BY-1菌株在不同ARTP誘變處理時間下的致死率，由圖1c可知，隨著處理時間的延長，菌株的死亡率也在逐漸提高。處理時間為120 s時，致死率高達80%；處理時間增加到160 s，致死率為90%；進一步增加處理時間至200 s，致死率達到100%。根據文獻報道[28]，致死率在80%～90%之間，更有利于后續誘變菌株的篩選工作。為此，考慮到誘變菌株的篩選效率，本研究將160 s確定為后續ARTP誘變的最佳處理時間。

圖1 菌株BY-1的谷胱甘肽產量及生物量（a）、生長曲線（b）和ARTP誘變致死率曲線（c）Fig.1 GSH yield and biomass (a),growth curve (b) and ARTP mutagenicity lethality curve (c) of strain BY-1

2.2 突變菌株的篩選結果

畢赤酵母經ARTP誘變后，涂布在含有梯度質量濃度（0～2 g/L）的1,2,4-三氮唑YPD培養基中，培養3 d，如圖2a所示，在相對低質量濃度1,2,4-三氮唑培養基中，誘變菌株生長良好，數量多且菌落形態較大。隨著1,2,4-三氮唑質量濃度增大，畢赤酵母生長情況受到抑制，形態變小且數量減少。平板中高質量濃度與低濃度區域分別選取30 個單菌落，進行搖瓶培養驗證。結果表明，低質量濃度抗性突變株的產量普遍低于高質量濃度抗性突變株，且低濃度區域谷胱甘肽產量的中位數明顯低于高質量濃度區域（圖2b）。在高質量濃度區域發現編號為26的突變株（圖2a），其谷胱甘肽產量最高，達到（203.20±4.18）mg/L，將其命名為BY-1-26。在后續的ARTP誘變中，選擇BY-1-26作為新的出發菌株。

圖2 畢赤酵母誘變菌株梯度平板篩選結果（a）及其谷胱甘肽產量測定結果（b）Fig.2 Results of gradient plate screening (a) and yield of GSH produced by mutant (b)

2.3 搖瓶培養過程中添加1,2,4-三氮唑對畢赤酵母產谷胱甘肽的影響

已知1,2,4-三氮唑的抗性突變株具有較高的谷胱甘肽合成能力[29]。本研究通過ARTP誘變結合1,2,4-三氮唑梯度濃度的平板篩選方法，驗證了其對高產谷胱甘肽的畢赤酵母菌株具有很好的篩選效果。目前尚無在發酵階段添加1,2,4-三氮唑以提升谷胱甘肽產量的報道。因此需要確定好1,2,4-三氮唑在發酵過程中的適宜添加時間和添加濃度，以準確考察1,2,4-三氮唑對畢赤酵母發酵過程中產谷胱甘肽的影響。

2.3.1 搖瓶培養中初步添加1,2,4-三氮唑對谷胱甘肽產量的影響

在搖瓶培養的不同階段添加1,2,4-三氮唑，會直接影響到菌體的生長及谷胱甘肽產量[30]。參考圖2結果，選擇1,2,4-三氮唑在“高質量濃度區域”的中位數質量濃度1.5 g/L初步進行搖瓶培養中的1,2,4-三氮唑添加實驗。為此根據出發菌株的生長曲線（圖1b），在菌株BY-1-26進入搖瓶培養的0、5、10、15、20、25、30 h分別添加1.5 g/L的1,2,4-三氮唑，以確定其生長曲線的不同階段對菌株BY-1-26代謝產生谷胱甘肽的影響。以未加入1,2,4-三氮唑的BY-1-26菌株搖瓶培養實驗為對照，分別分析加入1.5 g/L 1,2,4-三氮唑后搖瓶培養48、60、72 h后其谷胱甘肽產量。

如圖3所示，搖瓶培養48 h后，誘變菌株BY-1-26生物量在48 h達到最高值，同時其谷胱甘肽產量也達到最大值，胞內谷胱甘肽達到（153.85±2.80）mg/L，胞外谷胱甘肽達到（49.34±2.11）mg/L，總量達到（203.20±4.18）mg/L，比出發菌株增產52.51%。表明ARTP誘變可有效提升畢赤酵母菌株BY-1代謝產生谷胱甘肽的能力。

圖3 菌株BY-1-26在不同培養時間下的谷胱甘肽產量（a）和生物量（b）Fig.3 GSH yield (a) and biomass (b) of strain BY-1-26 at different incubation times

進一步加入1,2,4-三氮唑，搖瓶培養48 h 后（圖4a），胞外谷胱甘肽產量增加3.9%～80.9%，達到89.25 mg/L，胞內谷胱甘肽產量降低5.3%～33.9%，達到101.73 mg/L，推測加入1,2,4-三氮唑使BY-1-26菌株細胞壁滲透性增強，使代謝產生的谷胱甘肽更容易從胞內釋放到胞外。不同時間添加1,2,4-三氮唑的樣本相比，谷胱甘肽總量分別在培養5、10、20 h加入1,2,4-三氮唑的樣本中有所增加（2.3%～9.2%），而在培養0、15、25、30 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本中有所減少（3.3%～17.9%），在搖瓶培養10 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本，谷胱甘肽產量增加最多（9.2%，221.83 mg/L），推測可能與對數期菌株細胞壁通透性更容易受1,2,4-三氮唑影響，谷胱甘肽釋放到胞外有利于解除產物抑制促進菌株谷胱甘肽的進一步合成[31]。

搖瓶培養60 h后（圖4b），與培養48 h（圖4a）相比，胞內谷胱甘肽產量略有提高（1.38%，133.06 mg/L），胞外谷胱甘肽平均產量顯著降低為48 h 的94.06%（61.91 mg/L），推測可能與長時間發酵營養物質損耗及菌株代謝能力降低有關。與未加入1,2,4-三氮唑（圖3a）相比，加入1,2,4-三氮唑的樣本，胞內谷胱甘肽產量減少9.4%～26.1%，胞外谷胱甘肽產量變為93.6%～162.7%，總量變為91.1%～104.9%。其中，搖瓶培養10 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本中谷胱甘肽總量最高（210.46 mg/L），其中胞外谷胱甘肽產量提高62.7%（78.49 mg/L），胞內谷胱甘肽產量下降13.4%（131.97 mg/L）。

搖瓶培養72 h后（圖4c），與培養60 h（圖4b）相比，胞內谷胱甘肽產量與胞外谷胱甘肽產量分別顯著降低為60 h的28.52%（37.82 mg/L）和70.43%（42.39 mg/L）。推測長時間發酵使菌株代謝生長所需的營養物質嚴重不足。與未加入1,2,4-三氮唑（圖3a）相比，加入1,2,4-三氮唑的樣本，胞內谷胱甘肽產量減少24.19%～28.41%，胞外谷胱甘肽產量變為80.00%～104.18%，總量變為38.38%～44.60%（73.72～85.65 mg/L）。其中，搖瓶培養20 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本中谷胱甘肽總量最高（85.65 mg/L），胞外谷胱甘肽產量47.83 mg/L，胞內谷胱甘肽產量37.82 mg/L。

圖4 不同時間添加1,2,4-三氮唑對48（a）、60 h（b）和72 h（c）培養液中谷胱甘肽的影響Fig.4 Effects of different addition times of 1,2,4-triazole on GSH yield in 48 (a),60 (b) and 72 h (c) cultures

綜上，與出發菌株相比（（133.24±0.86）mg/L），ARTP誘變可以顯著提高BY-1-26菌株在發酵48 h的谷胱甘肽產量52.51%（（203.20±4.18）mg/L）；在搖瓶培養10 h添加1,2,4-三氮唑有助于胞內谷胱甘肽釋放到胞外，可以進一步提高其在發酵48 h的谷胱甘肽產量66.49%（（221.83±2.10）mg/L）。誘變菌株在搖瓶培養48 h其谷胱甘肽產量達到最高值，隨著培養時間延長到60 h和72 h，其谷胱甘肽產量持續下降。

2.3.2 搖瓶培養過程中添加高質量濃度1,2,4-三氮唑對畢赤酵母產谷胱甘肽的影響

由2.3.1節結果可知，在搖瓶培養10 h添加1,2,4-三氮唑可顯著提高菌株的谷胱甘肽產量。為了進一步探索更高質量濃度1,2,4-三氮唑對誘變菌株代謝谷胱甘肽的影響，繼續嘗試在搖瓶培養10 h添加終質量濃度為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 g/L的1,2,4-三氮唑，并且分別在48 h測定谷胱甘肽產量和生物量，結果如圖5所示。與未加入1,2,4-三氮唑（圖3）相比，菌株在48 h的生物量（（15.66±0.49）g/L）基本沒有變化；菌株在48 h的谷胱甘肽產量提高2.66%～13.22%，其中，加入終質量濃度為2.4 g/L 1,2,4-三氮唑的樣本谷胱甘肽產量最高，提高13.22%（（230.07±1.26）mg/L）。與加入1.5 g/L的1,2,4-三氮唑的樣本（圖3a，（221.83±2.10）mg/L）相比，其谷胱甘肽產量有進一步增加；與出發菌株相比（（133.24±0.86）mg/L），提高72.67%。以上研究表明，提高1,2,4-三氮唑質量濃度可以進一步提高畢赤酵母菌株產谷胱甘肽的能力。

圖5 添加不同質量濃度1,2,4-三氮唑于BY-1-26菌株搖瓶培養液培養48 h后的谷胱甘肽產量（a）和生物量（b）Fig.5 GSH yield (a) and biomass (b) of BY-1-26 after 48 h shake flask culture with the addition of different concentrations of 1,2,4-triazole

2.4 BY-1-26菌株在高質量濃度1,2,4-三氮唑條件下的MMC適應性進化

以上實驗證實，ARTP誘變技術結合添加1,2,4-三氮唑培養可以有效篩選并促進畢赤酵母菌株高產谷胱甘肽。為此，本研究使用MMC儀，繼續對誘變菌株BY-1-26進行1,2,4-三氮唑的適應性進化。

2.4.1 BY-1-26菌株對1,2,4-三氮唑的適應進化質量濃度分析

基于2.3節實驗，BY-1-26菌株培養液可以耐受2.8 g/L的1,2,4-三氮唑。在MMC體系初步嘗試在更大的0～5 g/L質量濃度范圍內檢測1,2,4-三氮唑對BY-1-26菌株的適應性進化影響。根據24 個液滴在8 個質量濃度梯度的生長曲線（圖6a），當1,2,4-三氮唑質量濃度增加到4.444 g/L時，BY-1-26菌株的生長盡管受到一定抑制，其仍顯示出較好的生長趨勢。BY-1-26菌株在0～10 g/L范圍內的適應性進化曲線（圖6b）顯示，BY-1-26菌株在10 g/L 1,2,4-三氮唑質量濃度條件下顯示明顯的不均一性，表明其生長一致性受到影響。BY-1-26菌株在10～12 g/L范圍內的適應性進化曲線（圖6c）顯示，BY-1-26菌株在12 g/L的1,2,4-三氮唑質量濃度顯示明顯的不均一性。BY-1-26菌株在更高的1,2,4-三氮唑質量濃度（12～15 g/L）下無法顯示規律性的適應性進化曲線（圖6d）。因此，本研究將BY-1-26菌株對1,2,4-三氮唑的適應進化濃度范圍設定為5～12 g/L，以獲得可耐受更高1,2,4-三氮唑抗性的畢赤酵母菌株。

圖6 菌株BY-1-26在不同1,2,4-三氮唑質量濃度下的生長結果Fig.6 Growth status of strain BY-1-26 with different 1,2,4-triazole concentrations

使用MMC體系將BY-1-26菌株在5～12 g/L的1,2,4-三氮唑質量濃度范圍下進行1 輪適應性進化后，挑選長勢較好的液滴提取出來，通過劃線培養，提取單菌落菌株，繼續進行下一輪適應性進化，以此類推，直到獲得耐受較高質量濃度（接近12 g/L）1,2,4-三氮唑且適應性進化曲線良好的菌株。最終挑選了24 個液滴進行后續的菌株純化和搖瓶培養驗證實驗。

2.4.2 適應性進化菌株的生物量和谷胱甘肽產量分析

將經過適應性進化得到的24 個液滴，經過平板劃線，挑取單菌落，各得到1 株分離的單菌株。將分離的24 個單菌株進一步進行搖瓶培養，培養48 h后，檢測每個菌株胞內和胞外谷胱甘肽含量。

經過MMC適應性進化，搖瓶培養后，24 個菌株的谷胱甘肽平均產量達到（292.68±7.76）mg/L（圖7a），對比適應性進化之前BY-1-26菌株的谷胱甘肽產量（圖3a，（203.20±4.18）mg/L），進一步提高了44.04%。其中胞外平均產量為（64.39±2.57）mg/L，對比適應性進化之前BY-1-26菌株的胞外產量（（49.34±2.11）mg/L），提高了30.50%；胞內平均產量為（228.33±6.55）mg/L，對比適應性進化之前B Y-1-26 菌株的胞內產量（（153.85±2.80）m g/L），提高了48.41%。24 個菌株的平均生物量達到（31.75±2.02）g/L（圖7 b），與未經過MMC適應性進化生物量相比（圖3 b，（15.65±0.43）g/L），提高了102.8%，表明MMC適應性進化促進了菌株的生長能力。推測通過MMC適應性進化，加強了誘變菌株谷胱甘肽的胞外滲透性，促進了菌株代謝合成谷胱甘肽的能力。其中液滴編號為24的菌株谷胱甘肽產量最高，達到（312.13±2.62）mg/L，相比BY-1-26的谷胱甘肽產量（（203.20±4.18）mg/L）提高53.61%，將其命名為BY-2-24。由此可以得出結論，經過ARTP誘變所得到的菌株，將其接入MMC進行適應性進化培養后，菌株的生長能力得到加強，而且其谷胱甘肽生產能力也高于馴化之前，更為誘變育種之后的篩選方法提供了新的嘗試。

圖7 搖瓶培養適應高質量濃度1,2,4-三氮唑進化的畢赤酵母菌株谷胱甘肽產量（a）和生物量（b）Fig.7 GSH yield (a) and biomass (b) of 24 single strains obtained by adaptive evolution with high concentrations of 1,2,4-triazoles

2.4.3 適應性進化的高產谷胱甘肽菌株的遺傳穩定性

為了驗證突變菌株遺傳性狀是否穩定，將畢赤酵母BY-2-24連續傳代培養7 次，進行搖瓶發酵培養，待發酵結束測定每代的谷胱甘肽產量和生物量，如圖8所示，經過7 次固體平板劃線培養，BY-2-24仍能保持較好的生長趨勢，每代的谷胱甘肽產量波動較小、基本穩定（（310.17±3.87）mg/L），生物量穩定在（32.67±0.55）g/L。由此說明經過誘變及馴化獲得的突變株，其遺傳穩定性良好，為后續谷胱甘肽的發酵生產研究提供了穩定的菌種。

圖8 傳代培養7 次后畢赤酵母BY-2-24的谷胱甘肽產量（a）和生物量（b）Fig.8 GSH yield (a) and biomass (b) of P.pastoris BY-2-24 after one to seven passages

3 結論

通過ARTP誘變技術與MMC適應性進化相結合，構建了一種谷胱甘肽高產畢赤酵母菌株的高效誘變篩選方法。以畢赤酵母菌株BY-1為出發菌株，通過ARTP誘變初步提高菌株BY-1-26的谷胱甘肽產量52.51%，達到（203.20±4.18）mg/L，進一步通過在搖瓶培養10 h加入終質量濃度為2.4 g/L的1,2,4-三氮唑，提高了菌株的谷胱甘肽產量72.67%，達到（230.07±1.26）mg/L，而對菌株的生物量基本無影響（提高2.9%，達到（15.66±0.49）mg/L）。本研究最終經過高質量濃度1,2,4-三氮唑（5～12 g/L）的MMC適應性進化，提高畢赤酵母菌株BY-2-24生物量118.33%，達（33.23±0.60）g/L，其中提高胞外谷胱甘肽產量47.12%，達（67.57±1.12）mg/L，提高胞內谷胱甘肽產量179.15%，達（243.39±2.33）mg/L，提高谷胱甘肽總產量134.26%，達（312.13±2.62）mg/L。推測與出發菌株相比，誘變菌株谷胱甘肽的細胞壁滲透性增強，解除產物抑制，促進了菌株代謝合成谷胱甘肽的能力。目前傳統的誘變育種方法主要是通過物理誘變（如紫外誘變）和化學誘變（如硫酸二乙酯誘變、甲基磺酸乙酯誘變）進行，陳葉福等[32]通過紫外誘變結合鎘鹽抗性篩選，最終獲得了1 株谷胱甘肽產量達151.88 mg/L的釀酒酵母突變株，比出發菌株提高15.89%。孫姜等[33]通過制備釀酒酵母原生質體，利用多輪亞硝酸誘變處理，最終篩選到1 株胞內谷胱甘肽產量達14.85 mg/g干質量的突變菌株，僅比出發菌株的產量提升24%。另外，目前研究人員已經通過基因工程手段開展了高產谷胱甘肽酵母菌株的選育工作，高宇豪等[15]以畢赤酵母GS115為出發菌株，通過基因的串聯表達、前體氨基酸的添加和優化檸檬酸鈉添加量的方法，使得谷胱甘肽產量達到（371.12±8.47）mg/L，對比出發菌株提升288%。本實驗以野生型畢赤酵母為出發菌株，最終谷胱甘肽產量提高134.26%，達（312.13±2.62）mg/L，相比傳統的誘變篩選效率有了大幅提升。盡管與基因工程手段獲得的產量相比尚有差距，后續可將BY-2-24菌株作為新的基因工程出發菌株，以進一步提升谷胱甘肽產量。

綜上，本研究表明，1,2,4-三氮唑作為抗性篩選標記，不僅可以在梯度平板篩選過程中提高篩選效率，還可以在液體篩選（適應性進化）過程中發揮出色作用。本研究將ARTP結合微液滴培養技術聯合運用于谷胱甘肽生產菌株的篩選過程，與傳統的物理誘變、化學誘變和合成生物學手段相比，不僅操作簡便，而且提升了篩選效率，為現代工業生產應用所需菌株的誘變篩選工作提供了一定的借鑒與參考。