杧果Fe-S 簇裝配基因MiISU1 的生物學功能

崔吉潔 蔡文波 莊慶輝 高愛平 黃建峰 陳亞輝 宋志忠，

（1. 魯東大學農林工程研究院 山東省高校作物高產抗逆分子模塊育種重點實驗室，煙臺 264025；2. 中國熱帶農業科學院作物品種資源研究所，海口 571100；3. 南京林業大學林學院，南京 210037）

鐵（Fe）是植物維持正常生命活動所必需的微量礦質元素之一，在植物生長發育、花的開放、果實品質和產量方面起重要作用［1-3］，土壤缺鐵抑制植物生長，降低果實產量，影響果實品質［4-6］。目前，相關研究集中在生理生化層面，果樹鐵素營養與代謝的分子機制尚不清楚。因此，研究果樹鐵素營養與代謝的分子基礎具有重要的科學意義。

鐵硫簇（Fe-S cluster）是鐵硫蛋白的活性部位，Fe-S 簇的組裝是一個高度復雜和協調的過程，需要多種功能性蛋白參與且有序進行［7-10］。Fe-S 簇裝配機制是植物鐵素營養和鐵代謝的核心環節，在植物的生命過程中具有至關重要的作用［2,8-11］。研究表明，植物鐵硫蛋白存在于質體、線粒體、細胞質和細胞核等亞細胞器官中，直接參與光合作用、呼吸作用、氮同化、氨基酸和嘌呤代謝、植物激素合成和DNA 修復等多種重要生命過程［7-9,11-14］。硝酸還原酶（nitrite reductase, NIR）在葉綠體中氮的同化過程中起重要作用，烏頭酸酶（aconitase, ACO）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase, SDH）直接參與線粒體中糖代謝的檸檬酸循環［2,8-9］。植物中，一個典型的Fe-S 簇裝配過程可分為2 個階段：第一階段，即S 和Fe 結合在支架蛋白上形成Fe-S 簇；第二階段，將Fe-S 簇轉移到靶蛋白，整個裝配過程涉及到鐵供體（FH）、硫供體（NFS）、支架蛋白（SUFB、SUFC、SUFD、NFU、NBP35 等）及轉運蛋白（SUFA、ISA、INDL、GRX、HSCA）等40 多個功能蛋白參與［8-9,12-15］。

目前，模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中Fe-S 簇裝配機制及其調控的分子機理研究的最為透徹，在不同的亞細胞器官中確定了3 種Fe-S 簇裝配機制，即質體硫調動（sulfur mobilization, SUF）、線粒體Fe-S 簇裝配（iron-sulfur cluster, ISC）和細胞質Fe-S 簇裝配（cytosolic iron-sulfur cluster assembly,CIA），其中，質體SUF 和線粒體ISC 兩種機制均以獨立的方式運行，而細胞質CIA 機制中Fe-S 簇的裝配依賴于線粒體完成［8-9,15］。

近年來，國內外學者圍繞植物Fe-S 簇裝配機制開展的研究主要集中在擬南芥［8-9］、水稻（Oryza sativa）［16］和大豆（Glycine max）［17］等一年生模式植物。果樹中Fe-S 簇裝配機制的研究極少，僅在桃（Prunus persica）［18-19］和葡萄（Vitis vinifera）［20］中克隆了Fe-S 簇裝配相關基因，杧果（Mangifera indica）Fe-S 簇裝配的分子機制依然未知。參與線粒體ISC 裝配機制的基因有20 余個，其中，ISU1在水稻［16］、桃［19］和葡萄［20］中表達量最高。然而，有關ISU1生物學功能的研究僅在擬南芥中有報道［9,11］，其他作物ISU1的生物學功能依然未知。

本研究以二倍體‘桂熱82’杧果（Mangifera indica）為材料，克隆參與線粒體ISC 裝配機制的關鍵基因MiISU1，明確其在杧果不同組織部位的組織特異性表達模式，及其在嫁接幼苗中對缺鐵和高鐵毒害的響應特征，為研究杧果Fe-S 簇裝配機制及熱帶作物鐵素營養與代謝的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國熱帶農業科學院作物品種資源研究所提供的五年生‘桂熱82’杧果和一年生嫁接幼苗，野生型擬南芥Col-0、農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株和植物表達載體pHB 為魯東大學農林工程研究院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 利用一年生‘桂熱82’嫁接幼苗，按照Liang 等［16］和Song 等［19］方法，以1/2 MS 液體培養基為對照，進行缺鐵（0 mmol/L）和高鐵毒害（50 mmol/L FeNa-EDTA）處理。

1.2.2 生理生化分析 利用電子天平稱量植株生物鮮重；參照Song 等［19,21-22］方法，植物材料烘干后利用HNO3-HClO4法消解，通過電感耦合等離子體原子發射光譜儀ICP-AES（IRIS Advantage, Thermo Electron, USA）測定鐵含量。根據Liang 等［16］和Song 等［19］方法測定ACO 活性，利用中國南京建成生物工程研究所研發的檢測試劑盒進行NiR 和SDH活性測定［16-17,19］。根據Song 等［19,22］方法進行葉綠素的提取，新鮮葉片浸泡在95%乙醇中，置于4℃黑暗過夜，收集上清液，利用BioRad SmartSpec 3000 吸光度分光光度計（Wadsworth, Illinois, USA）測量總葉綠素含量。試驗設置3 次生物學重復，每次選用20 棵擬南芥幼苗。

1.2.3 杧果MiISU1的克隆 以擬南芥ISU1 氨基酸序列為參考序列，在杧果基因組數據庫［23］中檢索可能的杧果MiISU1 同源蛋白。運用Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）在線服務器預測功能結構域。在杧果基因組數據庫獲得杧果MiISU1的CDS 序列（coding sequence），設計上下游引物，提取‘桂熱82’嫁接苗葉片的RNA，通過PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA 作為模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）擴增目的基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.2.4 系統發育樹建立 利用ClustalX 2.0.13 軟件對杧果、桃、蘋果（Malus domestica）、草莓（Fragaria vesca）、葡萄、柑橘（Citrus sinensis）、擬南芥、鹽芥（Thellungiella salsuginea）、短柄草（Brachypodium distachyon）、白楊（Populus trichocarpa）、番茄（Solanum lycopersicum）、大豆和水稻13 種植物同源家族蛋白分別進行氨基酸序列比對，利用MEGA 7.0 中的鄰接法（neighbor-joining, NJ）構建系統進化樹，分析遺傳進化關系。

1.2.5 實時熒光定量PCR 分析 利用NCBI/Primer-BLAST 在線服務器，設計杧果MiISU1特異性表達引物（上 游 引物：5′-AACATCTTTCTCTGCCTCCG-3′，下游引物：5′-GCATCAGCAGCCTTCTCAAT-3′），以杧果Actin為內參［24-25］，通過ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀檢測杧果MiISU1的組織特異性表達特征及其對脅迫處理的響應差異。熒光染料使用SYBR Green（TaKaRa，大連），反應體系參照商品說明書的描述，反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40 個循環；72℃ 10 s。每個反應進行3 次生物學重復，在ABI 7500 PCR 儀獲得相應的Ct 值，經內參基因Actin均一化處理，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量［16,19,24-25］。

1.2.6 超表達擬南芥轉基因株系的創制 設計構建重組表達載體引物（上游引物序列：5′-GACGGATC CATGCTGAGACTCGCTTCAAAG-3′，下劃線為BamHI限制性酶切位點；下游引物序列：5′-GAGTCTAGA TCAAGCATCAGCAGCCTTCTC-3′，下劃線為XbaI 限制性酶切位點），擴增ISU1的CDS 片段，利用T4 DNA Ligase（TaKaRa，大連）連接ISU1和植物表達載體pHB（實驗室保存）［24-25］，獲得重組質粒pHBMiISU1，并進行雙酶切驗證。利用農桿菌介導的花序侵染法，將重組質粒pHB-MiISU1轉化野生型擬南芥Col-0，分別在含有5 和10 mg/L 潮霉素的1/2 MS培養基平板上篩選T1代陽性抗性苗，通過PCR 驗證陽性植株，隨機收獲編號#6 的轉基因擬南芥進行后續生理表型分析。收獲#6 轉基因擬南芥的T3代種子，在1/2 MS 固體培養基上播種，萌發3 d 后，取20 棵幼苗轉移到缺鐵的1/2 MS 固體培養基中處理5 d 時觀察植株生長情況，共進行3 次生物學重復。

1.2.7 數據分析 利用SPSS 13.0（SPSS Chicago，美國）對數據進行顯著性分析，杧果幼苗在脅迫處理與對照條件2 個獨立樣品間進行t檢驗（*P<0.05，**P<0.01）。

2 結果

2.1 杧果ISU1的鑒定與克隆

參考擬南芥ISU1 氨基酸序列，在杧果基因組數據庫中檢索到1 個杧果同源蛋白MiISU1，Pfam 預測其含有NifU-like N terminal domain 功能結構域，編碼屬于線粒體ISC 裝配機制的支架蛋白Scaffold。以‘桂熱82’葉片RNA 反轉錄獲得的cDNA 為模板，克隆獲得一條525 bp 的片段，命名為杧果MiISU1。

2.2 植物ISU同源蛋白系統發育樹

氨基酸序列比對結果（圖1）表明，杧果、桃、蘋果、草莓、葡萄、柑橘、擬南芥、鹽芥、短柄草、白楊、番茄、大豆和水稻13 種植物ISU1 同源蛋白的序列一致性高達79.12%，并在多處結構域區段高度一致，暗示該蛋白在不同物種進化過程中的功能較為保守。

圖1 13 種植物ISU1 同源蛋白氨基酸序列一致性分析Fig. 1 Amino acid sequence identity analysis of ISU1 homologs from 13 plant species

系統發育樹構建結果（圖2）表明，13 種不同科屬植物ISU 同源蛋白之間的遺傳進化距離差異較大，漆樹科杧果MiISU1 和蕓香科柑橘ISU1 緊密聚在一起，兩者之間的遺傳距離最近，禾本科水稻和短柄草ISU 同源蛋白不同成員之間傾向于聚在一起，十字花科擬南芥和鹽芥ISU 同源蛋白不同成員之間緊密地聚在一起，薔薇科草莓、桃和蘋果ISU 同源蛋白傾向于緊密聚在一起。

圖2 13 種植物ISU 同源蛋白系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of ISU homologs from 13 plant species

2.3 杧果MiISU1的表達模式分析

實時熒光定量PCR 分析結果（圖3）表明，杧果MiISU1在五年生‘桂熱82’新生葉片、新生韌皮部、新生根、花蕾期花朵、盛開期花朵、幼果和成熟果實中均有表達，且表達水平差異較大，ISU1在杧果幼果中的表達量最高，其次是成熟果實、盛開期花朵、花蕾期花朵和新生葉片，在新生根和新生韌皮部中的表達量較低。

圖3 杧果MiISU1 的組織特異性表達分析Fig. 3 Tissue-specific expression analysis of MiISU1 gene in mango

2.4 杧果MiISU1對不同鐵素供應的差異響應

以嫁接一年的‘桂熱82’幼苗為材料，通過實時熒光定量PCR 分析杧果MiISU1對不同鐵素水平供應的響應特征，結果（圖4）表明，與對照相比，缺鐵處理顯著抑制了MiISU1在一年生杧果嫁接幼苗根中的表達量，莖和葉片中的表達量沒有顯著變化，而高鐵毒害顯著增強了MiISU1在整株幼苗不同組織中的表達量。

圖4 杧果MiISU1 對不同鐵素供應條件的響應差異Fig. 4 Differential responses of MiISU1 gene to different Fe supplies in mango tissue culture seedlings

2.5 杧果MiISU1的功能初析

構建重組表達載體pHB-MiISU1（圖5-A），創制異源超表達杧果MiISU1的轉基因擬南芥株系，篩選獲得8 個T1代陽性株系，PCR 驗證均獲得一條525 bp 的MiISU1目的基因條帶（圖5-B）。隨機選取#6 號陽性株系，以其T3代種子進行生長表型和不同鐵素脅迫處理。

圖5 超表達MiISU1 轉基因擬南芥創制及驗證Fig. 5 Generation and verification of MiISU1 over-expression transgenic Arabidopsis seedlings

與對照相比，缺鐵處理顯著抑制了擬南芥植株的生長，并降低了植株鐵素富集能力和NiR、ACO和SDH 等鐵硫蛋白的酶活力（圖6 和表1）。在對照條件下，植株生長5 d 時，T3代轉基因株系的生長情況顯著好于野生型，地上部、地下部的生物鮮重顯著高于野生型，T3轉基因株系葉片NiR、ACO和SDH 酶活均顯著高于野生型，葉綠素含量沒有顯著差異（圖6-A 和表1）。在缺鐵脅迫條件下，植株生長5 d 時，T3代轉基因株系和野生型的葉片均發生失綠，而T3代轉基因擬南芥根部的生長情況顯著好于野生型，T3代轉基因擬南芥根部生物鮮重、葉片葉綠素含量、ACO 和SDH 酶活力均顯著高于野生型，而地上部生物鮮重和NiR 酶活力沒有顯著差異（圖6-B 和表1）。在高鐵毒害條件下，植株生長5 d時，野生型和轉基因株系的生長均枯萎死亡。此外，在對照和缺鐵處理條件下，T3代轉基因擬南芥整株的鐵含量均顯著高于野生型（表1）。以上結果表明，MiISU1在擬南芥中超表達有效增強了轉基因株系的生長情況，并通過增強轉基因植株的根系發育近而提升了對缺鐵脅迫的耐受能力。

表1 轉基因擬南芥缺鐵處理5 d 的生理分析Table 1 Physiological analysis of transgenic Arabidopsis seedlings under Fe depletion for 5 d

圖6 超表達MiISU1 轉基因擬南芥表型分析Fig. 6 Phenotype analysis of MiISU1 over-expression transgenic Arabidopsis seedlings

3 討論

鐵是果樹生長發育最為重要的微量元素之一，與果樹生長、果實品質和產量密切相關［2-6,11］。本研究發現，缺鐵處理顯著抑制了擬南芥植株的生長、葉綠素合成、鐵素富集能力和NiR、ACO 和SDH 等鐵硫蛋白的酶活力，這些結果與水稻［16］、大豆［17］和桃［19］中的報道是一致的，再次驗證鐵是果樹生長發育過程中必不可少的微量元素。

生物界中Fe-S 簇裝配機制是高度復雜的，不管是原始生物還是真核生物，其Fe-S 簇裝配機制一直是非常保守和穩定的［9,11,26］。本研究從漆樹科植物杧果中鑒定了1 個參與線粒體ISC 裝配機制的MiISU1基因，其編碼產物與已報道植物ISU 同源蛋白的氨基酸序列一致性非常高（79.12%），在多個區域片段的氨基酸序列完全一致，暗示杧果Fe-S 簇裝配機制與模式植物一樣，也是高度保守的。特別地，本研究僅在杧果基因組中鑒定到1 個ISU 家族蛋白，這一現象與蘋果、桃、草莓和葡萄一致［18-20］，而水稻、短柄草和番茄中含有2 個ISU 同源蛋白（ISU1和ISU2）［16］，擬南芥、鹽芥中含有3 個ISU 家族蛋白（ISU1-3）［8-9,11］。此外，Léon 等［26］發現擬南芥AtISU3的表達水平很低，該基因可能沒有功能或是假基因。因此，推測植物線粒體ISC 裝配機制中的非功能性ISU 支架蛋白在長期進化過程中更容易發生丟失，多年生果樹作物鐵代謝過程中可能利用更少數量的功能性ISU 支架蛋白。

本研究所選擇的13 種不同科屬植物中，杧果MiISU1 和柑橘ISU1 之間的遺傳距離最近，同屬于薔薇科的桃、草莓和蘋果ISU1 同源蛋白緊密聚集在一起，3 種禾本科植物短柄草、水稻和大豆的ISU同源蛋白傾向于聚在一起，而十字花科植物擬南芥和鹽芥含有最多的ISU 蛋白成員，其同源蛋白分別兩兩緊密聚在一起，這些結果表明，同一科屬或近屬植物的ISU 同源蛋白在系統發育樹上的遺傳距離更近，在長期進化過程中更傾向于擁有相同或相近的生物學功能。因此，研究杧果ISU1 蛋白功能可能為揭示漆樹科作物ISU1 生物學功能提供理論依據。

杧果MiISU1在幼果果實中的表達水平最高，這一發現與桃［18-19］和葡萄［20］中ISU1的表達情況基本一致，與水稻［16］和大豆［17］略有不同，這兩種植物ISU1均在地上部顯著表達。值得注意的是，杧果、桃和葡萄均屬于典型的果樹作物，暗示在果實形成初期可能需要更多的功能性ISU1 支架蛋白參與線粒體ISC 裝配機制。此外，杧果MiISU1在幼苗不同部位對鐵素供應情況的響應存在差異，缺鐵脅迫顯著降低了幼苗根中MiISU1的表達水平，而高鐵毒害顯著增強了整株幼苗中MiISU1的表達水平，推測MiISU1 可能在杧果根中鐵素代謝與營養方面也發揮重要作用，且受鐵素供應水平的調控。

擬南芥AtISU1 作為支架蛋白與分子伴侶HSCB相互作用，參與線粒體ISC 裝配機制［11,26-27］。本研究發現，超表達MiISU1有效改善了轉基因擬南芥的鐵素富集能力、葉綠素合成和關鍵鐵硫蛋白的酶活力，并通過增強轉基因植物根系發育而提升了缺鐵脅迫的耐受能力。因此，推測MiISU1在擬南芥中超表達后可能會積極調動前期在1/2 MS 完全培養基中萌發時所積累的有限的鐵，特別是在缺鐵脅迫條件下，積極調動轉基因株系根部盡可能地從鐵素匱乏環境中富集更多的鐵，用于維持植株基本的光合作用和必須依賴鐵的關鍵鐵硫蛋白的活性，諸如線粒體內直接參與三羧酸循環的SDH 和間接參與檸檬酸異構化作用的ACO，均與糖類、脂類和氨基酸密切相關的代謝通路，進而有效抵抗缺鐵不利環境對植物的迫害作用。與此同時，本研究證實不管是對照條件或缺鐵脅迫下，轉基因株系的鐵含量、ACO和SDH 酶活力均顯著高于野生型。因此，揭示杧果MiISU1 的功能為研究漆樹科植物ISU1 同源蛋白的生物學功能奠定了理論依據。

4 結論

從杧果中分離并鑒定了MiISU1，其在幼果中的表達量最高；超表達MiISU1顯著提高了轉基因擬南芥的生長情況、鐵素富集水平、葉片葉綠素含量、硝酸還原酶、烏頭酸酶和琥珀酸脫氫酶的酶活力，并通過增強轉基因植株的根系發育近而提升了對缺鐵脅迫的耐受能力。