在線固相萃取-高效液相色譜-高分辨質譜法測定植物中11 種水溶性有機酸

戰 楠，孫 青，郝瑞霞，郭 峰,*

（1.國家地質實驗測試中心，自然資源部生態地球化學重點實驗室，北京 100037；2.北京大學地球與空間科學學院，北京 100871）

有機酸廣泛分布于植物的根、莖、葉、果實等部位，對于維持植物自身的新陳代謝具有重要作用：植物根系通過分泌有機酸影響周圍土壤和礦物中元素的釋放，改善根系環境，增強對環境的適應能力；植物莖和葉通過分泌有機酸參與植物光合作用、呼吸作用等過程，促進植物生長；植物果實中積累的有機酸不僅與其風味、色澤密切相關，同時也是判斷果實成熟度的重要指標[1-3]。植物中的一些天然有機酸具有疾病預防和維護人體健康的功效。例如，檸檬酸和蘋果酸能促進體內三羧酸循環，幫助營養元素吸收、提升人體新陳代謝速度[2-3]；沒食子酸具有抑菌、抗炎、抗氧化等生理學活性，可幫助調節腸道菌群組成[4]；琥珀酸具有抑菌、鎮靜、止血的功效，可增強人體免疫力[5]。

目前，有機酸的分析方法主要包括氣相色譜（gas chromatography，GC）和氣相色譜-質譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[6-8]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[9-11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）法[12-19]。GC主要用于測定低分子質量、易揮發的有機酸，對于沸點較高的有機酸通常需要衍生化處理，但衍生化過程會增加操作難度和前處理時間，并且可能導致誤差加劇，從而限制了GC和GC-MS法的應用[6-8]。IC[9-11]和HPLC[12,14-16]是有機酸分析最常用的方法，但非特異性檢測器易受到樣品基質的干擾，因此對于基質復雜的樣品，往往需要采用相對復雜的前處理去除干擾，以保證分析的靈敏度和準確度。質譜具有高選擇性、高靈敏度等優點，可彌補HPLC定性能力不足的缺點，HPLC-MS也因此成為目前公認的有機酸高效檢測方法[13,17-19]，并被2021年最新發布的有機酸國家標準所選用[19]。近年來，高分辨質譜以其精準識別、精確定量的技術優勢，在食品分析領域受到了越來越多的關注。Scordo等[20]利用液相色譜-四極桿-離子阱高分辨質譜建立了測定草莓和橄欖中全氟烷基酸的分析方法，為有機酸的分析提供新思路。

大多數低分子質量的天然有機酸易溶于水，因此通常采用水、甲醇、乙醇等溶劑或混合溶劑提取植物中的有機酸[2,10,12,19-22]。如今，除了常規的蒸餾法[2-3]、超聲提取法[3]、液液萃取法[3,14]、固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）法[3,7,23]外，一些新型前處理技術如固相微萃取[8]、基質固相分散萃取[24]、QuEChERS法[20]也開始應用于有機酸的提取。在線固相微萃取是一種可與儀器連接的在線全自動前處理技術，它與HPLC-MS聯用時，可通過柱切換實現樣品的自動富集、純化、洗脫和分離分析，簡化前處理程序，提高分析效率[25-26]。迄今，在線SPE與HPLC-MS聯用技術已成功地應用于食品和環境領域有機污染物的分析[26-29]，但相關技術對于有機酸的分析鮮有報道。

本研究采用在線SPE技術結合高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high resolution mass spectrometry，HPLC-Q-Orbitrap-HRMS）技術，建立一種快速測定植物中11 種水溶性有機酸的新方法。方法簡單、快速、精準、可靠、自動化程度高，適用于植物中有機酸類化合物的批量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merk公司；甲酸（LC-MS級），有機酸標準品：L-乳酸、香豆酸、沒食子酸、檸檬酸、香草酸、阿魏酸、新綠原酸（純度均大于98%） 上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸銨（分析純） 美國Fisher Chemical公司；富馬酸、琥珀酸、L-蘋果酸、DL-酒石酸（純度均大于98%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；內標：檸檬酸2,2,4,4-D4（＞99%） 加拿大CDN公司；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

HPLC-Q-Orbitrap-HRMS聯用儀Q Extractive（配備DGP-3600RS雙梯度快速分離泵、自動在線SPE系統及Xcalibur數據處理系統） 美國Thermo Fisher公司；A11-研磨機 德國IKA公司；THC-超聲波提取器 濟寧天華超聲電子儀器有限公司；3-15型高速離心機 德國Sigma公司；Milli-Q超純水機 美國Millipore公司；Premier BEH C18AX色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Oasis MAX在線SPE柱（20 mm×2.1 mm，30 μm） 美國Waters公司；0.22 μm親水性尼龍濾膜 上海安譜實驗科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

內標溶液：準確稱取10.00 mg內標物，用甲醇定容至10 mL，配制成1000 mg/L內標儲備液，于4 ℃密封貯存。使用前，用甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋內標儲備液，配成10.0 mg/L內標溶液。

有機酸標準溶液：分別稱取11 種有機酸單一標準品各10.00 mg，用甲醇-水（1∶1，V/V）定容至10 mL，配制成1000 mg/L有機酸混合標準儲備液，于4 ℃密封儲存。

空白標準工作溶液：用甲醇-水（1∶1，V/V）將混合標準儲備液逐級稀釋，配制成質量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的空白標準工作溶液，同時加入內標溶液，使內標質量濃度為1.0 mg/L。

基質標準工作溶液：小白菜和芡實樣品溶液，稀釋100 倍后，配制質量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基質標準工作溶液，同時加入內標溶液，使內標質量濃度為1.0 mg/L。

1.3.2 樣品前處理

以白蘿卜、胡蘿卜、土豆、小白菜、香蕉、蘋果、葡萄、芡實作為植物根、莖、葉、果實、種子的代表性樣品進行實驗。前7 種樣品采購自北京某超市，新鮮芡實采摘自蘇州芡實種植基地。

取適量樣品洗凈、去核、切塊，放入研磨機中制成勻漿。稱取2.00 g勻漿液于離心管，加入18 mL甲醇-水（1∶1，V/V），渦旋振蕩后，超聲提取15 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm親水濾膜，濾液用超純水稀釋數倍后，加入內標溶液，待上機分析。

1.3.3 儀器分析條件

在線SPE與HPLC-MS/MS聯用系統示意圖如圖1所示。

圖1 在線SPE-HPLC-MS/MS質譜分析系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of online SPE-HPLC-Q-Orbitrap-HRMS system

1.3.4 在線SPE條件

通過HPLC系統進行自動在線SPE，左泵為樣品富集泵，右泵為分析泵。具體參數見表1。預處理的樣品在左泵流動相的帶動下，經Oasis MAXSPE柱在線富集，以0.50 mL/min流速等梯度洗脫，清洗2.0 min后，六通閥與分析柱連通，右泵流動相將目標組分及內標物洗脫至BEH C18AX分析柱，洗脫4.5 min后，六通閥自動切換回初始位置，左泵進行在線SPE柱再生。與此同時，右泵流路進行目標組分的分離和質譜檢測。

表1 在線SPE及HPLC條件參數Table 1 Mobile phase parameters for online SPE and HPLC

1.3.5 色譜條件

Premier BEH C18AX色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃，進樣量1.0 mL，流速0.25 mL/min；流動相A：含10 mmol/L甲酸銨的0.9%甲酸溶液，流動相B為0.9%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1。

1.3.6 質譜條件

電噴霧離子源；Full MS/dd-MS2負離子模式掃描；探針溫度450 ℃；離子傳輸管溫度300 ℃；噴霧電壓2.8 kV；S-Lens電壓60 V；鞘氣流速48 arb；輔助氣流速12 arb；吹掃氣流速2 arb；質量掃描范圍m/z50～500；一級全掃描分辨率為70000 FWHM，二級子離子掃描分辨率為17500 FWHM；歸一化碰撞能30 eV。11 種水溶性有機酸的化學性質及質譜離子信息見表2。

表2 11 種水溶性有機酸的化學性質及質譜參數Table 2 Chemical properties and mass spectrometric parameters of 11 water-soluble organic acids

1.3.7 基質效應的計算

在線SPE不僅可以富集目標組分，還可以在一定程度上對樣品基質進行凈化，降低基質干擾[26]。為了評估基質效應對分析過程的影響，采用下式計算[20]：

式中：S1為基質匹配標準曲線斜率；S2為空白標準曲線斜率。

2 結果與分析

2.1 HPLC條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

反相C18色譜柱具有高穩定性、疏水選擇性以及較好的分離能力，是目前有機酸分析常用的色譜柱[2,3,14,20]，也是GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》推薦使用的色譜柱[21]。但采用在線SPE上樣時，洗脫液直接注入分析柱，進樣體積遠大于常規HPLC的進樣量（1～10 μL），因此色譜柱需要更耐酸、耐水，于是本研究選用一種性能更好的新型反相色譜柱（BEH C18AX），其固定相混合填料經過末端封閉比C18色譜柱更穩定。實驗表明，BEH C18AX色譜柱在低pH值條件下，可以實現11 種有機酸的良好分離，且柱流失較低，故選其作為分析柱。

2.1.2 流動相的選擇

11 種目標有機酸均屬于弱酸（表2），其在水中存在離解平衡，但離子態的有機酸在色譜柱上保留較弱，因此常在流動相中加入酸性添加劑，降低流動相pH值促進有機酸向分子形式轉換，增加其在色譜柱上的保留[2,12,14]。實驗考察水-乙腈體系中，甲酸添加量（0.1%、0.5%、0.9%）對分離效果的影響。結果表明，隨著甲酸添加量的增加，11 種有機酸的響應更強，峰形更尖銳，但考慮到儀器管路和色譜柱的酸堿耐受區間為pH 2～10，0.90%甲酸溶液pH值已達到2.2，故不再進一步增加甲酸的量，初步確定流動相中甲酸添加量為0.9%。為進一步提高有機酸離子化效率、促進脫氫準分子離子峰[M-H]-的形成、減少色譜峰拖尾，嘗試在流動相中加入適量甲酸銨，增加目標組分的響應強度。實驗表明，在0.9%甲酸溶液中，隨著甲酸銨添加量（5、10、20 mmol/L）的增大，11 種有機酸的峰形逐漸尖銳，但[M-H]-的響應強度逐漸降低。綜合考慮，確定甲酸銨的添加量為10 mmol/L，故流動相A的組成為含10 mmol/L甲酸銨的0.9%甲酸溶液。

2.1.3 柱溫的選擇

柱溫升高可以降低流動相黏度、提高傳質效率、增加分離度，同時縮短分析時間；但柱溫過高不利于組分的分離，且會影響色譜柱的使用壽命。實驗考察柱溫在25～45 ℃下，11 種有機酸的分離效果及儀器壓力情況。結果表明，隨著色譜柱溫升高，HPLC系統壓力降低，目標組分出峰更快，但分離度降低。當柱溫大于40 ℃時，琥珀酸、檸檬酸和沒食子酸的色譜峰部分重疊；當柱溫降至35 ℃時，三者可基本分離；而當柱溫小于30 ℃時，三者的分離度大于1.5。但考慮到分離度也可由流速調節，而液相系統的壓力則主要由溫度控制，為了避免HPLC系統運行壓力超過Oasis MAX柱壓上限（413 bar/6000 psi），最終選取柱溫為35 ℃。

2.1.4 流速的選擇

考察流動相流速在0.15～0.30 mL/min下，11 種有機酸的分離效果及保留時間。結果表明，當流速小于0.20 mL/min時，有機酸的峰寬較大，且出峰時間靠后，分析時間延長；提高流速至0.25 mL/min時，能獲得較好的峰形和靈敏度，且分析時間也相應縮短；當流速提高至0.30 mL/min時，各組分的分離度下降，且液相系統壓力在運行過程中超過了Oasis MAX柱壓上限（413 bar），故確定流速為0.25 mL/min。

另外，對梯度洗脫程序也進行了優化，通過不斷調整，最終確定的洗脫程序見表1。

2.2 提取條件的優化

選取11 種有機酸均易溶于水（表2），故采用超聲法提取植物樣品中的有機酸，而不必采用加熱回流的方式進行提取，以此簡化實驗操作，縮短分析時間。實驗比較了純水、50%甲醇溶液、甲醇3 種溶劑體系對11 種有機酸提取效率的影響（圖2）。結果表明，11 種有機酸在50%甲醇溶液中的回收率最佳（85.2%～99.2%），比在純水中回收率（75.4%～95.7%）和甲醇中回收率（80.8%～96.5%）更好，故選擇50%甲醇溶液作為提取液。

圖2 提取溶劑對植物中11 種有機酸回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the recoveries of 11 organic acids

2.3 在線SPE條件的優化

目前，商品化的在線SPE柱類型較少、尺寸單一，且缺乏相關的參考文獻。實驗比較了2 種適合分析酸性化合物的在線SPE柱：Thermo Retain AX（2.1 mm×20 mm，60 μm）和Waters Oasis MAX（2.1 mm×20 mm，30 μm）。結果表明，2 種在線SPE柱對11 種有機酸的保留能力相似，但Oasis MAX得到的色譜峰形更窄、響應強度更高，故選擇Oasis MAX作為在線SPE柱。

在線SPE過程的洗脫流速、洗脫時間直接影響目標組分的洗脫效果。實驗考察洗脫流速從0.20～1.00 mL/min對11 種有機酸的洗脫效果。實驗發現，以0.9%甲酸為清洗流動相，流速為0.50 mL/min時，11 種有機酸及內標物的響應強度最高，色譜峰形良好，當流速進一步增大時，蘋果酸和酒石酸會從在線SPE柱上過早洗脫，造成目標物的損失，并且其余色譜峰的響應強度降低、峰形變差，故確定洗脫流速為0.50 mL/min。

實驗考察洗脫時間（1.0～4.0 min）對洗脫效果的影響。結果表明，隨著洗脫時間的延長，目標組分的出峰面積逐漸增大，當洗脫時間不小于2 min時，峰面積變化趨于穩定，說明11 種有機酸的洗脫已基本充分。并且，植物樣品中的一些極性雜質可在前2.0 min內基本去除，故選擇在線SPE柱與分析柱串聯的閥切換時間點為2.0 min。

在優化的實驗條件下，11 種有機酸及內標物的色譜圖如圖3所示，各組分的分離度和響應強度均較好。

圖3 優化條件下的11 種有機酸標準溶液及內標物的HPLC-MS色譜圖Fig.3 HPLC-MS chromatograms of 11 organic acids and internal standard under the optimized conditions

2.4 方法評價

2.4.1 線性范圍和檢出限結果

將7 個系列質量濃度梯度的11 種有機酸混合標準溶液由低到高依次進樣分析。以被測組分和內標物的定量離子峰面積比為縱坐標（y），以被測組分的質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線。對低質量濃度標準溶液進行逐級稀釋，以3 倍和10 倍信噪比對應的質量濃度作為各組分的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。結果表明（表3），11 種有機酸在1～100 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）大于0.999。11 種有機酸的LOD為0.1～3.2 μg/kg，LOQ為0.3～9.6 μg/kg，遠低于現行GB/T 40179—2021《植物中有機酸的測定》[19]中LOQ（0.82～3.25 mg/kg），可以滿足實際樣品分析的需要。

表3 11 種有機酸的線性范圍、線性方程、相關系數、LOD和LOQTable 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LODs,and LOQs for 11 organic acids

2.4.2 準確度與精密度結果

在已知有機酸含量的新鮮芡實、小白菜樣品中，添加2 個不同質量濃度水平的有機酸混合標準溶液，評價方法的準確度和精密度。每個添加水平進行5 次重復實驗，計算平均回收率和日內相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果取平均值。從表4可知，小白菜中11 種有機酸的平均加標回收率在94.2%～110%之間，RSD范圍為0.8%～5.6%；芡實中11 種有機酸的平均加標回收率在92.2%～111%之間，RSD范圍為1.4%～4.9%，說明方法的準確度和精密度良好。

表4 小白菜和芡實中11 種有機酸的回收率、日內精密度和基質效應（n=5）Table 4 Recoveries,intraday RSDs and matrix effects of 11 organic acids in spiked pakchoi and E.ferox seeds (n=5)

2.4.3 基質效應

在質譜離子化時，雜質組分（如糖類、酚類、水溶性色素）會與目標組分發生競爭而產生基質效應，使目標組分的離子化效率增加或降低，影響方法的LOD、LOQ、準確度和精密度[2,3,20]。為了降低基質干擾，通常采用稀釋樣品、SPE凈化、使用同位素內標或基質匹配標準曲線降低其影響[2,3,13,23]。

本實驗采用空白標準曲線法（純溶劑）和基質匹配標準法（樣品溶液）考察小白菜和芡實樣品中的基質效應。分別配制空白標準工作溶液和基質標準工作溶液，按照計算公式得出各組分的絕對基質效應[20]，結果見表4。實驗表明，小白菜樣品的基質效應在-13.6%～25.3%之間，7 種有機酸（富馬酸、蘋果酸、阿魏酸、香豆酸、檸檬酸、香草酸和新綠原酸）呈現基質抑制，4 種有機酸（乳酸、琥珀酸、酒石酸和沒食子酸）呈現基質增強；芡實樣品的基質效應在-18.0%～15.6%之間，除乳酸、琥珀酸、沒食子酸呈現基質增強外，其余8 種有機酸均呈現基質抑制效應。整體而言，只有小白菜樣品中沒食子酸呈現出中等強度的基質增強效應（25.3%），其余10 種有機酸的基質效應絕對值均小于20%，說明小白菜和芡實的基質效應對分析無顯著干擾。但對于基質十分復雜的樣品，建議采用基質匹配標準曲線進行定量分析，以確保檢測結果準確、可靠。

2.5 實際樣品分析

采用本方法，對市售的白蘿卜、胡蘿卜、土豆、小白菜、香蕉、鴨梨、葡萄、芡實8 種不同類型的植物樣品進行分析，每種樣品測5 組，每一樣品平行測定3 次，結果取其平均值（表5）。結果表明，11 種有機酸（圖4）在8 種植物樣品中均有不同程度的檢出，但有機酸的種類和含量在不同植物間的差異較大。蘋果酸和檸檬酸是所有樣品中含量最高的2 種酸，酒石酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、沒食子酸含量次之，而香豆酸、阿魏酸、香草酸和新綠原酸則含量較低或未檢出，檢測結果與文獻報道的濃度水平在同一數量級[2,22,30]。對于芡實樣品，采用GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》[21]進行對比分析，結果表明，本方法與標準方法的測定結果基本一致，但本方法自動化程度更高、用時更短、檢測效率更高。

表5 8 種植物樣品中11 種有機酸的含量Table 5 Contents of 11 organic acids in eight plant samples mg/kg

圖4 土豆（實線）和鴨梨（虛線）樣品中11 種有機酸的HPLC-MS色譜圖Fig.4 HPLC-MS chromatograms of 11 organic acids in potato (solid line) and pear (dashed line) samples

3 結論

采用在線SPE結合HPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術，建立一種快速測定植物中11 種水溶性有機酸的新方法。與已有方法相比，本方法引入了在線SPE技術，使樣品富集、凈化高度自動化，簡化了操作，縮短了分析時間，并避免了離線操作的人為誤差和樣品損失，提高了方法的準確度和分析效率，符合當今分析方法逐漸自動化的趨勢。此外，在線SPE柱可重復使用幾十次，重復性和靈敏度依然良好，檢測成本比普通SPE柱更低，十分適合批量樣品的分析。方法LOD為0.1～3.2 μg/kg，定量限為0.3～9.6 μg/kg，滿足現有國家和行業標準[10,19,21]中有機酸的分析要求。方法已應用于8 種不同類型植物中有機酸的測定，在此基礎上，可推廣至更多植物中有機酸的分析，并為其他水溶性化合物的快速、精準分析提供方法參考。