大豆GmPDAT1 參與油脂合成和非生物脅迫應答的功能分析

苗淑楠 高宇 李昕儒 蔡桂萍 張飛 薛金愛 季春麗 李潤植

（山西農業(yè)大學農學院，太谷 030801）

大豆（Glycine max）是世界范圍內重要的糧油作物和工業(yè)原料［1-2］。隨著全球生態(tài)環(huán)境的惡化，低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫制約大豆生產日趨嚴重。因此，解析大豆油脂合成及抗逆性分子機制對大豆產量、品質及抗逆性的遺傳改良和可持續(xù)生產具有重要的意義。

植物油脂主要以三酰甘油（triacylglycerol,TAG）的形式貯藏于種子中［3］。植物貯藏油脂合成包括脂肪酸從頭合成和三酰甘油的合成。植物合成TAG 有2 種途徑：一種是依賴酰基-CoA 的Kennedy 途徑［4］；另一種是不依賴酰基-CoA 的合成途徑。在后者中，磷脂：二酰甘油酰基轉移酶（phospholipid: diacylglycerol acyltransferase, PDAT）能將磷脂（phospholipids, PC）分子中的酰基轉移到二酰甘油（diacylglycerol, DAG）分子的sn-3 位碳原子上，進而合成TAG［5-6］。最早在釀酒酵母鑒定獲得PDAT基因，迄今已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7］、油茶（Camellia oleifera）［8］、亞麻（Linum usitatissimum）［9］、油菜（Brassica napus）［10-11］、花生（Arachis hypogaea）［12］、 向日 葵（Helianthus annuus）［13］、大豆（Glycine max）［14］、橄欖果（Olea europaea）［15］和一些藻類［16］等植物中克隆到PDAT基因并鑒定其功能。已有研究顯示來自不同物種PDAT基因的功能以及編碼的酶蛋白活性存在差異。Zhang 等［17］在擬南芥Atpdat1突變體中用RNAi 抑制AtPDAT1表達時，種子油含量降低70%，而沉默AtPDAT2未導致種子油含量降低，表明AtPDAT1參與種子油脂合成積累。相似地，在擬南芥葉片中過表達AtPDAT1導致油含量升高和脂肪酸組成改變［7］。與AtPDAT1 相比，擬南芥AtPDAT2［17］、蓖麻（Ricinuscommunis）RcPDAT2［18］和亞麻LuPDAT6［8］（PDAT2同系物）均不參與TAG 的合成。另有研究顯示，PDAT 也參與植物非生物脅迫響應。Yuan 等［19］發(fā)現(xiàn)亞麻薺（Camelina sativa）不同PDAT 成員分別參與亞麻薺幼苗低溫、干旱和鹽脅迫的應答。Mueller等［20］發(fā)現(xiàn)擬南芥pdat突變體在高溫脅迫后無法積累TAG。Demski 等［21］在擬南芥中過表達PDAT1，增強了植物對冷熱脅迫的適應性，延緩了植物衰老進程。

目前，關于大豆PDAT家族成員的功能以及是否參與脅迫應答尚不清楚。本研究基于組學分析，全基因組鑒定大豆GmPDAT1家族成員、GmPDAT1基因結構和啟動子順式作用元件，預測GmPDAT1蛋白功能結構域、理化性質、高級結構及系統(tǒng)發(fā)育。通過熒光定量PCR，分析GmPDAT1基因家族各成員在大豆不同組織的表達模式，特別是在大豆低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫下表達譜。應用酵母TAG缺陷型突變體功能互補測試體系，分析GmPDAT1催化TAG 合成的生物學功能，為全面解析大豆GmPDAT1 成員精準生物學功能奠定基礎，亦為植物油脂代謝和抗逆性遺傳改良提供新的科學根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用大豆品種Jack，種植于山西農業(yè)大學農作站試驗基地，分別選取大豆根、莖、葉、花、豆莢和種子，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取發(fā)育良好、長勢一致、展開至2 片真葉的大豆幼苗，于Hoagland 營養(yǎng)液中進行脅迫處理。分別用4℃、250 mmol/L NaCl、20% PEG 處理大豆幼苗，于光照16 h/黑暗8 h 的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。分別取0、3、6、9、12、24 和48 h 的真葉作為檢測材料，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆茫O置3 個生物重復。

1.2 方法

1.2.1 大豆GmPDAT1基因家族生物信息學分析 以來自擬南芥數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）的AtPDAT1（AT5G13640.1）為索引序列，在Phyto zome v13 大豆基因組（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中進行Blast 分析，全基因組鑒定大豆GmPDAT1家族成員。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的在線工具CDD（https://www.ncbi.nlmnih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）對GmPDAT1 蛋白的保守結構域進行分析；利用MEME（http://memesuite.org/index.html） 預 測GmPDAT1 的Motif；利 用TBtools 軟件分析GmPDAT1基因結構；通過ProtParam 在線分 析 軟 件（https//web.expasy.org/protparam/） 分 析GmPDAT1 的理化性質；利用TMHM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白跨膜結構預測；利用SOPMA 在線分析軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測蛋白質二級結構，利用SWISS-MDEL 在線分析軟件（https://swissmodel.expasy.org/interactive）構建蛋白質三級結構模型；使用Genedoc 軟件進行多序列比對分析；使用MEGA 11.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建；利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對GmPDAT1啟動子順勢作用元件進行分析。

1.2.2 總RNA 提取及RT-qPCR 使用植物RNA 快速提取試劑盒（Aidlab 公司）提取正常培養(yǎng)條件下大豆不同組織和3 種非生物脅迫處里后各時間段的大豆幼苗RNA，反轉錄成cDNA（采用Genstar 公司的反轉錄試劑盒）。利用Primer 6.0 設計熒光定量引物（表1），選用GmActin為內參基因。熒光定量采用TaKaRa 的體系，反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，57℃ 30 s，39 個循環(huán)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3GmPDAT1-B的克隆 設計特異性引物擴增GmPDAT1-B的CDS 全長，程序為94℃ 2 min；94℃15 s，68℃ 45 s，68℃ 2 min，35 個 循 環(huán)；68℃ 5 min。將擴增獲得的目標序列與pMD18-T 載體連接，送至擎科生物科技有限公司進行測序，鑒定獲得正確的GmPDAT1-B編碼序列克隆。

1.2.4 大豆GmPDAT1-B酵母表達載體的構建與轉化設計帶有酶切位點KpnI 和EcoR I 的擴增引物，將GmPDAT1-B亞克隆至酵母表達載體pYES2上。用醋酸鋰（LiAc）轉化法將重組質粒pYES2-GmPDAT1-B轉化至釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TAG 缺陷型突變株H1246，使用SC-Ura（2%葡萄糖）固體培養(yǎng)基進行篩選，挑取單菌落進行陽性轉化株檢測。利用氯仿甲醇法提取酵母細胞總脂，具體步驟及油脂含量計算參考周雅莉等［22］方法，然后進行薄層層析（thin layer chromatography,TLC）分析。

2 結果

2.1 GmPDAT1的基因結構分析

以擬南芥AtPDAT1 蛋白序列為索引序列，在大豆基因組中進行BLAST 比對，共檢測到6 個大豆GmPDAT1基因家族成員，分別命名為GmPDAT1-A（Glyma.17G051300.1）、GmPDAT1-B（Glyma.13G10 8100.1）、GmPDAT1-C（Glyma.07G036400.1）、GmPDAT1-D（Glyma.16G005800.1）、GmPDAT1-E（Glyma.12G084000.1）和GmPDAT1-F（Glyma.11G190400.1）。這6 個基因的蛋白和擬南芥AtPDAT1 蛋白都屬于PLN02517 超家族成員，具有典型的磷脂酰膽堿-甾醇O-酰基轉移酶結構域。利用MEME 對AtPDAT1和GmPDAT1 蛋白進行Motif 預測，結果（圖1-A）顯示，6 個大豆GmPDAT1 蛋白與擬南芥AtPDAT1 蛋白的Motif 的數(shù)量和位置基本相同，具有高度保守性。基因結構（圖1-B）所示，GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-C、GmPDAT1-D和GmPDAT1-E與AtP-DAT1類似，均含有6 個外顯子，且具有5′和3′非編碼區(qū)，GmPDAT1-F具有8 個外顯子，不具有非編碼區(qū)。

圖1 GmPDAT1 和AtPDAT1 蛋白Motif 預測（A）和基因結構（B）分析Fig. 1 Motif prediction（A）and gene structure（B）analysis of GmPDAT1 and AtPDAT1 proteins

2.2 GmPDAT1蛋白的理化性質和高級結構分析

通過Protparam（https//web.expasy.org/protparam/）和TMHM（https//web.expasy.org/protparam/）在線分析軟件預測大豆GmPDAT1和擬南芥AtPDAT1編碼的蛋白質氨基酸組成、理化性質及蛋白跨膜結構，結果（表2）顯示，這些蛋白長度介于582-676 aa，理論等電點（pI）5.91-8.59，親水性系數(shù)均為負值，為親水性蛋白。預測的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均為36.12-44.95，為不穩(wěn)定蛋白。GmPDAT1 和AtPDAT1 顯示具有跨膜結構域，短的親水性N 端面向細胞質基質，大部分C 端位于膜內。

表2 大豆 Gm PDAT1 蛋白質理化性質Table 2 Physicochemical properties of GmPDAT1 proteins in G. max

二級結構預測結果表明，GmPDAT1 和AtPDAT1 蛋白主要是由α 螺旋、延伸鏈、β 轉角和無規(guī)則卷曲組成，其中，α 螺旋和無規(guī)則卷曲占比較高，α 螺旋占比為34.43%-41.07%，無規(guī)則卷曲占比為45.51%-37.11%，β-轉角占比小，為5.18%-6.72%（圖2-A），說明α 螺旋和無規(guī)則卷曲是主要組成構件。以溶酶體磷脂酶A2 為模板進行三級結構蛋白質建模顯示，大豆GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-C、GmPDAT1-D、GmPDAT1-E、GmPDAT1-F蛋白氨基酸序列與模板相似度分別為24.44%、25.45%、26.94%、26.36%、24.79% 和23.08%（ 圖2-B）。預示這6 個來自大豆的GmPDAT1 蛋白可能具有AtPDAT1 的功能。

圖2 大豆GmPDAT1 蛋白的二級結構（A）和三級結構（B）Fig. 2 Secondary structures（A）and tertiary structures（B）of soybean GmPDAT1 proteins

2.3 GmPDAT1蛋白的多序列比對和進化樹分析

將大豆GmPDAT1 家族與擬南芥AtPDAT1 蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，6 個大豆GmPDAT1均具有LCAT 超家族典型的保守結構域，包括蓋子區(qū)域（ I），鹽橋區(qū)域（Ⅱ）和催化三聯(lián)體結構（Ⅲ, Ⅳ,Ⅴ）。其中，蓋子區(qū)域內的Trp（色氨酸）與酶活性位點中裂解的脂肪酸結合，Asp 和Arg 之間的鹽橋區(qū)域可能參與到磷脂識別（圖3）。

圖3 大豆GmPDAT1 蛋白氨基酸序列比對Fig. 3 Amino acid sequence alignment of GmPDAT1 proteins in G. max

使用MEGA11.0 軟件，將大豆GmPDAT1 與其他已知功能的植物PDAT1 蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹。大豆GmPDAT1-A 與GmPDAT1-B 在同一分支，與花生（Arachis hypogaea）AhPDAT1 親緣關系較近；GmPDAT1-C 與GmPDAT1-D 在另一分支，與小桐子（Jatropha curcas）JcPDAT1、蓖麻（Ricinus communis）RcPDAT1-1 和油橄欖（Olea europaea）Oep-PDAT1 親緣關系較近。GmPDAT1-E 與GmPDAT1-F與蓖麻RcPDAT1-2 親緣關系較近，聚類在同一分支（圖4）。

圖4 大豆GmPDAT1 與其他物種PDAT1 的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of soybean GmPDAT1s and PDAT1s from other plant species

2.4 GmPDAT1啟動子的順式作用元件分析

分析發(fā)現(xiàn)GmPDAT1編碼區(qū)上游2 000 bp 啟動子中存在多個逆境和激素應答元件（圖5）。所有的GmPDAT1啟動子區(qū)都含有厭氧誘導元件（ARE,AAACCA）。GmPDAT1-A和GmPDAT1-E啟動子區(qū)含有低溫響應元件（LTR, CCGAAA），GmPDAT1-B和GmPDAT1-F存在干旱誘導元件（MBS, CAACTG），GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-E和GmPDAT1-F存在防御與脅迫應答元件（TC-rich,ATTCTCTAAC），說明這些GmPDAT1可能與逆境應答相關。多個激素響應類元件也存在于GmPDAT1啟動子中，例如所有GmPDAT1基因都存在較多的ABA 應答元件（ABRE, ACGTG）；GmPDAT1-A、GmPDAT1-B、GmPDAT1-C、GmPDAT1-D和GmPDAT1-F存在茉莉酸甲酯（MeJA）響應元件（CGTCA 和TGACG）；GmPDAT1-C和GmPDAT1-D存在生長素應答元件（TGA-element, AACGAC）；G m P D A T 1-A、G m P D A T 1-B、G m P D A T 1-D、GmPDAT1-E和GmPDAT1-F存在赤霉素應答元件（GARE, TCTGTTG; P-box, CCTTTTG 和TATC-box,TATCCCA）。表明GmPDAT1家族基因可能受到不同激素的調控。

圖5 大豆GmPDAT1 啟動子的順式作用元件Fig. 5 Cis-acting element identified in the promoters of soybean GmPDAT1 genes

2.5 GmPDAT1在大豆不同組織中的表達模式

RT-qPCR 結果（圖6）顯示，GmPDAT1在大豆不同組織中的表達量不相同，其中，GmPDAT1-A、GmPDAT1-E和GmPDAT1-F在大豆各組織中的表達量極低；GmPDAT1-B在各個組織中均表達，但在種子中的表達量高；GmPDAT1-C和GmPDAT1-D在大豆根、莖、葉、花和豆莢中高表達，但在種子中幾乎不表達。

圖6 GmPDAT1 在大豆不同組織中的特異性表達Fig. 6 Specific expressions of GmPDAT1 in different tissues of soybean

2.6 轉GmPDAT1-B 酵母突變體H1246 恢復油脂合成能力

釀酒酵母突變株H1246 為TAG 合成缺陷株，該突變體敲除了細胞內能夠合成TAG 的4 個基因，DGA1（DGAT2 家族成員）、LRO1（甘油二酯酰基轉移酶）、ARE1和ARE2（酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶），因此缺乏合成TAG 的能力［23］。將GmPDAT1-B轉入酵母H1246，分析轉基因酵母細胞三酰甘油的合成積累量來驗證GmPDAT1-B在TAG合成中的功能。總脂測定結果顯示（圖7-A），與轉空載的酵母相比，GmPDAT1-B的表達提高了H1246酵母的總脂含量，但沒有野生型酵母INVSc1 總脂含量高。進一步對轉GmPDAT1-B酵母總脂進行TLC分析（圖7-B），缺陷型酵母H1246 和轉空載體的TAG 條帶處均未檢測到斑點，而轉GmPDAT1-B的H1246 酵母明顯形成TAG 斑點，說明GmPDAT1-B具有PDAT 酶活性，使H1246 酵母恢復了合成TAG的能力。

圖7 GmPDAT1-B 的酵母互補功能驗證Fig. 7 Complementary function assay of GmPDAT1-B gene using yeast mutant H1246

2.7 GmPDAT1響應非生物脅迫的表達分析

為探究GmPDAT1在大豆抗脅迫中的作用，進一步分析不同非生物脅迫下大豆GmPDAT1的表達特性。RT-qPCR 結果（圖8）顯示，在不同脅迫處理下，GmPDAT1均受到誘導表達。在4℃低溫脅迫處理下，GmPDAT1-B表達量在12 h 時達到最高，為對照的7.26 倍，隨后逐漸降低。GmPDAT1-C表達量在24 h 達到最高，為對照的5.24 倍。與對照相比，GmPDAT1-D表達量在處理后24 h 內明顯降低，但在48 h 時又有所升高。GmPDAT1-F表達量先升高后降低又升高，在處理48 h 后的表達量達到最高，為對照的21.85 倍。然而，GmPDAT1-A和GmPDAT1-E在對照和低溫脅迫處理的大豆幼苗表達量均較低、且無顯著差異。

圖8 大豆GmPDAT1 在不同脅迫處理下的表達譜Fig. 8 Relative expressions of soybean GmPDAT1 under different stress treatments

在250 mmol/L NaCl 處理下，GmPDAT1-B表達量先升高后降低又升高，表達量最高值出現(xiàn)在處理后48 h，為 對 照 的44.32 倍。GmPDAT1-A、GmPDAT1-C和GmPDAT1-E表達量均在鹽脅迫48 h 時達到最高，較未脅迫時分別提高了8.16、14.02 和9.44倍。GmPDAT1-D基因表達量先降低后升高又降低，在處理9 h 后隨脅迫時間繼續(xù)升高，在處理48 h 后表達量為對照的1.23 倍。GmPDAT1-F在對照和鹽脅迫處理幼苗中的表達量無顯著變化。

在20%的PEG 模擬干旱處理下，GmPDAT1-A表達量先升高后降低又升高再降低，表達量最高值出現(xiàn)在處理后的24 h，為對照的13.45 倍。GmPDAT1-B表達量呈持續(xù)上調趨勢，在處理48 h 后的表達量達到最高，為對照的23.58 倍。GmPDAT1-C表達量在48 h 處達到最高，為對照的5.69 倍。GmPDAT1-D表達量與對照相比明顯降低，而GmPDAT1-E和GmPDAT1-F在干旱脅迫處理和對照大豆幼苗中的表達量無顯著改變。

根據(jù)上述RT-qPCR 分析結果，GmPDAT1-B在低溫、鹽和干旱脅迫條件下表達量均顯著上調，由此推測GmPDAT1-B可能在大豆抵抗低溫、鹽和干旱等非生物脅迫中均發(fā)揮重要作用。

3 討論

大豆是世界上重要的油料作物，種子富含有利于人體健康的不飽和脂肪酸，培育高油品種和提高大豆油產量始終是大豆遺傳育種和大豆生產主攻領域。PDAT 是TAG 合成過程中酰基輔酶A 非依賴途徑中的關鍵酶，在擬南芥和一些重要油料作物中發(fā)現(xiàn)PDAT1 在TAG 合成過程中具有重要作用，但在大豆中的研究十分有限。本研究從大豆基因組中得到GmPDAT1家族的6 個成員，這6 個GmPDAT1基因均屬于PLN02517 超家族。生物信息學分析表明，GmPDAT1與擬南芥PDAT1內含子/外顯子數(shù)量基本一致，編碼蛋白的保守基序也一致或相似，說明PDAT 基因進化過程是保守的。RT-qPCR 顯示，6個GmPDAT1在大豆不同組織中的表達量存在差異，GmPDAT1-B在種子中的表達量最高，推測其參與種子的油脂合成。進一步通過酵母功能互補實驗證明，GmPDAT1-B 具有催化TAG 生物合成的酶活性。

在逆境條件下，脂質成分發(fā)生變化以促進膜系統(tǒng)穩(wěn)定從而提高植物的抗逆性［24］。已有報道顯示PDAT 在植物抵御脅迫方面也發(fā)揮重要作用［25］，植物體內的膜脂動態(tài)平衡與PDAT調控基因相關［7］。低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫嚴重限制大豆的生長并導致減產。因此，培育高抗逆境脅迫且高含油的大豆品種尤為重要。本研究分析發(fā)現(xiàn)，大豆GmPDAT1基因啟動子區(qū)域存在幾種脅迫誘導的順式作用元件，包括低溫誘導元件（LTR）、干旱誘導元件（MBS）、防御和脅迫響應元件（Tc-rich）。這些順式作用元件的存在預示著大豆GmPDAT1可能參與脅迫響應。進一步RT-qPCR 分析顯示，不同GmPDAT1成員在非生物脅迫下的表達模式存在差異。GmPDAT1-B在干旱、低溫和鹽脅迫等3 種逆境條件下的表達水平均明顯高于其他基因，預示著大豆PDAT1成員可能在大豆非生物脅迫的調控中起到重要作用。GmPDAT1-B表達特性與花生AhPDAT1［12］和擬南芥AtPDAT1［21］在非生物脅迫下的表達模式基本一致。另外據(jù)報道，有些植物中，在TAG 合成中發(fā)揮作用的DGAT基因也響應逆境脅迫，例如在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中，PtDGAT1在氮脅迫下被上調表達［26］，在氮富集條件下，DGAT2B在TAG 積累開始之前被大量表達［27］。擬南芥幼苗受到ABA、茉莉酸、水楊酸、高鹽和干旱脅迫處理后，AtDGAT1的表達顯著上調［28］，TAG 的積累也增加。本研究顯示，GmPDAT1在調控大豆油脂和抗逆境應答發(fā)揮雙重功能。植物非生物脅迫誘導TAG 形成的代謝過程及脂質代謝是否有助于植物獲得抗逆性仍有待闡明。盡管我們沒有測試在非生物脅迫下GmPDAT1轉基因株系導致的各種生理生化及基因表達的變化，后期將進一步驗證GmPDAT1的功能。PDAT1在非生物脅迫中的作用可能解釋是與溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamines, LPE）相關，在TAG 合成過程中，PDAT將磷脂分子上的酰基轉移至DAG 后，剩下的副產品是溶血磷脂酰膽堿（lysophospholipids: lysophosphatidylcholine, LPC）和LPE，而LPE 長期以來一直被稱為植物衰老阻燃劑［29］。PDAT1過表達可能導致增加植物組織中的LPE 含量，進而促進抗逆性提高。也有研究提出，各種非生物脅迫會導致膜脂重塑，有助于TAG 合成所需的DAG 形成［20］。而PDAT 將脂肪酰基部分從PC 轉移到DAG，進而合成TAG，因此顯示出PDAT 對非生物脅迫下TAG 的積累是必需的，TAG 的富集亦有利于植物組織的脅迫抗性。

4 結論

鑒定獲得6 個大豆GmPDAT1基因，編碼蛋白由582-668 個氨基酸祖成，蛋白序列高度保守，均具有PLN02517 超家族蛋白結構域。GmPDAT1家族成員在不同組織以及低溫、鹽和干旱脅迫下的表達模式存在顯著差異。GmPDAT1-B在發(fā)育種子中表達量最高，且在低溫、鹽和干旱脅迫3 種逆境條件下的表達水平均顯著上調。GmPDAT1-B 具有催化TAG生物合成的酶活性。GmPDAT1-B 可能具有促進油脂合成和脅迫抗性的雙重功能，可作為大豆遺傳改良的一個優(yōu)異候選靶標。