黃精組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

鄧少華，劉娟娟，陳丹鳳，崔 強(qiáng),2，肖穩(wěn)運(yùn)，張海霞,2

(1.郴州市林業(yè)科學(xué)研究所，湖南 郴州 423000；2.郴州市林下經(jīng)濟(jì)植物資源培育與利用技術(shù)研發(fā)中心，湖南 郴州 423000)

1 引言

黃精(Polygonatumcyrtonema) 又名“姜形黃精”，為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物。自然分布于河南、安徽、浙江、江西、湖南和貴州等省，多生長(zhǎng)于林下、灌叢或山坡陰處。黃精根莖既供藥用，又可食用，以其干燥根莖入藥[1～3]。現(xiàn)代研究表明，黃精富含多糖、皂苷、黃酮等化學(xué)成分[4～6]。黃精是傳統(tǒng)藥食兩用的補(bǔ)益類藥材，隨著市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，野生資源過度采挖，加之生態(tài)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致其野生資源日益枯竭，人工種植是解決其資源匱乏的重要途徑之一[7]，而當(dāng)前黃精繁殖方法主要有種子繁殖 (有性繁殖) 和根狀莖分株繁殖 (無性繁殖)，種子繁殖存在收集難度大、發(fā)芽率低、育苗周期長(zhǎng)和后代性狀分化嚴(yán)重等問題[8]；根狀莖繁殖存在繁殖率低和易積累病毒等缺點(diǎn)[9]，因此黃精的組培快繁研究極具意義，既豐富了繁殖方式，又滿足了種苗供應(yīng)。劉紅美等[10]與李鶯等[11]通過系統(tǒng)試驗(yàn), 初步建立了黃精組培快繁技術(shù)。目前有關(guān)黃精的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究主要集中在芽的分化誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)等方面，而組培苗移栽種植過程中的問題也逐漸暴露，如成活率不高、出苗時(shí)間長(zhǎng)等等。本試驗(yàn)以黃精帶芽根莖為材料, 優(yōu)化黃精組培快繁體系，以期為黃精工廠化育苗提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

采自湖南郴州境內(nèi)原生地野生的自然生長(zhǎng)發(fā)育的黃精根莖，將其用自封袋裝好于4℃保存?zhèn)溆茫脦а扛o為組織培養(yǎng)的試驗(yàn)材料。該種野生黃精花期開白色花。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 外植體的選擇與表面消毒條件的篩選

選取新鮮無病蟲害的完整植株，剝?nèi)ト~片，剪去下部須狀根，用自來水反復(fù)清洗根莖。用解剖刀切取帶芽根莖，用多菌靈水浸泡30 min 左右進(jìn)行表面清洗，再置于流水下沖洗2 h，將預(yù)處理過的帶芽根莖放在超凈工作臺(tái)上用 75% 酒精浸泡 20 s，用無菌水沖洗3～4 次，再用0.1% 的升汞HgCl2溶液分別消毒浸泡12、15、18 min，然后用無菌水沖洗5～6 次，濾去無菌水后用無菌濾紙吸干備用。再次剝?nèi)ネ獍娜~片，保留基部包含生長(zhǎng)點(diǎn)的幼芽，將里面的嫩芽接種到制備好的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每處理12瓶，重復(fù)3次，每瓶接1個(gè)芽，15 d后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)和生長(zhǎng)情況。

2.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，固定成分為蔗糖30 g，瓊脂粉4.7 g，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為室溫23～25℃ ，光照強(qiáng)度為2 000lx左右，光照12 h/d。

2.2.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，將外植體接種于不同激素配比的培養(yǎng)基 M1 ～ M3 上(表1) ，共3個(gè)處理，每處理30瓶，每瓶3個(gè)芽。30 d 后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表1 不同激素配比的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

2.2.4 增殖、生根培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基M4 ～M7上誘導(dǎo)增殖(表2)，共4個(gè)處理，每處理30瓶，每瓶接3個(gè)芽。30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖數(shù)及生長(zhǎng)狀況。

表2 不同激素配比的增殖生根培養(yǎng)基

2.2.5 煉苗與移栽

選取根數(shù)達(dá)3～4條，根長(zhǎng)大于1 cm且長(zhǎng)勢(shì)良好的黃精組培苗120株進(jìn)行煉苗。移栽前將組培苗在大棚室內(nèi)煉苗7 d，前4 d緊閉瓶蓋，后3 d逐漸松蓋，提高抗性和適應(yīng)性。將小苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，移栽到黃心土∶泥炭土=1∶1的基質(zhì)中，用0.1%的多菌靈溶液提前噴灑基質(zhì)進(jìn)行消毒，于溫室中培養(yǎng)，適度遮蔭，每隔2 d澆水一次，濕度保持在80%以上，待組培移栽苗新葉展開和新根長(zhǎng)出后，即可按常規(guī)管理。90 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各相關(guān)指標(biāo)按如下公式計(jì)算：

污染率 = 污染個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)；

萌發(fā)率 = 萌發(fā)個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)；

增殖系數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)；

生根率 = 生根苗數(shù)/接種苗數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

0.1%HgCl2溶液的消毒時(shí)間對(duì)黃精帶芽莖根的影響結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明：消毒時(shí)間短，萌發(fā)率高, 但污染較嚴(yán)重，外植體消毒時(shí)間長(zhǎng)，污染率雖較低，但外植體出現(xiàn)白化死亡苗的現(xiàn)象。因此，HgCl2對(duì)黃精外植體消毒時(shí)間在15 min較適宜。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15 d后，芽開始生長(zhǎng)，基部明顯膨大，27 d后開始分化出不定芽。

表3 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體誘導(dǎo)存活影響

3.2 不同激素配比對(duì)黃精組培苗生長(zhǎng)影響

通過不同成分配比培養(yǎng)基的試驗(yàn)比較，認(rèn)真觀察記錄各個(gè)階段黃精在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)表現(xiàn)狀況，根據(jù)黃精組培苗在各個(gè)階段不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)表現(xiàn)狀況，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析(表4)，表現(xiàn)好的用 “++++”表示，較好的用“+++”表示，一般的用 “++” 表示，相對(duì)較差的用 “+” 表示。

表4 黃精組培各階段不同培養(yǎng)基表現(xiàn)情況

結(jié)果表明：在相同培養(yǎng)條件下，黃精帶芽莖根誘導(dǎo)芽的成活率及長(zhǎng)勢(shì)對(duì)比可見M1>M2、M3，隨6-BA濃度升高處理M3芽誘導(dǎo)率和多芽率也逐漸提高，但隨著IBA濃度升高，且濃度為0.8 mg/L時(shí)會(huì)出現(xiàn)較多愈傷，不利于芽的誘導(dǎo)，說明在6-BA濃度1.0～2.0 mg/L和IBA濃度0.2～0.8 mg/L范圍內(nèi)，這2種外源激素共同作用下，濃度較低時(shí)更有利于芽的分化。

叢生芽在原瓶中能正常生長(zhǎng)，但長(zhǎng)勢(shì)慢，將原莖根誘導(dǎo)產(chǎn)生的約2 cm 高叢生芽分別接種至不同增殖培養(yǎng)基中繼代增殖，即可產(chǎn)生小苗。組培苗在不同處理培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)M7>M5>M4、M6，6-BA濃度3.0 mg/L和花寶1號(hào)濃度1 g/L時(shí)對(duì)叢生芽增殖影響最大，平均增值系數(shù)為8.5，分化芽直接成苗，苗長(zhǎng)勢(shì)良好、健壯，葉片呈深綠色，且在接種45 d后可誘導(dǎo)生根，誘導(dǎo)出來的根多且長(zhǎng)、較粗壯，植株生根率為100%，平均根數(shù)為16.8 ，平均根長(zhǎng)為10.82 cm；但處理M4和M6中能分化芽直接成苗，但其組培苗易白化且生長(zhǎng)緩慢，無根分化，此現(xiàn)象表明花寶1號(hào)對(duì)促進(jìn)增殖生長(zhǎng)的影響要強(qiáng)于NAA，由此可確定能夠有效誘導(dǎo)黃精增殖的激素組合是6-BA 、IBA 和花寶1號(hào)。組培苗移栽后成活率達(dá)到了90%以上(圖1)。

圖1 黃精莖芽組培各階段

4 結(jié)論與討論

(1)植物組培快繁技術(shù)能有效的解決藥用植物資源短缺的問題[12]。本研究以MS為基本培養(yǎng)基比較各階段不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果，與前人研究表明黃精屬植物誘芽、增殖適用于MS培養(yǎng)基一致，而以1/2MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)黃精屬組培苗生根與本研究結(jié)果不一致[13～17]。相較于周新華[9]建立的多花黃精組培生根技術(shù)，本研究選擇的最優(yōu)培養(yǎng)方法可將增殖和生根同時(shí)在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間縮短45 d，且生根率高、根數(shù)多且長(zhǎng)。

(2)不同的外源激素及不同的濃度對(duì)黃精組培各階段的影響都不同，且在培養(yǎng)基內(nèi)加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)添加物，能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、分化效應(yīng)[18,19]。本研究誘導(dǎo)叢生芽形成的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+ 0.2 mg/L NAA，最適合叢生芽增殖分化、生根的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+1.0 g/L花寶1號(hào)，生根率達(dá)100%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 6-BA 能顯著增加黃精叢生芽的分化率，與徐忠傳等[20]研究一致。李慧敏等[21]研究發(fā)現(xiàn)，添加花寶1號(hào)能促進(jìn)白芨假鱗莖的誘導(dǎo)，本研究中適當(dāng)添加花寶1號(hào)更有利于苗的生長(zhǎng)，這可能與花寶1號(hào)培養(yǎng)基中的氮、磷、鉀的配比更適合黃精叢生芽增殖和根的誘導(dǎo)。建議有條件時(shí)做更多的栽培基質(zhì)及其配比試驗(yàn)，并增加供試株數(shù)，以探索更多更好地適合湘南地區(qū)黃精生長(zhǎng)發(fā)育的栽培基質(zhì)，為黃精栽培提供更為準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。本研究建立的黃精組培快繁體系，為實(shí)現(xiàn)工廠化育苗提供了技術(shù)支持。