黃瓜果實維生素C合成關鍵基因克隆與分析

王壯壯，董邵云，周琪，苗晗，劉小萍，徐奎鵬，顧興芳，張圣平

黃瓜果實維生素C合成關鍵基因克隆與分析

1中國農業科學院蔬菜花卉研究所/農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室/蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081；2青島農業大學園藝學院，山東青島 266000

【目的】鑒定調控黃瓜果實中L-半乳糖途徑維生素C（Vc）合成相關基因的位置、數量及表達特征，同時對關鍵基因進行克隆分析，旨在為黃瓜果實中Vc合成調控研究奠定基礎?！痉椒ā扛鶕褕蟮赖臄M南芥中L-半乳糖途徑合成Vc相關基因，利用蛋白編碼的氨基酸序列在黃瓜9930_V2參考基因組數據庫中進行BLAST比對，確定黃瓜中的同源基因，借助TBtools軟件繪制基因在染色體上的位置。通過qRT-PCR分析上述基因在果實Vc含量差異顯著的兩份黃瓜材料中的表達量。利用PCR擴增對限速酶GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）及GDP-甘露糖-3′ 5′-差向酶（GME）同源基因進行克隆，測序分析這些基因在高Vc含量與低Vc含量黃瓜果實中的序列差異。構建系統進化樹，分析黃瓜果實GME、GGP與其他物種中同源基因的親緣關系?！窘Y果】在黃瓜基因組中比對到21個參與L-半乳糖途徑合成Vc相關酶PMI、PMM、GMPase、GME、GGP、GPP、GalDH、GalLDH的同源基因，7條染色體均有分布，在5號染色體和1號染色體上分布最多。通過對21個基因在兩份果實Vc含量高低差異顯著的兩份材料CG45（高Vc含量）和R48（低Vc含量）的表達量分析，發現調控PMI、PMM、GMPase、GME、GalLDH這5個酶的基因在CG45和R48中有極顯著的表達差異。對Vc合成限速酶GGP和GME相關基因在CG45和R48兩份材料中進行克隆發現，在R48中基因全長為3 537 bp，在CG45中基因全長為3 541 bp，該基因在兩份材料存在多個SNP位點差異和Indel差異，有一個突變位點位于CDS區，且導致了氨基酸序列的改變。通過對調控Vc合成限速酶GME、GGP蛋白性質分析，發現限速酶GME、GGP在不同物種的蛋白性質差異不大，均為親水性蛋白，功能相對保守。進化樹分析發現不同物種親緣關系較近的聚類在一起，進化過程高度保守。【結論】鑒定出21個分布于7條染色體上的黃瓜果實Vc合成的L-半乳糖途徑相關基因，推測關鍵酶PMI、PMM、GMPase、GME、GalLDH、GGP可能影響黃瓜果實中Vc含量變化，調控Vc合成限速步驟關鍵酶GME、GGP功能相對保守，Vc合成限速步驟關鍵酶GME基因在高Vc和低Vc兩份材料中的一個SNP位點變異導致氨基酸序列的變化。

黃瓜；Vc；基因克?。槐磉_分析

0 引言

【研究意義】維生素C（Vc）是一種水溶性維生素，廣泛存在于植物體內，參與植物細胞分裂和細胞膨大等生長發育過程[1]，在植物抗逆如抗鹽[2]、抗旱[3]、抗寒[4]等方面發揮著重要作用。Vc是人體維持正常生命活動不可缺少的營養元素，由于人體編碼Vc生物合成最后一步酶的基因突變或缺失已演變為無功能狀態，因此只能依賴飲食供應[5]，因Vc還原態具有治療壞血病的作用，因此又稱其抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）。植物普遍都能合成Vc，不同植物的Vc含量并不相同，且同類植物不同品種、不同發育階段Vc含量也有很大差異[6-7]。由于Vc極易被氧化，蒸煮會導致蔬菜Vc破壞嚴重[8]，生食蔬果是補充Vc的最佳途徑。黃瓜是我國重要的蔬菜產品，2021年，我國黃瓜年均播種面積129.25萬hm2、產量7 559.77萬t[9]，生產規模位居世界前列。黃瓜以生食為主，生食可以使黃瓜中的Vc最大程度被人體攝入。提高果實中Vc含量的目的是提高人體Vc攝入量，對黃瓜而言，花后10 d左右的瓜是人們最佳食用的商品瓜，鑒定該階段限制黃瓜果實中Vc含量關鍵基因對提高黃瓜中Vc含量有重要意義。【前人研究進展】目前，植物體Vc合成途徑研究較為深入，L-半乳糖途徑[10]、肌醇途徑[11]、D-半乳糖醛酸途徑[12]和L-古洛糖途徑[13]是被眾多學者論證的途徑。大量研究表明，L-半乳糖途徑顯著影響植物中Vc含量，很多學者也都在圍繞此途徑展開對植物體Vc合成機制的研究。隨著編碼L-半乳糖-1-磷酸化酶（GGP）的兩個基因和的發現[14-15]，L-半乳糖途徑的所有關鍵酶基因都已確定，途徑涉及的酶包括甘露糖-6-磷酸異構酶（PMI）、甘露糖磷酸變位酶（PMM）、GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）、GDP-甘露糖-3′5′-差向酶（GME）、GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）、L-半乳糖-1-磷酸化酶（GPP）、L-半乳糖脫氫酶（GalDH）、L-1,4-半乳糖內酯脫氫酶（GalLDH）。L-半乳糖途徑中，GGP是L-半乳糖途徑最主要的限速酶[16]，GME是Vc合成過程中唯一的差向異構酶，在擬南芥[17]、獼猴桃中[18]的研究表明GME和GGP協同調控Vc含量。目前黃瓜Vc相關的研究主要對植株研究較多，有學者克隆出黃瓜中L-半乳糖-1,4-內酯脫氫酶cDNA全長，并進行了遺傳轉化[19]；在研究UV-B對黃瓜幼苗AsA及其基因表達的影響時發現，UV-B誘導了與L-半乳糖和肌醇途徑以及抗壞血酸-谷胱甘肽系統有關的基因表達，從而增加了Vc水平[20]；Zhang等[21]從轉錄水平和酶活性水平研究了缺氮條件下黃瓜幼苗抗壞血酸生物合成和循環途徑中關鍵酶的變化，結果表明參與黃瓜葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環途徑和肌醇途徑中的抗壞血酸氧化酶（AO）、谷胱甘肽還原酶（GR）和肌醇加氧酶（MIOX）可能在AsA積累中發揮作用?！颈狙芯壳腥朦c】關于黃瓜果實Vc合成關鍵酶基因的克隆與表達分析尚未見報道。本研究以擬南芥中Vc合成的L-半乳糖途徑為參考，研究黃瓜果實中Vc合成的L-半乳糖途徑?！緮M解決的關鍵問題】鑒定黃瓜果實中參與Vc合成的L-半乳糖途徑相關酶的基因。利用qRT-PCR技術分析這些基因在高含量Vc黃瓜果實與低含量Vc黃瓜果實中的表達情況?？寺∠匏倜富?，分析這些基因在不同材料中的序列差異。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究試驗材料為黃瓜果實Vc含量高低差異顯著的自交系R48（低）和CG45（高），材料均為歐洲類型黃瓜，遺傳背景清晰。試驗材料于2021年3月定植在連棟大棚（山東壽光），田間正常管理。材料來源于中國農業科學院蔬菜花卉研究所黃瓜遺傳育種課題組。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃瓜Vc合成相關基因鑒定及染色體定位 根據文獻[22]獲得12個擬南芥中參與Vc合成的關鍵酶基因，在TAIR數據庫（https://www.arabidopsis.org）獲得相關基因蛋白序列。通過在葫蘆科基因組網站（http://cucurbitgenomics.org）利用BLAST方法從黃瓜基因組（9930-_V2）比對同源基因，利用TBtools軟件繪制基因在黃瓜染色體的位置。

1.2.2 樣品取樣和Vc含量測定 CG45與R48在盛瓜期取中間節位果實，每份材料3個生物學重復，每個重復取3條商品瓜（花后10 d，單性結實）。每條瓜橫向取中間位置兩片，每片厚度約0.5 cm，液氮冷凍，放于-80℃冰箱冷藏，用于后續提取RNA、DNA。每條瓜橫向切取上、中、下3個部位共100 g，迅速用打漿機粉碎，取5 g勻漿精細研磨，利用Vc在紫外區265 nm處有最大吸收，快速測定[23]。

1.2.3 黃瓜果實總RNA提取 將冷藏的樣品放于組織研磨儀中研磨，根據TIANGEN植物總RNA提取試劑盒提取果實RNA，具體按照試劑盒操作說明進行。提取后取2 μL RNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。取2 μL RNA用TaKaRa反轉錄試劑合成cDNA，反轉錄后取1 μL cDNA檢測濃度，并稀釋至100 ng·μL-1用于熒光定量PCR。

1.2.4 熒光定量引物設計 根據BLAST比對到的21個同源基因，利用DNAMAN軟件對其進行熒光定量引物設計。在NCBI通過Primer-Blast模擬擴增，檢測引物特異性，選出合適的引物由上海生工合成，引物序列見表1。

1.2.5 qRT-PCR擴增 以R48和CG45黃瓜果實cDNA為模板，利用熒光定量PCR儀進行熒光定量分析。根據溶解曲線獲得CT值，利用Excel軟件對數據進行處理，根據2-△△CT方法計算各基因相對表達量[24]。以作為內參基因，誤差線代表3個生物學重復的標準誤差。

1.2.6 關鍵酶GME與GGP相關基因的克隆 在黃瓜基因組數據庫（9930_V2）找到相關基因，通過Primer5.0設計引物擴增相關基因（表2）。擴增體系為20 μL，PCR程序為95℃ 3 min；95℃ 15 s、55℃ 15 s、72℃ 3 min、35個循環后72℃延伸5 min，4℃保存。擴增產物用瓊脂糖檢測后送上海生工測序。

1.2.7 Vc合成關鍵酶GME、GGP進化樹構建及理化性質分析 在黃瓜基因組數據庫（9930-_V2）找到黃瓜GME、GGP基因蛋白序列，通過在NCBI上進行BLAST搜索，利用MEGA-X軟件對不同物種同源基因進行進化樹構建，分析親緣關系。在ExPASy主頁（https://web.expasy.org），利用ProtParam分析軟件分析蛋白的等電點（pI）、分子量（Mw）、總平均疏水性（GRAVY）、不穩定系數（II）。

2 結果

2.1 黃瓜Vc合成相關基因

根據擬南芥中Vc合成的L-半乳糖途徑關鍵酶氨基酸序列，在黃瓜基因組網站比對到21個參與黃瓜Vc合成的基因（表3）。黃瓜基因組中，除、、為單拷貝，其余均為多拷貝。PMI存在兩個同源基因，GME存在3個同源基因，GPP、GalDH存在4個同源基因，GMPase存在5個同源基因。

2.2 黃瓜Vc合成相關基因在染色體的位置

根據基因在染色體物理位置，將這21個基因定位在黃瓜7條染色體上，由圖1可知，在5號染色體上分布的基因最多，有5個；其次是1號染色體，有4個；2號和3號染色體較少，均包含3個；4號和7號染色體最少，均包含2個。從物理位置來看，黃瓜中與Vc合成相關的基因分布均勻，不存在大的基因簇。

表1 L-半乳糖途徑同源基因熒光定量引物

表2 GME、GGP相關基因擴增引物

2.3 黃瓜果實Vc含量差異顯著材料的關鍵酶基因表達量分析

對兩份材料R48和CG45的果實Vc含量進行測定，R48為16.83 mg/100 g，CG45為31.4 mg/100 g，兩份材料果實中Vc含量差異顯著。通過對黃瓜中比對到的21個基因在R48和CG45黃瓜果實中的表達量進行分析，發現所有基因在R48中的表達量均低于在CG45的表達量，有9個基因在兩份材料的表達量呈極顯著性差異，分別為PMI、PMM、GMPase、GME、GalLDH這5個酶的相關基因（圖2）。通過對L-半乳糖途徑通路的21個基因在兩份材料果實中的表達分析，推測GGP可能是限制黃瓜果實Vc含量的主要限速酶（圖3）。

表3 黃瓜中Vc合成關鍵酶及相關基因

圖1 黃瓜Vc合成相關基因在染色體的位置

表示差異極顯著；表示差異顯著 indicate extremely significant differences; indicate significant difference

左列圓圈為R48相對表達量，右列圓圈為CG45相對表達量

2.4 黃瓜果實中GME與GGP酶相關基因克隆與序列分析

GME和GGP為Vc合成途徑的限速酶，分別擴增R48與CG45中GME和GGP基因序列，GME有3個拷貝，對表達量差異極顯著的進行克隆。在兩份材料中全長均為3 122 bp，且沒有序列差異（附圖1）。在兩份材料的序列有所不同，在R48中全長為3 537 bp，在CG45中全長為3 541 bp，該基因在兩份材料存在多個位點差異（附圖2），其中一個突變位點位于CDS區，且導致了氨基酸序列的改變（圖4）。黃瓜中僅有一個拷貝，序列長度為3 152 bp，在兩份材料中沒有序列差異（附圖3）。通過鑒定基因保守結構域（NCBI Conserved Domain Search (nih.gov)），發現特定匹配在UGD_SDR_e，屬于NADB_Rossmann超級家族，該突變位點也位于此區間（圖5）。

圖4 CsGME2在兩份材料序列分析

圖5 CsGME2保守結構域分析

2.5 黃瓜中GME的理化性質和進化樹分析

GME是Vc合成途徑中唯一的差向異構酶，包含376個氨基酸，分子量為42.52 kD，等電點為5.94，不穩定系數為41.85，總平均疏水性-0.411。不同物種GME氨基酸長度差異不大，氨基酸長度在376—409 aa，分子量在42.48—46.50 kD，等電點在5.74—6.21，不穩定系數在40左右，穩定性較好，總平均疏水性均為負值，說明GME具有親水性（表4）。對不同植物來源的GME氨基酸序列進行進化樹分析，結果表明黃瓜和同屬葫蘆科的甜瓜進化過程親緣關系最近（圖6）。

2.6 黃瓜中GGP基本理化特性分析及進化樹構建

GGP是L-半乳糖途徑的限速酶。含有445個氨基酸，分子量為49.99 kD，等電點為5.18，總平均疏水性為-0.224，不穩定系數為44.23，推測黃瓜中GGP表現為親水性，且不穩定。由表5可知，不同物種中GGP基因有較大差異，編碼的氨基酸長度在443— 537 aa，分子量介于 49.28—60.04 kD，不穩定系數均大于40，且總平均疏水性均為負值。說明在不同物種中，GGP均為親水性蛋白，且不穩定。對不同植物來源的GGP氨基酸序列進行進化樹分析，結果表明黃瓜和同屬葫蘆科的甜瓜進化關系最近，其次是冬瓜（圖7）。

3 討論

3.1 黃瓜果實L-半乳糖途徑Vc合成相關基因鑒定和肌醇途徑分析

Vc作為蔬菜和水果的一個重要品質指標，提高蔬菜瓜果中Vc含量是一個重要的研究方向。L-半乳糖途徑是目前公認的植物中合成Vc的主要途徑，本研究根據擬南芥L-半乳糖途徑合成Vc的9個關鍵酶的氨基酸序列，在黃瓜基因組比對到21個同源基因，發現編碼GPP的基因在黃瓜基因組有4個基因拷貝，基因注釋均為肌醇單磷酸酶，在水稻基因組中，編碼GPP的同源基因也被注釋為肌醇單磷酸酶。研究表明，擬南芥中GPP不僅能催化L-半乳糖1-磷酸合成L-半乳糖，而且還具有肌醇單磷酸酶活性，是影響肌醇和Vc合成的雙功能酶，在擬南芥中作為肌醇單磷酸酶的活性較低[25]。在黃瓜中比對到的這4個基因是否也具有雙功能作用，還有待進一步研究。不過，外施肌醇可以提高黃瓜幼苗的Vc含量[26]，外施肌醇后番茄的Vc含量也有所提高[27]。綜上，推測肌醇途徑可能參與黃瓜中Vc的合成。

表4 不同物種GME理化性質

圖6 黃瓜和其他物種GME進化樹

圖7 黃瓜和其他物種GGP進化樹

表5 不同物種GGP理化性質

3.2 GME和GGP在黃瓜果實合成Vc中的作用

GME是雙功能酶，既能通過3′,5′-表異構化將GDP-D-甘露糖轉化為GDP-L-半乳糖-1-磷酸，又能通過5′-表異構化將GDP-D-甘露糖催化為GDP-L-古洛糖-1-磷酸[28]。有研究表明，擬南芥GME和GGP協同調控Vc含量[17]，在Vc含量不同的獼猴桃中，GME、GGP的表達量與Vc含量呈正相關[18]。Stevens等[29]利用3個遺傳群體對番茄Vc含量進行QTL定位，發現9號染色體上1個QTL位點與GME相關聯。本研究對GME的相關基因克隆分析，發現在不同材料間有個SNP差異，導致氨基酸發生改變。Vc合成過程的相關酶中GME是最保守的蛋白[30]，本研究通過對黃瓜與其他物種GME的理化性質分析和進化樹構建，發現GME在不同物種間氨基酸數量和蛋白質量變化較小，保守度都較高。綜上，預測GME酶也可能是黃瓜果實中Vc合成的限速酶。

GGP是L-半乳糖途徑最主要的限速酶[16]，擬南芥中編碼GGP的兩個基因和在黃瓜基因組比對到的為同一基因，推測該基因在合成Vc過程中發揮重要作用。GGP是催化抗壞血酸合成的第一步，GGP表達降低和抗壞血酸含量缺乏導致番茄坐果率和產量降低[31]。用獼猴桃或擬南芥GGP基因轉化草莓、馬鈴薯和番茄會導致Vc含量顯著增加[32]。本試驗對不同材料的表達量分析，發現限速酶GGP的相關基因表達量則極低。Zhang等[33]對6個參與Vc生物合成的擬南芥或油菜關鍵基因在水稻中的過表達，發現轉植株的Vc含量最高，轉基因株系的株高、根長、鮮重明顯高于對照植株，表明GGP可能是水稻Vc生物合成的關鍵限速步驟。GGP作為限速酶在多種植物中已被證實受光調控，如擬南芥[26]、獼猴桃[34]，在連續高光強下誘導基因表達，暗處理抑制基因表達[35]。因此，黃瓜中編碼GGP的基因表達量低是否與光調控相關有待進一步研究。

4 結論

在黃瓜基因組中共鑒定出21個分布在7條染色體上的參與L-半乳糖途徑合成Vc的基因，調控PMI、PMM、GMPase、GME、GalLDH這5個酶的相關基因在Vc含量高、低差異顯著的兩份材料R48和CG45果實中表達量差異顯著。調控Vc合成限速步驟關鍵酶GME、GGP功能相對保守，在兩份材料中的序列存在多個SNP和InDel變異，且編碼區一個SNP突變位點導致氨基酸序列發生改變。本研究明確了黃瓜果實中L-半乳糖途徑合成Vc的基因，分析了關鍵酶基因的序列差異，為揭示黃瓜果實Vc合成調控網絡奠定了基礎。

致謝：感謝中蔬生物科技（壽光）有限公司彭立鑫、王利麗對文章相關圖的繪制提供的幫助。

[1] FOYER C H, KYNDT T, HANCOCK R D. Vitamin C in plants: Novel concepts, new perspectives, and outstanding issuesAntioxid Redox Signal, 2020, 32(7): 463-485.

[2] ALVES R C, ROSSATTO D R, SILVA J S, CHECCHIO M V, OLIVEIRA K R, OLIVEIRA F D A, DE QUEIROZ S F, DA CRUZ M A P, GRATAO P L. Seed priming with ascorbic acid enhances salt tolerance in micro-tom tomato plants by modifying the antioxidant defense system components. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2021, 31: 101927.

[3] KHAZAEI Z, ESTAJI A. Effect of foliar application of ascorbic acid on sweet pepper () plants under drought stressActa Physiologiae Plantarum, 2020, 42(7): 118.

[4] LUKATKIN A S, ANJUM N A. Control of cucumber (L) tolerance to chilling stress - Evaluating the role of ascorbic acid and glutathioneFrontiers in Environmental Science, 2014, 2. https://doi.org/10.3389/fcns.2014.00062.

[5] LYKKESFELDT J. On the effect of vitamin C intake on human health: How to (mis)interprete the clinical evidence.Redox Biology, 2020, 34: 101532.

[6] RIVELLI A R, CARUSO M C, MARIA S D, GALGANO F. Vitamin C content in leaves and roots of horseradish (): Seasonal variation in fresh tissues and retention as affected by storage conditions. Emirates Journal of Food and Agriculture, 2017, 29(10): 799-806.

[7] 孫小娟, 劉慶帥, 員盎然, 張妍, 霍俊偉, 秦棟, 姜婷. 黑穗醋栗果實生長發育過程中抗壞血酸含量及相關酶活性的變化. 中國農業科學, 2019, 52(1): 98-110. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.010.

SUN X J, LIU Q S, YUAN A R, ZHANG Y, HUO J W, QIN D, JIANG T. The changes in the contents of ascorbic acid and the activities of related enzymes in black currant fruits during the process of its growth and development. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(1): 98-110. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.010. (in Chinese)

[8] KINYI H W, TIRWOMWE M, NINSIIMA H I, MIRUKA C O, ADADI P, PARISE A. Effect of cooking method on vitamin C loses and antioxidant activity of indigenous green leafy vegetables consumed in western Uganda. International Journal of Food Science, 2022, 2022: 2088034.

[9] https://www.fao.org/faostat/zh/#data.

[10] SMIRNOFF N, WHEELER G L, JONES M A. The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plantsNature, 1998, 393(6683): 365-369.

[11] LORENCE A, CHEVONE B I, MENDES P, NESSLER C L. Myo- inositol oxygenase offers a possible entry point into plant ascorbate biosynthesis. Plant Physiology, 2004, 134(3): 1200-1205. doi: 10. 1104/pp.103.033936.

[12] DAVEY M W, GILOT C, PERSIAU G, STERGAARD J, HAN Y, BAUW G C, VAN MONTAGU M C. Ascorbate biosynthesis incell suspension culturePlant Physiology, 1999, 121(2): 535-543.

[13] WAGNER C, SEFKOW M, KOPKA J. Construction and application of a mass spectral and retention time index database generated from plant GC/EI-TOF-MS metabolite profilesPhytochemistry, 2003, 62(6): 887-900.

[14] SMIRNOFF N, DOWDLE J, ISHIKAWA T. The role of VTC2 in vitamin C biosynthesis inComparative Biochemistry and Physiology. Part A. Molecular & Integrative Physiology, 2007, 146(4): S250.

[15] DOWDLE J, ISHIKAWA T, GATZEK S, ROLINSKI S, SMIRNOFF N. Two genes inencoding GDP-l-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability. Plant Journal, 2007, 52(4): 673-689.

[16] TAO J J, HAO Z, HUANG C H. Molecular evolution of GDP-L- galactose phosphorylase, a key regulatory gene in plant ascorbate biosynthesis. AoB Plants, 2020, 12(6): 55.

[17] YOSHIMURA K, NAKANE T, KUME S, SHIOMI Y, MARUTA T, ISHIKAWA T, SHIGEOKA S. Transient expression analysis revealed the importance ofexpression level in light/dark regulation of ascorbate biosynthesis in. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2014, 78(1): 60-66. doi: 10.1080/09168451.2014. 877831.

[18] BULLEY S M, RASSAM M, HOSER D, OTTO W, SCHüNEMANN N, WRIGHT M, MACRAE E, GLEAVE A, LAING W. Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression inindicates that GDP-L-galactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(3): 765-778. doi: 10.1093/jxb/ern327.

[19] 苑志明, 勞杉杉, 秦智偉, 周秀艷. 黃瓜L-半乳糖-1,4-內酯脫氫酶cDNA全長的克隆和遺傳轉化東北農業大學學報, 2012, 43(7): 100-103.

YUAN Z M, LAO S S, QIN Z W, ZHOU X Y. Cloning and genetic transformation of cDNA full-length of L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase from. Journal of Northeast Agricultural University, 2012, 43(7): 100-103. (in Chinese)

[20] LIU P, LI Q, GAO Y N, WANG H, CHAI L, YU H J, JIANG W J. A new perspective on the effect of UV-B on l-ascorbic acid metabolism in cucumber seedlingsJournal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(16): 4444-4452.

[21] ZHANG X, YU H J, ZHANG X M, YANG X Y, ZHAO W C, LI Q, JIANG W J. Effect of nitrogen deficiency on ascorbic acid biosynthesis and recycling pathway in cucumber seedlings. Plant Physiology and Biochemistry, 2016, 108(7): 222-230.

[22] BULLEY S, LAING W. The regulation of ascorbate biosynthesis. Current Opinion in Plant Biology, 2016, 33: 15-22.

[23] 高海榮, 趙愛娟, 王睿穎, 穆兵. 紫外法快速測定中原地區12種蔬菜VC含量. 湖北農業科學, 2017, 56(6): 1131-1133, 1136. doi: 10. 14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.035.

GAO H R, ZHAO A J, WANG R Y, MU B. The rapid determination of vitamin C content in 12 kinds of central plains vegetables by UV spectrophotometry. Hubei Agricultural Sciences, 2017, 56(6): 1131-1133, 1136. doi: 10.14088/j.cnki.issn0439-8114. 2017.06.035. (in Chinese)

[24] JAROSOVA J, KUNDU J K. Validation of reference genes as internal control for studying viral infections in cereals by quantitative real- time RT-PCR. BMC Plant Biology, 2010, 10(1): 146.

[25] TORABINEJAD J, DONAHUE J L, GUNESEKERA B N, ALLEN- DANIELS M J, GILLASPY G E. VTC4 is a bifunctional enzyme that affects myoinositol and ascorbate biosynthesis in plants. Plant Physiology, 2009, 150(2): 951-961. doi: 10.1104/pp.108.135129.

[26] 苗田田, 李強, 余宏軍, 劉鵬, 郝佳, 蔣衛杰. 外施肌醇對黃瓜幼苗低溫抗性的影響. 中國蔬菜, 2021(2): 72-79. doi: 10.19928/j.cnki. 1000-6346.2021.1001.

MIAO T T, LI Q, YU H J, LIU P, HAO J, JIANG W J. Effects of exogenous myo-inositol on low temperature resistance of cucumber seedlings. China Vegetables, 2021(2): 72-79. doi: 10.19928/j.cnki. 1000-6346.2021.1001. (in Chinese)

[27] MUNIR S, MUMTAZ M A, AHIAKPA J K, LIU G Z, CHEN W F, ZHOU G L, ZHENG W, YE Z B, ZHANG Y Y. Genome-wide analysis of Myo-inositol oxygenase gene family in tomato reveals their involvement in ascorbic acid accumulation. BMC Genomics, 2020, 21(1): 284.

[28] WOLUCKA B A, VAN MONTAGU M. GDP-mannose 3',5'- epimerase forms GDP-L-gulose, a putative intermediate for the de novo biosynthesis of vitamin C in plants. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(48): 47483-47490.

[29] STEVENS R, BURET M, DUFFE? P, GARCHERY C, BALDET P, ROTHAN C, CAUSSE M. Candidate genes and quantitative trait loci affecting fruit ascorbic acid content in three tomato populations. Plant Physiology, 2007, 143(4): 1943-1953. doi: 10.1104/pp.106.091413.

[30] WOLUCKA B A, VAN MONTAGU M, The VTC2 cycle and the de novo biosynthesis pathways for vitamin C in plants: An opinion. Phytochemistry, 2007, 68(21): 2602-2613.

[31] ALEGRE M L, STEELHEART C, BALDET P, ROTHAN C, JUST D, OKABE Y, EZURA H, SMIRNOFF N, GERGOFF GROZEFF G E, BARTOLI C G. Deficiency of GDP-l-galactose phosphorylase, an enzyme required for ascorbic acid synthesis, reduces tomato fruit yield. Planta, 2020, 251(2): 54.

[32] BULLEY S, WRIGHT M, ROMMENS C, YAN H, RASSAM M, LIN-WANG K, ANDRE C, BREWSTER D, KARUNAIRETNAM S, ALLAN A C, LAING W A. Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the l-galactose pathway gene GDP-l- galactose phosphorylase. Plant Biotechnology Journal, 2012, 10(4): 390-397.

[33] ZHANG G Y, LIU R R, ZHANG C Q, TANG K X, SUN M F, YAN G H, LIU Q Q. Manipulation of the rice L-galactose pathway: Evaluation of the effects of transgene overexpression on ascorbate accumulation and abiotic stress tolerance. PLoS ONE, 2015, 10(5): e0125870.

[34] LI J, LIANG D, LI M J, MA F W. Light and abiotic stresses regulate the expression of GDP-L-galactose phosphorylase and levels of ascorbic acid in two kiwifruit genotypes via light-responsive and stress-inducible cis-elements in their promoters. Planta, 2013, 238(3): 535-547.

[35] YABUTA Y, MIEDA T, RAPOLU M, NAKAMURA A, MOTOKI T, MARUTA T, YOSHIMURA K, ISHIKAWA T, SHIGEOKA S. Light regulation of ascorbate biosynthesis is dependent on the photosynthetic electron transport chain but independent of sugars in. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(10): 2661-2671. doi: 10. 1093/jxb/erm124.

Cloning and Analysis of Key Genes for Vitamin C Synthesis in Cucumber Fruit

WANG ZhuangZhuang1, 2, DONG ShaoYun1, ZHOU Qi1, MIAO Han1, LIU XiaoPing1, XU KuiPeng2, GU XingFang1, ZHANG ShengPing

1Institute of Vegetable and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops, Ministry of Agricultureand Rural Affairs/State Key Laboratory of Vegetable Biobreeding, Beijing 100081;2College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266000, Shandong

【Objective】The aim of this study was to identify the location, quantity and expression characteristics of genes involved in regulating the synthesis of vitamin C (Vc) by L-galactose pathway in cucumber fruits, and to clone the key genes, so as to lay a foundation for the regulation of Vc synthesis in cucumber.【Method】According to the reported Vc-related genes within the L-galactose pathway in, the encoded amino acid sequence was used for BLAST in Cucumber 9930_V2 reference genome database. TBtools software was used to map the gene position on cucumber chromosomes. The expression of these genes in two cucumber accessions with significant differences in fruit Vc content was analyzed by qRT-PCR. The homologous genes encoding rate limiting enzymes GDP-L-galactose phosphorylase (GGP) and GDP mannose-3'5'- epimerase (GME) were cloned by PCR amplification, and the sequence differences of these genes in cucumber with high Vc and low Vc were analyzed by sequencing. Phylogenetic tree was constructed to analyze the relatedness cucumber GME, GGP and homologs in other species.【Result】Twenty one homologous genes involved in the synthesis of Vc related enzymes, including PMI, PMM, GMPase, GME, GGP, GPP, GalLDH, and GalLDH in L-galactose pathway, were compared in cucumber and were obtained by BLAST, which were distributed on seven chromosomes, with the most numbers on chromosome 5 and chromosome 1. By analyzing the expression of these genes in R48 (with low Vc) and CG45 (with high Vc), it was found that the genes regulating PMI, PMM, GMPase, GME and GalLDH were significantly different between the two materials. The sequence analysis of Vc synthesis rate-limiting enzyme GGP and GME related genes showed that the full length ofgene was 3 537 bp in R48 and 3 541 bp in CG45. There were multiple SNP sites and Indel difference between the two materials, among which one mutation site was located in the CDS region, and resulted in the amino acids changes. Through the analysis of the protein properties of rate limiting enzymes GME and GGP regulating vitamin C synthesis, it was found that the protein properties of GME and GGP in different species were not significantly different, which were hydrophilic proteins and their functions were relatively conservative. Evolutionary tree analysis found that the clusters with close genetic relationship among different species were highly conservative during evolution.【Conclusion】Twenty one L-galactose pathway related genes of cucumber Vc synthesis were identified, which were distributed on seven chromosomes. It was speculated that the key enzymes including PMI, PMM, GMPase, GME, GalLDH and GGP might affect the Vc content in cucumber fruits. The functions of key enzymes GME and GGP regulating the rate limiting step of Vc synthesis were relatively conservative. The SNP site ongene in the two materials of high Vc and low Vc resulted in changes in amino acid sequence.

cucumber; vitamin C; gene clone; expression analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.03.009

2022-04-13；

2022-06-13

國家現代農業產業技術體系（CARS-23）、中國農業科學院創新工程（CAAS-ASTIP-2017-IVF）、農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室項目、蔬菜生物育種全國重點實驗室項目

王壯壯，E-mail：wangzhuangz2021@163.com。董邵云，E-mail：dongshaoyun@caas.cn。王壯壯和董邵云為同等貢獻作者。通信作者顧興芳，E-mail：guxingfang@caas.cn。通信作者張圣平，E-mail：zhangshengping@caas.cn

（責任編輯 趙伶俐）