金匱腎氣丸改善去卵巢幼鼠學習記憶功能的研究

張歆竹，鄧湘玲，高子鈺，龐 礴，張知新

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 兒科，北京 100000；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100105；3.中日友好醫(yī)院 國際部，北京 100029）

卵巢為女性重要器官之一，具有內(nèi)分泌及生育功能，對經(jīng)、孕、產(chǎn)等女性生理現(xiàn)象起重要調(diào)節(jié)作用。若女童卵巢發(fā)育不良，激素水平紊亂，可能造成月經(jīng)稀少、閉經(jīng)、不孕等不良后果。亦可能出現(xiàn)特異性的神經(jīng)心理缺陷，如先天性卵巢發(fā)育不全患者可能存在視覺-空間組織缺陷、社會認知障礙、執(zhí)行功能障礙、運動缺陷等[1，2]，可能造成對生活質(zhì)量及社會功能的不良影響。腎藏精，其中先天之精稟受于父母，為生殖的基礎物質(zhì)，精生髓，髓上充于腦，《醫(yī)學心悟》曰：“腎主智，腎虛則智不足……”，可見腎與人體及腦的發(fā)育均有密切關(guān)系，腎精氣虧虛則可能對生殖及認知功能等造成不良影響。金匱腎氣丸最早出自《金匱要略》，有“補腎諸方之祖”之稱?，F(xiàn)將通過動物實驗進一步探索金匱腎氣丸對去卵巢幼鼠的學習記憶功能的影響，以期為卵巢發(fā)育不良女童臨床中藥治療提供基礎。

1 材料與儀器

1.1 動物

實驗動物選擇SPF 級健康21d 齡C57BL/6j 雌性小鼠20 只，體重15.76±1.25g，購自北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度保持20℃～25℃，相對濕度為60%，所有小鼠均在動物房中適應性喂養(yǎng)1 周。動物的操作參考《實驗動物管理條例》執(zhí)行，符合規(guī)定的倫理要求（編號：MDKN-2023-008）。

1.2 藥品與試劑

金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，批號：Z11020147）；補佳樂戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：J20171038）溶于300μl無水乙醇中，待完全溶解后加入1ml過濾除菌的花生油，置渦旋器上混勻15min，充分混勻后再加入花生油，使雌二醇最終濃度為0.32mg/ml；試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號分別為HY-C0001、HY-C0002、HY-C0007、HY-M0051）；異氟烷（河北金達福藥業(yè)有限公司，批號031217015）。

1.3 儀器

ZS/MV 麻醉機、Vcap2860 水迷宮（眾實科技），Nikon Eclipse CI 正置光學顯微鏡、Nikon DS-U3 成像系統(tǒng)（日本尼康）；JJ-12J 脫水機、JBP5包埋機、JB-L5凍臺（武漢俊杰電子有限公司），RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P 組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；華衛(wèi)德朗DR-200BS 酶標分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）；邁瑞B(yǎng)S-420 全自動生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

將20 只小鼠隨機分為5 組：對照組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組和西藥組，每組各4只。對照組為假手術(shù)組，其余均為卵巢切除手術(shù)組。所有小鼠均經(jīng)異氟烷氣麻，按照文獻方法[3]，摘除小鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)對照組僅切除卵巢周圍的團塊脂肪，大小與卵巢一致，其他步驟同去卵巢組。

2.2 干預方法

假手術(shù)對照組、模型組予蒸餾水灌胃，西藥組予雌二醇（40μg/kg）腹部皮下注射，1次/3d，給藥4周；中藥低劑量組予金匱腎氣丸2g/kg/d、中藥高劑量組予金匱腎氣丸4g/kg/d 灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)4周。

2.3 檢測指標

2.3.1 Morris水迷宮實驗

將水迷宮分為4 個象限，內(nèi)注入自來水，水高約20cm，于第二象限（目標象限）中心放置一個直徑為5cm 的圓形平臺，調(diào)節(jié)高度使其位于水平面下1～1.5cm，水溫保持在25±1.0℃。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺的時間和活動路徑。定位航行試驗共歷時5d，每日于固定時間段進行，分別從4 個象限的入水點將小鼠放入水中，保持入水時頭朝池壁，記錄小鼠自入水至找到平臺四肢爬上平臺所需的時間（逃避潛伏期）及入水后活動軌跡。空間探索試驗于定位航行試驗結(jié)束24h 后進行，撤除站臺，選擇站臺對稱象限將小鼠放入水中，記錄小鼠在90s 內(nèi)的活動路徑、在目標象限活動的距離和時間，并計算活動距離占總距離的百分比、活動時間占總時間的百分比。

2.3.2 海馬組織形態(tài)學病理觀察

固定后的腦組織先后行脫水、石蠟包埋、切片，烘干脫蠟后進行HE 染色、脫水、封片，于光鏡下觀察并拍攝。

2.3.3 性激素指標、海馬乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）測定

采用酶聯(lián)免疫競爭法，測定小鼠血清中雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）的含量。取材時根據(jù)海馬組織的重量，用預冷的生理鹽水按體重與體積1∶10的配比混合海馬組織與生理鹽水，在勻漿機下充分研磨后進行離心，提取上清液，用酶免疫法測定AchE含量。

2.4 統(tǒng)計學方法

應用STATA14.1軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)用±s表示，行多組比較，方差分析有統(tǒng)計學意義后再做組間兩兩比較，采用LSD Post Hoc Test 檢驗，雙側(cè)檢驗P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果

3.1.1 定位航行實驗結(jié)果

表1 示，各組小鼠訓練第1d 各指標均不存在統(tǒng)計學差異（P>0.05）。訓練第5d，各組上臺前路徑存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。與對照組比較，模型組、西藥組及中藥低劑量組的上臺前路程顯著延長（P<0.001，P<0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組的上臺前路程顯著縮短（P<0.05）。而與模型組比較，西藥組和中藥組的逃避潛伏期有縮短趨勢，其中中藥高劑量組縮短趨勢更明顯，但差異均無統(tǒng)計學意義。圖1（見封二）示小鼠運動軌跡，對照組、中藥組小鼠多以各象限中心區(qū)域為主要活動范圍，西藥組多活動于下水象限，且對照組、中藥高劑量組小鼠運動軌跡更平滑，模型組小鼠多于水迷宮邊緣活動且軌跡顯雜亂。

圖1 各組小鼠水迷宮實驗代表性運動軌跡圖

表1 各組小鼠定位航行實驗結(jié)果 （±s，n=4）

表1 各組小鼠定位航行實驗結(jié)果 （±s，n=4）

注：與對照組同期相比，* P<0.05，** P<0.001；與模型組同期相比，# P<0.05。

逃避潛伏期（s）第1d 73.08±33.84 90.00±0.00 60.48±30.88 66.96±27.45 74.13±31.74上臺前路程（m）第1d 15.04±0.72 15.86±1.28 15.11±2.72 15.46±1.79 15.93±1.84組別對照組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組西藥組第5d 21.87±16.65 65.30±28.63 54.23±41.44 36.41±26.28 53.98±43.27第5d 3.66±2.35 16.52±1.84**13.39±4.49*9.36±5.69#15.36±4.59*

3.1.2 空間探索實驗結(jié)果

表2 示，撤出隱匿平臺后，對照組、西藥組、中藥2 組的目標象限（原平臺所在象限）時間比及距離比均高于模型組，其中以西藥組、中藥高劑量組更明顯，但差異均不存在統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 各組小鼠空間探索實驗結(jié)果 （±s，%，n=4）

表2 各組小鼠空間探索實驗結(jié)果 （±s，%，n=4）

組別對照組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組西藥組目標象限時間比21.50±11.45 15.00±3.56 19.50±5.92 24.00±9.63 24.25±6.40目標象限距離比21.50±11.50 17.00±2.94 19.75±7.14 23.25±8.30 24.00±4.97

3.2 各組小鼠血清E2、FSH、LH及AchE比較

表3 示，對照組小鼠的E2 較其他組高，而模型組的E2值最低，且各組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。相反，模型組的FSH 和LH 均高于其他幾組（P<0.001）。對照組小鼠的AchE 比其他組高，模型組的AchE 值最低，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表3 各組小鼠E2、FSH、LH、AchE水平比較（±s，n=4）

表3 各組小鼠E2、FSH、LH、AchE水平比較（±s，n=4）

注：與對照組相比，* P<0.05，** P<0.001；與模型組相比，# P<0.05，## P<0.001。

E2（pg/ml）48.48±1.46 30.68±3.07**37.29±1.21##41.74±2.25##43.16±1.44##FSH（mIU/ml）3.97±0.11 8.56±0.96**5.65±0.46##6.99±0.21##7.23±0.33#LH（mIU/ml）12.76±1.22 19.49±2.06**13.95±0.65##16.04±0.59#16.43±1.16#AchE（U/L）76.58±3.56 28.85±4.22**54.17±1.14#65.77±7.50##67.51±4.51##組別對照組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組西藥組

3.3 海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變

HE 染色結(jié)果如圖2（見封二）所示。對照組、中藥高劑量組及西藥組的腦組織海馬體神經(jīng)細胞形態(tài)規(guī)則，細胞數(shù)量豐富，排列整齊密集，胞核大而圓，染色質(zhì)少，核仁明顯；中藥低劑量組可見一側(cè)海馬CA3區(qū)有極少量的神經(jīng)細胞胞核固縮深染（小膠質(zhì)細胞進入受損神經(jīng)細胞內(nèi)）、形狀欠規(guī)則，排列不整齊（圖2C黑色箭頭）；而模型組可見一側(cè)海馬CA3 區(qū)有較多的神經(jīng)細胞胞核固縮深染，細胞形狀不規(guī)則，排列顯紊亂（圖2B 黑色箭頭），未見明顯的膠質(zhì)細胞增生。

圖2 各組小鼠海馬組織CA3區(qū)（HE×200）

4 討論

腎藏真陰、寓元陽，為先天之本、生命之根，若腎氣虧虛，精血不足，天癸無以化生，沖任虧虛，遂發(fā)育遲緩。腎主骨、生髓，腦為髓海，《醫(yī)林改錯》曰：“小兒無記性者，腦髓未滿；高年無記性者，腦髓漸空”，若腎精不足，髓?？仗?，大腦失養(yǎng)，日久形成認知問題。正如先天性卵巢發(fā)育不全患者，先天稟賦不足，臨床多見身材矮小、發(fā)育遲緩，結(jié)合其情志心理因素，可見部分認知缺陷?？梢姡把a腎法”或可改善發(fā)育遲緩與認知受損。金匱腎氣丸作為補腎經(jīng)方，以六味地黃丸為基礎加減化裁而成?！夺t(yī)宗金鑒》云：“此腎氣丸納桂附于滋陰劑中十倍之一，意不在補火，而在微微生火，即生腎氣也。”除少量附子、桂枝溫腎助陽、引火歸原，該方以地黃、山茱萸、山藥滋補腎陰，佐以澤瀉、茯苓利水滲濕，丹皮涼血化瘀，諸藥合用，遂有陰陽雙補、徐生腎氣之功。腎氣充實，天癸化生，有利于推動女性生長發(fā)育。研究提示，金匱腎氣丸可提高垂體細胞增殖作用、調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸中鈣調(diào)蛋白基因表達，進而改善激素水平[4～6]。基于網(wǎng)絡藥理學等分析，該方中核心成分包括薯藏皂苷元、澤瀉醇B、羥基蕪花素、去氧穿心蓮內(nèi)酯、胡椒堿、榭皮素等，可作用于雌激素受體a、血管內(nèi)皮生長因子A、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶等核心蛋白靶點，通過調(diào)節(jié)激素合成與分泌、抗炎、抗氧化等作用治療早發(fā)性卵巢功能不全[7]。而雌激素可通過保護腦神經(jīng)元細胞、改善腦血流量、調(diào)節(jié)AchE 活性等機制改善神經(jīng)認知能力[8，9]。因此，“補腎法”或可通過激素調(diào)節(jié)等機制改善性腺功能低下個體的神經(jīng)認知發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸高劑量組的E2 水平較模型組高，F(xiàn)SH 和LH較模型組低，與雌激素治療組均無統(tǒng)計學差異。提示金匱腎氣丸可對各項性激素水平具有改善作用，而學習記憶功能的提升可能與雌激素的間接作用相關(guān)。

作為負責學習記憶功能的重要腦區(qū)，海馬對空間信息的獲取及記憶的鞏固和儲存起關(guān)鍵作用，其中CA3 區(qū)神經(jīng)元活動性在空間記憶的編碼及檢索過程中均升高[10]。成年哺乳動物海馬區(qū)均有不同程度的顆粒細胞前體增殖，海馬神經(jīng)干細胞分裂增殖越多，動物學習記憶能力越強[11，12]。研究提示金匱腎氣丸可改善學習記憶能力，其機制為防止海馬細胞氧化損傷、改善能量代謝等[13～15]。雷帆等人對金匱腎氣丸在小鼠腦海馬蛋白質(zhì)組學的表達進行了研究，提示金匱腎氣丸作用蛋白主要涉及膜轉(zhuǎn)運、突觸囊泡周期、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等，金匱腎氣丸可能對海馬區(qū)功能存在潛在影響[16]。而AchE 為生物神經(jīng)傳導過程中的關(guān)鍵酶，可調(diào)控乙酰膽堿的降解及合成，其纖維的分布以海馬內(nèi)最豐富，在大腦生理活動中起到重要作用[17]。阿爾茨海默癥患者皮質(zhì)與海馬體中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和AchE 均存在不同程度下降[18]，進而影響乙酰膽堿合成及神經(jīng)信號傳遞。既往研究提示，經(jīng)雌激素或溫腎助陽中藥干預的去卵巢幼鼠海馬AchE 水平升高[19]。本研究中，金匱腎氣丸高劑量組水迷宮實驗上臺前路徑較模型組改善明顯，與對照組未見統(tǒng)計學差異。而各治療組幼鼠海馬AchE 水平較模型組顯著提升，與假手術(shù)對照組無統(tǒng)計學差異，可能與幼鼠海馬體發(fā)育迅速，經(jīng)治療乙酰膽堿及其相關(guān)酶活性偏高相關(guān)。在海馬組織形態(tài)方面，去卵巢后幼鼠出現(xiàn)腦形態(tài)損傷，金匱腎氣丸高劑量組及雌激素組可見CA3區(qū)海馬體神經(jīng)細胞增殖。提示高劑量金匱腎氣丸可對學習記憶能力部分改善，可一定程度減輕腦結(jié)構(gòu)的損傷，其效果與雌激素相當。

綜上，金匱腎氣丸可一定程度改善去卵巢幼鼠學習記憶水平，或與性腺軸的調(diào)節(jié)、海馬形態(tài)及功能的改善相關(guān)。由于本研究樣本量小、研究指標有限，存在一定的局限性，其機制及遠期效果仍待進一步研究。