GC-MS結合化學計量法分析不同干燥方式對黃花菜風味物質的影響

楊雙喜，馬雪梅，張海紅*，馬慧，王永瑞

1(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)2(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川，750021)

黃花菜又名萱草，是一種藥食同源的珍有物種，具有安神醒腦、增智寬胸、美容養血、解熱消毒、除煩通乳之功效[1]。由于黃花菜采后含水量高，呼吸作用旺盛，耐貯藏性差，且極易腐爛變質，嚴重影響鮮黃花菜品質。因此可以通過干燥方式保存黃花菜，并采用深加工技術提高其附加值。但干燥后風味物質的變化會對產品品質產生影響。趙金梅等[2]研究表明真空冷凍干燥和自然干燥有利于保存鮮沙棗花的揮發性風味成分。馬琦等[3]發現熱風干燥的杏鮑菇揮發性成分品質優于中短波紅外干燥。GC-MS是最常用的分離和鑒定復雜樣品成分的方法，具有分離能力強、靈敏度高、操作方便等特點，因而在果蔬風味的評價中得到了廣泛的應用[4]。成傳香等[5]通過GC-MS結合偏最小二乘判別分析不同種類柑橘汁中香氣物質。龍杰等[6]利用GC-MS結合香氣活性值分析滲透脫水聯合干燥方式對桃脆片揮發性風味物質的影響。李嘉欣等[7]采用GC-MS結合主成分分析不同干燥工藝對蘋果脆片風味物質的影響。

以GC-MS技術對不同干燥方式的黃花菜揮發性物質鑒定，并結合不同化學計量法對其分析的相關研究較少。為此，本文采用3種干燥方式(自然干燥、熱風干燥和真空脈動干燥)對黃花菜進行干燥處理，結合GC-MS技術對3種干燥方式處理的黃花菜樣品揮發性物質進行分析，并采用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)、香氣活性值(odor activity value，OAV)、主成分分析(principal component analysis，PCA)等多元統計分析方法，篩選出不同干燥方式的黃花菜特征風味物質，為黃花菜干燥加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇寧夏吳忠鹽池縣周邊品種“馬蓮花”，成熟度一致，長度10～12 cm，直徑0.7～10 mm，無病蟲害、無機械損傷、未開花且大小(單體重9～12 g)基本一致的花蕾進行實驗。1,2-二氯苯，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

島津Qp2010ultra氣質聯用儀，日本Shimadzu公司；PK157330-U固相微萃取手柄，美國Supelco公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm )毛細管柱，美國Agilent公司；LT202E電子天平，常熟市天量儀器有限責任公司；XW-80A旋渦混合儀，上海嘉鵬科技有限公司；WNB22精密數顯熱風水浴槽，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品干制方法

正常采摘后挑選出符合實驗要求的黃花菜，經過預處理后采用自然干燥、熱風干燥和真空脈動干燥對黃花菜進行干燥處理，并將干制后的黃花菜裝入鋁箔袋置于(4±1) ℃冰箱貯存。干燥前測的鮮黃花菜初始水分含量為86%，要求熱風干燥和真空脈動干燥后的水分含量控制在(15±2)%。3種干燥方法如表1所示。干燥結束后使用研缽搗碎制成粉末狀，并通過40目篩子過濾。

表1 黃花菜3種干燥方法

1.3.2 樣品預處理

頂空固相微萃取：參照SONG等[11]萃取方法并略作修改，準確稱取2.00 g樣品放置于20 mL頂空瓶，再加入內標1,2-二氯苯(4 μL、6.42 μg/mL)，封口膜封口，旋渦混合儀振蕩30 s，放置于50 ℃精密數顯熱風水浴槽中靜置20 min，最后利用50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭富集20 min。富集結束后立即將其轉移到GC進樣口250 ℃下解吸5 min。

1.3.3 GC-MS定性及定量分析

GC條件：色譜毛細管柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度為230 ℃；氦氣流速為2 mL/min；進樣方式為不分流進樣；色譜柱升溫條件：初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速度升至200 ℃，在以10 ℃/min速率升至230 ℃，保持3 min。

MS條件：采用電子電離模式，電子電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，傳輸溫度280 ℃，質量掃描范圍：(m/z)50～350。延遲2.5 min。

揮發性物質的定性定量分析：將分離出的化合物利用計算機檢索與NIST 14和WILEY標準普庫進行初步判定，選擇匹配度>80%的結果，再結合保留時間和參考文獻對揮發性香氣物質再次鑒定。利用已知濃度1,2-二氯苯的峰面積計算樣品中各揮發性物質含量，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：I0代表揮發性物質含量，μg/kg；內標化合物的質量濃度，單位為μg/mL；Ai和A0分別為目標化合物的峰面積和內標化合物的峰面積；2為添加樣品質量，單位為g；4為添加標品體積，單位為μL；分子和分母1 000各代表1 000 g和1 000 μL。

1.3.4 OAV法鑒定黃花菜中特征香氣成分

參考各揮發性物質在水中的閾值[12]，計算篩選出的各香氣化合物OAV值，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：OAVi為物質i的香氣活度值；Ci為黃花菜中物質i的質量濃度,μg/kg；Ti為黃花菜中物質i相對應的水中閾值。相關研究表明OAV≥1的化合物通常被認為是食物基質整體香氣的有效貢獻者；OAV≥10的化合物被認為是影響食物香氣的重要物質[13]。

1.4 數據處理

樣品中揮發性物質數據采用GC-MS在解析軟件結合Excel進行平均值和標準偏差分析。采用SIMAC14.1軟件對樣品進行PLS-DA分析，SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05，利用Origin 2021b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 干燥方式對黃花菜揮發性化合物組分及相對含量的影響

由附表1(https://gb.global.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST &filename=SPFX2022061300Z)可知，利用GC-MS對3種干燥方式下黃花菜樣品的揮發性香氣物質進行鑒定，通過譜庫檢索、保留時間及參考文獻對比，在黃花菜樣品中共鑒定出66種揮發性化合物，其中自然干燥、熱風干燥和真空脈動干燥分別檢測出49、40和44種揮發性香氣物質，含量依次為1 423.41、1 004.6、1 016.55 μg/kg，且自然干燥中3-呋喃甲醛相對含量最高為200.97 μg/kg，熱風干燥和真空脈動干燥中三十二烷相對含量最高，分別為311.53、513.21 μg/kg。由此可知不同干燥方式下黃花菜揮發性化合物的種類和相對含量存在顯著性差異。

由圖1可知，3種干燥方式下黃花菜樣品的揮發性化合物中，醛類物質種類顯著高于其他物質，其中自然干燥和真空脈動干燥種類最多(12種)，熱風干燥略低(11種)；真空脈動干燥樣品烷烴類化合物含量占比最高(58%)，而自然干燥與熱風干燥分別占比19%和54%；烯類和酸類種類均為4種，烯類占比遠低于酸類，且熱風干燥樣品烯類含量最低；酮類和酯類含量占比相同，且自然干燥方式樣品中酮類種類最多，含量占比最高；醇類在自然干燥樣品中種類(9種)和含量(19%)占比最高。上述情況表明，不同干燥方式對黃花菜揮發性物質種類和含量均存在影響。

A-揮發性化合物種類數量；B-揮發性化合物相對含量

醇類化合物的前體物質大多是生長成長鏈脂肪類的多不飽和脂肪酸[14]，且大多數醇類閾值相對較高，對黃花菜的香氣成分貢獻相對較低，但對其具有一定修飾作用。3種干燥方法均檢出1-辛烯-3-醇、芳樟醇、(Z)-2-辛烯-1-醇、2-乙基-1-己醇，其中1-辛烯-3-醇、芳樟醇閾值相對較低，為黃花菜提供花香、青香。烷烴主要包括飽和烴和不飽和烴，其中飽和烴閾值相對較高，不飽和烴閾值相對較低，對黃花菜的香氣貢獻度不大，而烷烴類化合物主要來自于脂肪酸烷氧基的裂解[15]，3種干燥方式共檢測出12種烷烴，其中熱風干燥和真空脈動干燥高達9種，自然干燥達到7種；3種干燥方法檢測出主要的烯類為E-β-羅勒烯，可為黃花菜提供花香和草香香氣。

醛類物質主要來自于脂質分子氧化和自由基裂解[16]，產生的大多數醛類物質具有油脂、青草和堅果氣味，為黃花菜的風味起著積極的貢獻作用，而熱分解是導致3種干燥方法下醛類物質存在差異的主要原因。在3種干燥方式下共檢出15種醛類且均存在己醛、辛醛、苯甲醛、苯乙醛、5-羥甲基糠醛、(E)-2-辛烯醛、任醛、糠醛和青葉醛，其中己醛具有青草、油脂風味；辛醛具有強烈的水果氣味；苯甲醛具有苦杏仁、堅果氣味；苯乙醛具有玫瑰、柑橘香氣；5-羥甲基糠醛具有餅干、面包氣味；(E)-2-辛烯醛具有青香、脂肪；任醛具有油脂、柑橘、青草氣味；糠醛具有油脂味、木香味；青葉醛具有蘋果、青草氣味等與前人研究結果相同[17]。自然干燥中(E)-2-甲基-2-丁烯醛未檢出，而在熱風干燥和真空脈動干燥均有檢出，可以賦予黃花菜強烈的清香和刺激性氣味，另外(Z,E)-2,6-壬二烯醛只在真空脈動干燥中檢出，具有蔬菜氣味；(E,E)-2，4-壬二烯醛只在自然干燥中檢出，呈現油脂味、青草氣味。

SUN等[18]研究發現酯類物質會賦予食品甜香氣味和輕微油脂氣味。其中，鄰苯二甲酸二異丁酯常用作塑料增塑劑，在自然干燥和真空脈動干燥方法下均能檢出，可能是由于實驗過程中受到污染；棕櫚酸甲酯具有強烈的水果氣味，除自然干燥以外其他2種干燥方式下均未檢出，可能是因為在干燥過程中一些復雜的化學反應如糖酵解，蛋白質水解以及脂質氧化等而導致酯類降解[19]。熱風干燥中含有較高的具有果香香氣的2-呋喃甲醇丙酸酯，且在自然干燥和真空脈動干燥中未檢出。分析其未檢出原因可能是酸類和醇類反應過程中溫度過低或者過高導致[20]。

酮類物質分為短鏈酮和長鏈酮，短鏈酮具有脂香，焦香香氣；長鏈酮呈現花香氣息[21]。在3種干燥方式下共檢出9種酮類，其中自然干燥種類最多(8種)，真空脈動干燥種類最少(3種)。其中，1-辛烯-3-酮在3種干燥方法下均可檢出，具有強烈的干草氣味，且略帶薰衣草和玫瑰花香氣。6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、3-辛烯-2-酮和香葉基丙酮等具有清新的泥土香、甜香及清淡的花香香氣，僅在自然干燥和熱風干燥中檢出。3-辛酮僅在熱風干燥和真空脈動干燥中產生，且具有強烈的水果氣味。

酸類物質的產生可能是由于干制過程中不飽和脂肪酸熱分解和熱降解產物的二次反應產物[22]。3種干燥方式中自然干燥酸類物質種類和含量最高，其中己酸在3種干燥方式中均有檢出，含量相對較高，具有刺激性氣味，這可能是由于一些長鏈脂肪酸在干制中熱分解產生[23]。

戊基呋喃在其他化合物中含量最高(5.07～65.36 μg/kg)，一般為碳水化合物或不飽和脂肪酸化產生[24]，具有清新的泥土和蔬菜氣味，主要起到豐富黃花菜香氣組成和調和風味物質的作用，并在3種干燥方式下均存在。

綜上所述，黃花菜呈現的風味并不是某一種特定化合物提供，而是由醇類、醛類、酮類、烷烴類，烯類、酯類、酸類和其他等眾多揮發性化合物作用人感覺器官產生。3種干燥方式下自然干燥和真空脈動干燥在很大程度上促進醇類、酸類和醛類物質的生成，而熱風干燥有效的保留酮類化合物。為盡可能減少熱風干燥和真空脈動干燥揮發性物質損失，后續可優化工藝參數進行建模研究，包括干燥溫度、干燥速率等以最大限度的保留揮發性物質。

2.2 PLS-DA分析

2.2.1 GC-MS數據的PLS-DA

采用PLS-DA對GC-MS數據進行分析，相比PCA，PLS-DA具有監督分析作用。由圖2-A可知，自然干燥位于第1、4象限，熱風干燥位于第2象限，真空脈動干燥位于第3象限，可明顯區分3種干燥方法。通過PLS-DA載荷圖可進一步反應揮發性化合物對已構建模型的貢獻率大小。當揮發性化合物與中心原點越遠，表明其對該模型的貢獻率越大[25]。

a-PLS-DA得分圖；b-載荷圖

由圖2-B可知，真空脈動干燥樣品中三十二烷(45)和2-甲基丙酸(58)在載荷圖中位置與得分圖位置均為第3象限，表明這2種化合物為真空脈動干燥樣品的主要風味物質。糠醛(21)、(E)-2-甲基-2-丁烯醛(25)、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇(39)等揮發性物質為熱風干燥樣品的主要風味物質。3-呋喃甲醛(15)、十六烷(42)、醋酸(54)、己酸(57)等揮發性物質為自然干燥的主要風味物質。

2.2.2 樣品中差異性風味物質的篩選

PLS-DA具有降維、監督分析、復雜數據直觀化和可視化等特點，但在分析過程中易出現過擬合現象，因此，常利用置換檢驗驗證PLS-DA模型[26]，如圖3所示。

圖3 PLS-DA模型置換檢驗

根據PLS-DA模型中變量重要性投影值(variable importance in project，VIP)將每個變量對樣品分類貢獻的大小進行量化，其中VIP>1的揮發性化合物被稱為標志性風味物質。當VIP值越大，表明不同處理方式對其揮發性化合物的影響越大。

由圖4可知，有14種風味物質VIP>1.0，可以作為判別3種干燥方法的重要風味物質。分別為3-呋喃甲醛、苯甲醛、糠醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、十六烷、二十烷、三十二烷、乙酸、己酸、2-甲基丙酸、2-戊基呋喃。利用SPSS軟件將VIP>1的特征揮發性標志物進行單因素方差分析，篩選出黃花菜在不同干燥方式下存在9種差異性風味物質，分別為：苯甲醇、3-呋喃甲醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、十六烷、乙酸、己酸、2-戊基呋喃，其中苯甲醛、3-呋喃甲醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、乙酸、己酸、2-戊基呋喃等可能與黃花菜中脂肪氧化、裂解有關，而十六烷和3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇存在原因有待研究。

圖4 黃花菜干燥樣品的揮發性化合物VIP排序圖

2.3 OAV結合PCA分析

2.3.1 GC-MS數據的OAV分析

根據OAV值可以確定黃花菜在3種干燥方式下共存在12種關鍵風味物質(表2)，其中10種OAV>1，表明其對干燥后的香氣有貢獻；2種化合物的OAV值較高(≥10)，是影響干燥后黃花菜香氣的重要物質，包括1-辛烯-3-醇和乙酸。同時1-辛烯-3-醇也是核桃、平菇、蘑菇、甜瓜重要香氣物質[27]。正乙醇、芳樟醇、植物醇和(Z)-2-辛烯-1-醇等OAV≥1，具有水果和青香氣味。其中，相關研究表明芳樟醇作為柑橘主體香氣成分貢獻著花香和甘橘香味[28]。C8～C9的醛類物質在高度稀釋下，則具有良好的香氣特征，例如壬醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛具有油脂和青草氣味、清香帶甜。壬醛為飽和脂肪酸，曾被認為是六堡茶和普洱茶木香、花香的貢獻成分[29]；(E,E)-2,4-壬二烯醛OAV值相對較高，僅在熱風干燥中為樣品特征香氣，兩者對黃花菜青香氣味貢獻較大。苯乙醛是由苯丙氨酸經脫氨脫羧后形成的相應醛類物質，使3種干燥方式后的樣品均具有苦杏仁和堅果香氣味。酮類物質中，1-辛烯-3-酮具有薰衣草、干草氣味，閾值相對較低，同時也在蘑菇中表現出較大的香氣貢獻值。烯類物質中，β-月桂烯具有清涼氣味，閾值較低，OAV值為1.83，僅真空脈動干燥中檢出，同時β-月桂烯也作為橙汁的關鍵特征香氣。2-戊基呋喃在自然干燥中OAV值為4.51，曾在草魚[30]和紅燒雞[31]中作為特征香氣被檢出。

表2 不同干燥方法黃花菜得到的黃花菜征香氣成分的OAV

A-Venn圖分析；B-共有組分結構式圖

綜上所述，不同香氣物質在黃花菜3種干燥方式下貢獻的香氣程度明顯不同。此外，不同干燥方式下黃花菜的特定香氣物質具有一定的相似性和差異性，因此造成干燥結束后黃花菜的風味具有一定的普遍性和獨特性。

2.3.2 PCA分析

為進一步研究3種干燥方式下黃花菜的特征風味物質，特將12種OAV>1的揮發性化合物進行PCA分析。如圖6所示，2個主成分PC1和PC2累計貢獻率為97.8%>85%，表明2個PCA值能夠解釋原變量絕大部分信息。

圖6 PCA 載荷圖

由圖6可知，乙酸(54)和1-辛烯-3-醇(2)與PC1顯示出較強的正相關，β-月桂烯(50)與PC1顯示出較強的負相關；PC2與β-月桂烯(62)和1-辛烯-3-醇(2)顯示出較強的正相關，與乙酸(54)顯示出較強的負相關。結合OAV值可知黃花菜中重要風味成分為1-辛烯-3-醇(2)、β-月桂烯(62)和乙酸(54)。

3 結論

利用GC-MS技術分析了干燥后黃花菜揮發性物質組成及含量，共鑒定出66種揮發性成分，其中自然干燥、熱風干燥、真空脈動干燥分別檢測到49、40、44種化合物，包括醇類、醛類、酮類、酯類、烷烴類、酸類、烯類和其他類化合物共八類成分，自然干燥揮發性物質含量最高，達到1 423.41 μg/kg。

通過PLS-DA與OAV結合PCA分析共鑒定出6種特征風味物質，其中3-呋喃甲醛、3-辛烯-2-酮、十六烷、乙酸為自然干燥特征風味物質，(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、十六烷為熱風干燥特征風味物質，(E)-2-甲基-2-丁烯醛、β-月桂烯為真空脈動干燥特征風味物質。從獲得良好的風味物質角度出發，真空脈動干燥可以得到較好的干制黃花菜。本研究通過對干燥后黃花菜的風味進行分析，甄選出最適宜的干燥方式，得到風味較好的黃花菜干制品，為今后黃花菜的干燥工藝研究提供了一定的理論依據。