過表達CaCP1 提高轉基因煙草對鹽脅迫的敏感性

杜清潔 周璐瑤 楊思震 張嘉欣 陳春林 李娟起 李猛 趙士文肖懷娟 王吉慶

（1. 河南農業大學園藝學院，鄭州 450002；2. 河南省鋤禾園林草業服務有限公司，鄭州 450000）

辣椒（Capsicum annuumL.）是一類重要的蔬菜作物，在全球范圍內廣泛種植。隨著辣椒設施栽培規模的不斷擴大，復種指數高、大量使用化肥、土壤蒸發快等不利因子的影響，造成土壤鹽漬化嚴重，迫使辣椒植株遭受鹽脅迫，最終影響該產業的經濟效益。

前人研究結果表明，土壤次生鹽漬化可破壞植物活性氧（reactive oxygen species, ROS）的動態平衡，引起植物營養缺乏、氧化脅迫和離子失衡等一系列問題，已成為限制設施園藝作物正常生長發育的重要環境脅迫因子之一［1-2］。Varga 等［3］發現當植物受到鹽脅迫時，抗氧化酶系統保護細胞免受過量產生的ROS 的傷害；Cappetta 等［4］和M?ller 等［5］研究發現植物中蛋白酶通過水解蛋白質產生的多肽分子，調節植物受脅迫下的ROS 信號傳導，保證植物在鹽脅迫下的生長發育。研究進一步發現在高鹽脅迫下植物的蛋白酶活性顯著增加［6-7］。半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases, CPs）是植物蛋白酶的一個重要家族，研究發現其在蛋白質的降解和調節ROS水平中起著至關重要的作用［8-9］。Deng 等［10］發現鹽脅迫下，苜蓿的MtCP77在ROS 積累、PCD 和根瘤衰老過程中發揮關鍵作用。Rodríguez-Herva 等［11］研究表明，煙草半胱氨酸蛋白酶HopN1 可以有效減少鹽脅迫下葉綠體中ROS 的積累。

目前，CPs 家族基因的功能在辣椒中研究較少，前期研究初步發現沉默辣椒中的CaCP1可以提高辣椒的耐鹽性［12］，但CaCP1穩定遺傳后的功能未進一步研究。本研究通過對CaCP1啟動子5′端缺失GUS 表達載體的瞬時表達試驗，分析CaCP1在鹽脅迫下的主要轉錄活性片段。將辣椒CaCP1進行煙草遺傳轉化，以T3代轉基因植株為材料，分析其在鹽脅迫下的功能，為提高辣椒的抗鹽性提供潛在的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒品種為‘B12’（var.grossum（L）. Sendt），用于CaCP1的cDNA 序列和啟動子序列的克隆，煙草‘本氏’品種（Nicotiana benthamiana）用于CaCP1啟動子的瞬時表達，煙草‘百日紅’品種（NicotianatabacumL.）用于CaCP1的遺傳轉化，以上材料均由河南農業大學園藝學院設施栽培研究課題組提供和保存。

1.2 方法

1.2.1CaCP1啟動子GUS 表達載體構建及其煙草瞬時表達 構建CaCP1啟動子5′端缺失GUS 表達載體，將基因的轉錄起始位點指定為-1，從辣椒基因庫中獲得上游區域（2 086 bp，-2 086--1 bp），利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/PlantCARE /html/）預測CaCP1啟動子的逆境順式作用元件。根據順式作用元件的位置，將CaCP1啟動子片段分為4 段（-2 086、-1 540、-980 和-410--1 bp），分別設計包含EcoR Ⅰ和SalⅠ酶切位點的擴增引物（表1），將其分別與植物表達載體pCAMBIA 1381-GUS（圖1-A）連接。經雙酶切驗證后，送上海生工生物公司測序。

用凍融法將p1381、p1381-35S 和CaCP1啟動子質粒（p1381-P1、p1381-P2、p1381-P3 和p1381-P4）分別轉化到農桿菌GV3101［13］。將含有不同長度啟動子片段的轉化菌液，用無菌注射器以全葉片注射方式接種6-8 周齡的本氏煙草葉片（除生長點的葉片），置于人工氣候箱，18℃黑暗培養2 d，具體方法參照Xu 等［14］和Yang 等［15］。

1.2.2CaCP1植物超表達載體PVBG2307-CaMV35SCaCP1 的構建及其煙草的遺傳轉化 設計包含XbaI和KpnI 酶切位點的引物（表1），PCR 擴增得到完整CaCP1的ORF 序列，將其與PVBG2307-GFP 連接，構建PVBG2307-CaMV35S-CaCP1植物表達載體（圖1-B），用凍融法將PVBG2307-CaMV35S-CaCP1轉化農桿菌GV3101［11］。用葉盤法進行煙草的遺傳轉化，具體方法參照Yin 等［16］和Hoekema 等［17］。

圖1 載體示意圖Fig. 1 Schematic of vectors

表1 本文中的引物堿基序列Table 1 Primer base sequences used in this study

1.2.3 瞬時表達和轉基因煙草植株的鹽脅迫處理本氏煙草暗培養2 d，150 mmol/L NaCl 溶液澆透基質，對照煙草不做任何處理，繼續在培養箱內正常生長，24 h 后取樣，一部分鮮樣直接進行GUS 染色，另取一份葉片液氮速凍后-80℃保存，用于GUS的定量表達。

為研究鹽脅迫對轉基因煙草植株的影響，將T3轉基因植株和野生型植株均播種于基質中，待長至兩葉一心，從基質中拔出洗凈根系后轉入1/4 霍格蘭氏營養液繼續培養，待培養至6-8 片真葉時，分別加入200 mmol/L NaCl 溶液進行脅迫處理，觀察葉片的表型變化，并在處理0、1、6 和12 d 后收集第3、4 節位的葉片，一部分樣品液氮速凍后-80℃保存，用于測定煙草脅迫相關基因的定量表達或生理相關指標（SOD、POD 和CAT 活性，以及脯氨酸和MDA的含量），一部分鮮樣用于葉綠素含量、相對含水量和電導率的測定。試驗設置3 個重復。

1.2.4 煙草葉片GUS 組織化學染色及GUS定量分析 分別取3 片注射含有不同長度CaCP1啟動子菌液的煙草葉片，剪切成細條（1-3 mm）混合，加入GUS 染色液（Coollaber 公司），完全浸沒樣品，30℃黑暗過夜。將葉片轉至75%乙醇中，68℃水浴脫色，期間更換4-5 次洗脫液，直至陰性對照材料呈白色。以注射含有不同長度CaCP1啟動子菌液的煙草葉片為材料，提取RNA，根據GUS片段設計定量引物，運用實時熒光定量PCR 分析GUS的表達量。

1.2.5 總RNA 提取、cDNA 第一鏈的合成和RTqPCR 分析 按照Trizol 試劑盒（TaKaRa, Japan）說明書提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMKit 的說明書合成cDNA 第一鏈。用ddH2O 稀釋其濃度為50-60 ng/μL，用于CaCP1的RT-qPCR 分析。利用2-ΔΔCT閾值比較法計算基因的相對表達量。

1.2.6 轉基因株系鹽脅迫下的生理相關指標測定和脅迫相關基因的表達分析 參考Arkus 等［18］方法測定葉綠素含量，參考Guo 等［19］方法測定丙二醛（malonaldehyde, MDA）含 量，參 考Sade 等［20］方法測定葉片的相對含水量（RWC），參照Zhou等［21］方法測定煙草葉片的電解質滲透率（EC）。參考Irigoyen 等［22］方法測定脯氨酸含量。分別參考Zhang 等［23］、Beauchamp 等［24］、Ranieri 等［25］方法測定CAT 含量、SOD 含量和POD 含量。

利用RT-qPCR 方法檢測煙草脅迫相關基因NtCAT、NtSOD、NtAPX、NtLEA5、NtNHX1、NtPOX2、NtP5CS1和NtSOS1的表達，以NtActin為內參基因，引物如表1 所示。

1.2.7 數據分析 運用Excel 2010 進行數據處理，利用DPS7.5 軟件進行方差分析，用SigmaPlot 14.0軟件作圖。

2 結果

2.1 CaCP1啟動子順式作用元件分析

為了研究CaCP1的轉錄調控特性，鑒定CaCP1起始密碼子上游2 086 bp 啟動子序列中的順式調控元件，并利用PlantCARE 數據庫進行分析。生物信息學分析表明，該區域存在一些在不同植物中已知的調節逆境和防御基因表達的順式作用元件。這些元件包括4 個響應鹽脅迫的順式作用元件GT-1、5個響應干旱脅迫的順式作用元件MYC、7 個響應光反應的順式作用元件Box4 和G-box、1 個參與防御和脅迫響應的順式作用元件TC-rich repeats。除了含有與脅迫相關的順式作用元件，CaCP1啟動子序列中含有與激素有關的順式作用元件，2 個脫落酸（ABA）響應元件ABRE、1 個水楊酸反應元件TCAelement 和1 個生長素響應元件TGA-element。此外，17 個啟動子增強區域的順式作用元件CAAT-box 分布在整個CaCP1啟動子區域中（圖2）。

利用辣椒基因組序列信息克隆CaCP1的2 086 bp 啟動子序列，根據CaCP1啟動子中預測的相關作用元件，構建不同長度啟動子片段的重組載體（圖2），為尋找CaCP1啟動子序列中響應鹽脅迫的區域而進行啟動子5′片段缺失試驗。

圖2 CaCP1 啟動子順式作用元件分析Fig. 2 cis-elements analysis in the promoter regions of CaCP1

2.2 CaCP1啟動子5′缺失表達載體的瞬時表達

將含有不同長度啟動子片段表達載體轉化煙草，對不同轉基因植株的煙草葉片進行染色以及GUS的表達量進行檢測（圖3），結果發現，陽性對照植株1381-35s 葉片經GUS 染色后表現為深藍色，并呈現極高的GUS表達水平，P2、P3 和P4 在未經處理后GUS 染色后表現出藍色，且P4 的GUS表達水平略高于陰性對照。鹽處理后，P1、P2、P3 和P4 的煙草葉片經GUS 染色后均表現出藍色，且藍色程度高于對照，P2、P3 和P4 的GUS表達水平均明顯高于對照。其中，P4 的煙草葉片藍色最深，且P4 的GUS表達水平是陰性對照的11 倍。

圖3 CaCP1 啟動子活性分析Fig. 3 Activity analysis of promoter of CaCP1

綜上所述，CaCP1啟動子不同區段均可響應鹽脅迫，但其P4 啟動子片段對鹽脅迫的響應最為強烈，故P4 區段可能對于辣椒鹽脅迫反應過程中CaCP1的轉錄激活有重要作用。

2.3 35S-CaCP1轉基因植株在鹽脅迫下的表型分析

為進一步研究CaCP1對鹽脅迫的響應作用，構建過表達載體PVBG2307-CaMV35S-CaCP1轉化煙草植株。用200 mmol/L NaCl 溶液處理T3代轉基因煙草和野生型株系（圖4）。在未處理前，35S-CaCP1-5-2-5、35S-CaCP1-19-6-17 和WT 表型無差異。鹽處理6 d 后，三者葉片均出現皺縮，下層葉片有黃化現象，且35S-CaCP1-5-2-5、35S-CaCP1-19-6-17 株系的葉片萎蔫和黃化程度較重。鹽處理10 d 后，轉基因株系除最上部的幼葉呈綠色外，其他葉片均變為黃色，且下部葉片邊緣已出現壞死癥狀。對照植株的葉片皺縮，下部老葉呈黃色，而上部葉片依然保持綠色。結果表明，CaCP1過表達煙草株系對鹽脅迫響應更敏感。

圖4 鹽處理后35S-CaCP1 轉基因煙草的表型Fig. 4 Phenotypes of 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants after salt treatment

2.4 35S-CaCP1轉基因植株鹽脅迫下葉綠素、MDA、相對含水量和電導率的變化

鹽脅迫處理0、6 和12 d 時，分析35S-CaCP1過表達轉基因和野生型葉片的葉綠素、MDA、相對含水量和電導率的變化（圖5），處理前，除35S-CaCP15-2-5 株系的電導率顯著高于野生型外，其余指標在轉基因和野生型間無顯著性差異。隨著鹽脅迫處理時間的延長，轉基因和野生型株系葉片的葉綠素含量和相對含水量均逐漸降低，且轉基因株系降低幅度顯著大于野生型。MDA 和電解質滲漏率呈上升趨勢，且轉基因株系的上升幅度顯著高于野生型。轉基因株系間的葉綠素、MDA、相對含水量和電導率無顯著性差異。

圖5 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉基因和野生型株系的葉綠素含量、MDA 含量、相對含水量和電導率Fig. 5 Chlorophyll, MDA, relative water content and electrical conductivity of 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants under salt stress

2.5 CaCP1轉基因植株鹽脅迫下抗氧化酶和脯氨酸含量的變化

為進一步分析鹽脅迫對CaCP1超表達的影響，測定轉基因和野生型葉片在0、6 和12 d 后的抗氧化酶和脯氨酸含量（圖6）。處理前，轉基因植株葉片CAT 活性顯著低于野生型，SOD 活性顯著高于野生型，且2 個轉基因株系無顯著性差異。與0 d 時比較，隨著鹽脅迫處理后，轉基因株系和野生型的CAT 活性顯著下調，12 d 后分別下調1.38、1.35 和1.58倍。野生型的SOD 活性在鹽處理6 d 時上調，12 d下調，轉基因株系的SOD 活性一直顯著下調，鹽處理12 d 后，分別下調5.12 和3.37 倍，且轉基因株系的CAT 和SOD 活性降低幅度大于野生型。轉基因株系和野生型POD 活性隨著鹽處理而逐漸增加，且轉基因株系上調的幅度顯著高于野生型，尤其在12 d 時，高于對照2.54 和2.64 倍。

圖6 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉基因和野生型株系的CAT、SOD、POD 酶活性和脯氨酸含量Fig. 6 CAT activity, SOD activity, POD activity, and proline content of 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants after salt treatment

處理前，轉基因株系和野生型葉片的脯氨酸含量無差異，35S-CaCP1-15-2-5 轉基因株系和野生型葉片的脯氨酸含量在鹽處理6 d 時增加，12 d 減少，但35S-CaCP1-15-2-5 轉基因株系的脯氨酸含量變化的程度顯著低于野生型，且35S-CaCP1-19-6-17 轉基因葉片的脯氨酸含量在鹽處理后一直上調，且在12 d 顯著高于野生型。

2.6 鹽脅迫下CaCP1轉基因植株抗氧化酶基因的表達水平變化

為進一步分析轉基因和野生型煙草中的抗氧化酶活性在鹽脅迫下的變化，運用RT-qPCR 測定株系中抗氧化酶基因NtCAT、NtSOD、NtAPX和NtPOX2的表達水平（圖7）。與0 h 時野生型的表達水平相比，鹽處理24 h 后，野生型株系的NtCAT、NtSOD、NtAPX和NtPOX2的表達水平分別上調1.37、10.76、96.34 和11.55 倍，轉基因株系的NtCAT的表達水平分別下調0.59 和0.77 倍，而NtSOD、NtAPX和NtPOX2的表達水平分別上調5.17 和6.38 倍、12.52和37.87 倍、5.17 和6.93 倍。NtCAT在 轉 基 因 株系中的抑制程度大于野生型，NtSOD、NtAPX和NtPOX2在轉基因株系中的上調量顯著低于野生型。

圖7 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉基因和野生型株系抗氧化酶相關基因的表達變化Fig. 7 Expression profiles of antioxidant-related genes in 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants and wild plants after salt treatment

2.7 鹽脅迫下CaCP1轉基因植株脅迫相關基因的表達水平變化

為了進一步分析鹽脅迫下CaCP1轉基因植株的受脅迫程度，檢測野生型和轉基因煙草中的脅迫相關基因NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1的表達水平發現，經鹽處理24 h 后，野生型植株中的NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1均呈現大幅度的上調表達，分別上調5.36、5.82、288.05 和17.08 倍，轉基因煙草中的NtLEA5和NtP5CS1的表達也顯著增強，分別上調1.35 和2.68 倍、40.42 和137.82 倍，但上調幅度顯著小于野生型。轉基因煙草中的NtNHX1和NtSOS1表達出現小幅度的上調，分 別 為1.77 和1.50 倍、3.43 和4.10 倍。鹽 處 理后，轉基因株系的NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1的表達水平都顯著低于野生型（圖8）。

圖8 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉基因和野生型株系脅迫相關基因的相對表達量變化Fig. 8 Relative expression profiles of stress-related genes in 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants and wild plants after salt treatment

3 討論

在植物中，CPs 參與鹽脅迫。如擬南芥AtRD21A和AtRD19A，在鹽脅迫的誘導下表達量增高［26］。在NaCl 處理的豌豆幼苗中，Cyp15a的轉錄水平增加［27］。在鹽脅迫下，小麥PLCP 基因（TaCP）表達上調［28］。擬南芥中SPCP2的過表達增強了對鹽脅迫的抗性［29］。水稻中的CPs 基因LOC_Os01g73980、LOC_Os02g27030 和LOC_Os05g01810 的表達也被鹽脅迫高度激活［30］。在之前的研究中，鹽脅迫可促進CaCP1顯著上調表達［12］，為了研究辣椒在鹽脅迫下如何調控CaCP1的表達，本研究首先克隆了CaCP1的2 086 bp 啟動子，并在其中識別了幾個順式調控元件，這些元件被預測會響應信號分子和環境脅迫。隨后，對CaCP1啟動子進行了缺失分析，通過農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達，確定鹽脅迫應答的主要啟動子區域。本研究獲得的瞬時表達結果顯示，NaCl 處理顯著誘導CaCP1啟動子的缺失片段P2、P3 和P4，且啟動子缺失片段P4 的GUS定量高于其他缺失片段。表明410 bp（P4）段可能含有非生物脅迫誘導的順式作用元件。在CaCP1啟動子中發現了4 個GT-1 motif，它是一個參與響應鹽脅迫順式作用元件［31］。結果表明，啟動子缺失片段P4 上的GT-1 motif 可能對于調控CaCP1在鹽脅迫下的表達發揮主要作用。

為了更好地了解CaCP1的功能，用T3代CaCP1過表達煙草轉基因植株進行鹽處理，并測定其葉綠素含量和相對含水量發現，CaCP1轉基因株系和野生型株系葉片的葉綠素和相對含水量均顯著低于野生型。前人研究得知葉綠素含量和相對含水量與植株的受損傷程度成反比［32］，本研究結果表明，過表達CaCP1加劇了植株在鹽脅迫下的損傷程度。基于轉錄組分析發現，缺失或過表達CPs 基因，如AtCEP1、HvPAP14等能誘導植物光合基因表達變化［33-34］。此外，細胞質中的CPs 影響葉綠素含量［35］。MDA 一般用于評價植物高鹽脅迫下ROS 介導的脂質過氧化程度［36］。鹽處理下，CaCP1轉基因株系和野生型的MDA 和電解質滲漏率呈上升趨勢，且轉基因株系的上升幅度顯著高于野生型。結果表明，CaCP1過表達提高植株脂質過氧化程度，即脅迫程度增加。這與HpXBCP3的過表達可增加雨生紅球藻對NaCl 脅迫的敏感性一致［37］。

脯氨酸在植物遭受土壤鹽分引起的高滲透脅迫時起著保護滲透的作用，據報道NtP5CS1參與了脯氨酸在鹽脅迫下的生物合成［38］。鹽處理6 d后，轉基因株系的脯氨酸含量顯著低于野生型，而NtP5CS1在鹽處理24 h 的表達量低于野生型，而鹽處理12 d 后，轉基因株系的脯氨酸含量略高于野生型，證明CaCP1基因提高了植株對鹽脅迫的敏感性。

在處理前和鹽脅迫下，CaCP1過表達轉基因植株ROS 清除酶活性（CAT、SOD 和POD）與野生型相比有極大的差異。其中轉基因株系的CAT 和SOD活性顯著低于野生型，POD 活性顯著高于野生型。鹽脅迫對CAT、POD、SOD 等抗氧化酶均有顯著的提高作用，表明清除活性氧是棉花耐鹽機制的重要組成部分［39］，但是楝樹幼苗的POD 活性呈上升趨勢并且隨著鹽濃度的增加而下降［40］，推測是由于POD 既能消除ROS，也可以促進ROS 的生成而引起的［41］。此外，在CaCP1過表達植株中，NtCAT、NtAPX、NtSOD和NtPOD2等抗氧化酶基因的低表達會降低這些酶的活性，從而減弱對鹽脅迫的耐受性。以上結果表明，轉基因煙草中CaCP1的過表達主要導致活性氧清除基因/酶CAT 和SOD 水平降低，提高CaCP1過表達植株對鹽脅迫的敏感性。

當植物遭受鹽脅迫時，許多信號通路被激活，如逆境應答基因SOS、NHX1、P5CS和LEAs的表達［42-45］。AlSRG1轉基因煙草在鹽脅迫或滲透脅迫之后，NtSOS1和NtNHX1的轉錄水平顯著增加，提高了AlSRG1轉基因煙草的抗性［46］。干旱和鹽脅迫下，與野生型相比，NtP5CS1、NtSOS1和NtNHX4的表達水平上調，TaGF14b轉基因煙草通過調節逆境應答基因表達改善非生物脅迫的耐受性［47］。NtLEA5和NtP5CS1高度上調表達也提高轉基因煙草的抗鹽性［48-49］。本研究中，轉基因植株的NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1等脅迫相關基因在鹽脅迫下的表達量顯著低于野生型，說明CaCP1的過表達降低了植株的抗鹽性。

4 結論

CaCP1的啟動子缺失片段-410- -1 bp 對于調控CaCP1在鹽脅迫下的表達具有較高的轉錄活性，CaCP1的過表達提高植株對鹽脅迫的敏感性，CaCP1在調節植物鹽脅迫應答方面起重要作用。