抗β2 糖蛋白1 抗體檢測結果差異化的研究進展

謝茜，趙鐵鎖（通信作者），丁亞輝，李忠信，王文強

1 新鄉醫學院 （河南 新鄉 453003）；2 鄭州安圖生物工程股份有限公司 （河南 鄭州450016）

抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）是一種以反復動靜脈血栓形成、病態妊娠（通常表現為多次不明原因流產或死胎）、血小板減少等為主要臨床表現的自身免疫性疾病。APS 的臨床表征可累及心臟、肺部、腎臟以及中樞神經系統等全身各個器官，屬于非器官特異的自身免疫性疾病，同時還伴有抗磷脂抗體（antiphospholipid-antibody，aPL）持續陽性[1]。抗β2糖蛋白1抗體（anti-beta2 glycoprotein 1，anti-β2-GP1）作為APS 分類的重要指標之一，自2006年的札幌會議后，其在APS 診斷中的作用逐漸被臨床重視起來[2]。隨著對APS 的研究越來越深入，臨床對anti-β2-GP1檢測方法、檢測樣本的采集、抗原的使用、質控品、標準曲線的建立、參考值的建立、結果的分析等提出了要求和建議[3]。本研究就anti-β2-GP1的檢測現狀進行綜述，并對檢測結果差異化的原因進行分析。

1 β2 糖蛋白1 作為aPL 靶抗原的發現

1986年Harris 等[4]統計了30個實驗室反饋的檢測抗心磷脂抗體（anti-cardiolipin，aCL）的室間質評結果后得出結論，所有的無效檢測方法均單獨使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）并添加牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）及明膠作為血清樣品及標記抗體的稀釋液；有效檢測方法則使用血清/血漿作為稀釋液；此外，不同來源的抗原對檢測結果并無顯著影響。另有一項研究發現，只有使用血清/血漿作為稀釋液才能使心磷脂（cardiolipin，cL）與aCL 結合，因此推測血清/血漿中含有一種輔助因子，并于1990年通過離子交換色譜分析法將該輔助因子分離純化[5]。研究證實，該輔助因子為β2糖蛋白1（beta2 glycoprotein 1，β2-GP1）[6]，此后β2-GP1作為aCL 的一種靶抗原開始被熟知。

2 β2-GP1 簡介

β2-GP1又被稱為載脂蛋白H（apolipoprotein H，APOH），在人類中由APOH 基因編碼，定位于染色體17q23-24。它是一種由肝細胞合成的糖蛋白，分子量為50 kD 左右，在血液循環中以游離形式存在，血漿含量約為150～300 μg/ml，進化高度保守，幾乎存在于所有哺乳動物中，且同源性高達74%～83%（人、犬、小鼠、大鼠、牛）。β2-GP1是由326個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，以脯氨酸（Pro）的含量最高，其次為半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）。其結構可分為5個結構域（Domain Ⅰ～Ⅴ），每個結構域為短的重復序列片段（short consensus repeat，SCR），符合補體調節蛋白（complement control protein，CCP）的結構模型，為保守的CCP 序列，由Cys-Pro 殘基進行連接，其Cys 殘基在Cys1-3和Cys2-4之間形成二硫鍵。Domain V 額外含有一個二硫鍵和C 端殘基，其帶正電荷氨基酸序列（Lys282-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287）為與陰離子磷脂進行結合的主要位點[7-12]。

3 β2-GP1 構象變化的研究進展

1994—1996年期間的多項研究發現，使用表面被強輻照過的96孔聚苯乙烯透明微孔板（ELISA微孔板），可使aCL 在沒有cL 存在的情況下識別β2-GP1，并認為cL 或者輻照過的微孔板可使β2-GP1的結構發生改變[13-15]。相關共識也指出，推薦使用負電荷（高結合力或經γ 射線照射后）微孔板檢 測anti-β2-GP1[3]。1998年，Koike 等[16]基 于 人類H 因子的結構，通過核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）建立了β2-GP1的同源模型，即由5個圓柱體的結構域構成的環狀結構。1999年，Schwarzenbacher 等[17]由晶體結構的分辨率推導出了β2-GP1的魚鉤狀構象。2002年，Hammel 等[18]通過小角X 線散射法（small-angle X-ray scattering，SAXS）提出了β2-GP1為S 型結構，且在Domain Ⅰ上存在碳水化合物側鏈，可能覆蓋表位甘氨酸40-精氨酸43（G40-R43）。2006年，De Laat 等[19]發現，將碳水化合物移除可提高β2-GP1與anti-β2-GP1的親合力，進一步證實了Hammel 等[18]的理論。該研究同時發現anti-β2-GP1可分為兩類：一類與血栓相關，在β2-GP1變構的情況下可識別Domain Ⅰ的G40-R43表位；另一類與血栓相關性不大，可結合β2-GP1的其他結構域，且不受構像的影響。

2010年，Agar等[20]使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）將β2-GP1放 大 了20萬 倍，通過肉眼觀察到了β2-GP1的構象，并發現通過調節pH 及鹽濃度可以使β2-GP1的構象發生改變，該變構為可逆過程。在正常人血漿中純化出來的β2-GP1為閉環狀態，在高鹽高pH（1.15 M NaCl，pH=11.5）的條件下，其由閉環狀態變為魚鉤狀構象；在低鹽低pH（150 mM NaCl，pH=3.4）條件下，其由魚鉤狀重新變回環狀構象[21]。Agar 等[20]還同時驗證了，APS 患者體內的抗體不能直接與環狀β2-GP1結合，但重組鼠單克隆抗Domain Ⅳ抗體可直接與環狀β2-GP1結合。

綜上所述，在生理狀態下，β2-GP1的Domain Ⅰ和Domain Ⅴ結合，呈閉環狀態；在病理狀態下，β2-GP1帶正電荷的Domain Ⅴ與cL 等帶負電荷的磷脂結合，呈打開狀態可識別aPL。在體外，高鹽高pH 條件下β2-GP1也可從閉環狀態到打開狀態，呈現魚鉤狀，可與aPL 進行結合；在低鹽低pH 條件下可重新恢復至閉環狀態，此時無法識別aPL。

4 anti-β2-GP1 檢測的研究進展

大量研究表明，anti-β2-GP1 具有很強的異質性，針對各個結構域均有相應的抗體，且分為IgG、IgM、IgA 等不同亞型[22]。目前，APS 的分類標準和國際共識僅將anti-β2-GP1 的IgG 和IgM 亞型被列入標準抗體檢測范圍[2-3]。但相關標準和共識并未對各個亞型的臨床意義得出一致性的結論。Li 等[23]研究認為，anti-β2-GP1 的IgG 亞型與血栓形成關聯性更強，而IgM亞型與不良妊娠相關。Swad ?ba等[24]的研究認為，在系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）繼發抗磷脂綜合征患者中，anti-β2-GP1 的IgM 亞型與血栓形成沒有關聯。Danowski 等[25]的研究認為，anti-β2-GP1 在臨床診斷SLE 患者靜脈和動脈血栓形成的高風險方面具有一定作用，IgG 亞型與靜脈血栓形成相關，IgM亞型與動脈血栓形成相關，IgA 亞型與APS 無關。Del Ross 等[26]首次報道了anti-β2-GP1 的IgM 亞型與視網膜血栓形成有一定關聯。Lee 等[27]的研究認為，anti-β2-GP1 的IgA 亞型與SLE 患者的動脈血栓形成更加相關。2021 年的一項中心實驗室研究認為，anti-β2-GP1 在SLE 患者中以IgA 亞型抗體為主[28]。此外，IgA 亞型anti-β2-GP1 還與中風、靜脈血栓形成、血小板減少、網狀青斑、癲癇和瓣膜性心臟病等相關[29-31]。這些研究的差異可能與β2-GP1 的抗原表位有關。

目前針對β2-GP1抗原表位的研究是通過重組各個結構域的突變體來進行的。多數研究人員認為，針對Domain Ⅰ的抗體的IgG 亞型與血栓形成更加相關，針對其他結構域的抗體與血栓形成不相關[19,32-33]，但也有研究認為，針對Domain Ⅳ的抗體也與血栓形成相關[34]。后續Iverson 等[35]的研究表明，在Domain Ⅳ上可能存在2個不連續的表位，有些抗體可結合單獨的Domain Ⅳ，而有些抗體必須在Domain Ⅴ存在的情況下才能結合Domain Ⅳ，且與動脈粥樣硬化綜合征相關，同時發現針對Domain Ⅰ的抗體也有IgA 亞型的存在。國內早期研究顯示，28例anti-β2-GP1陽性APS 患者中，有27例血清anti-Domain Ⅴ呈陽性，因此認為抗體主要結合位點在Domain Ⅴ上[36]。在特應性皮炎兒童的血清中檢測出的anti-β2-GP1的主要表位在Domain Ⅴ上的磷脂結合位點附近（以IgG1亞型為主），因此該類抗體無法結合β2-GP1和cL 復合物[35]。Blank 等[37]制備出不同序列的單克隆anti-β2-GP1，這些抗體可分別識別Domain Ⅱ、Ⅲ以及Ⅳ的相關肽段。Murthy 等[38]的研究顯示，198例anti-β2-GP1 IgA亞型陽性的SLE 患者中，單一IgA 亞型陽性有57例。針對Domain Ⅳ/Ⅴ的IgA 亞型在IgA 亞型中的占比為54%，其中77%的患者與APS 的臨床表現相關。Serrano等[39]的研究指出，在anti-β2-GP1 IgA 亞型單獨陽性的血栓性APS 患者中，抗體似乎優先與β2-GP1的Domain Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的3個位點結合，而非Domain Ⅰ或Ⅳ/Ⅴ。

從上述研究可以發現，雖然多組研究人員進行了長時間的努力，但仍未能將β2-GP1不同抗原表位的抗體與相應的臨床表征聯系起來。研究人員的結論相互矛盾，無法統一。其中最主要的原因可能是，抗原表位為線性和構象表位共存。從哺乳動物的β2-GP1晶體模型可以發現，5個結構域之間會出現一定的糖基化，而糖基化會遮擋β2-GP1的抗原表位。昆蟲來源的β2-GP1的分子量為43 kD，而人體內的β2-GP1分子量為50 kD 左右，這可能是因為糖基化程度不同，進而導致不同研究人員得出相互矛盾的結論[40]。還有研究指出，體外實驗使用的抗原片段為線性表位，而這些異質性的抗體對抗原表位的識別也會受到空間構象的影響[39-41]，不同的構像會暴露或隱藏一些潛在的抗原表位，也會導致無法得出一致的結論。

總之，β2-GP1共有5個結構域，體外實驗證明每個結構域均存在能與相應抗體結合的表位，同時anti-β2-GP1還分為IgG、IgM、IgA 3種抗體亞型，極大地增強了anti-β2-GP1的異質性。此外anti-β2-GP1與β2-GP1的結合還依賴于β2-GP1的構像改變。正常人體內的β2-GP1呈環狀結構，其Domain Ⅴ與Domain Ⅰ相連，且各個結構域之間有一定的糖基化，遮擋了抗原表位。病理狀態下，Domain Ⅴ插入陰性磷脂表面，結構發生改變，表位暴露，可識別aPL。在體外極端環境下（如高鹽高pH 等），β2-GP1也可以發生變構，然而β2-GP1的變構過程具有一定的不確定性。目前通過電子顯微鏡肉眼可觀察到的為環狀閉合狀態（O 型）和打開狀態（J 型），此外還有S 型結構。近期有人提出了和J 型對稱的L 型結構，J 型和L 型暴露的表位不同[39]。

5 anti-β2-GP1 的檢測差異化原因分析

目前，anti-β2-GP1的檢測方法主要包括酶聯免疫吸附法（enzyme-linked Immunosorbent assay，ELISA）、磁微粒化學發光法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）、熒光酶免疫法（fluorescent immunoassay，FEIA）和多重微珠免疫法等。這些方法的檢測原理均為間接法檢測抗體，即固相化的β2-GP1抗原結合樣本中的anti-β2-GP1再連接標記的動物源抗人IgG/IgM/IgA 抗體（標記二抗）。anti-β2-GP1的檢測主要受以下因素影響：抗原的來源、二抗的來源及固相化、標記化相關的方法及條件等。

抗原的來源主要包括種屬（如人源、牛源）、制備方法（天然提純、重組抗原）等。雖然β2-GP1的同源性很強，但顯然使用人源抗原檢測人體內自身抗體的特異度和靈敏度會更優。Cavazzana 等[42]研究了抗原的純化方式，使用4種不同來源的人血漿和4種不同純化方式得到的抗原，盡管純度不同，但檢測結果無顯著差異。有研究還對ELISA 實驗的5個組分（包被緩沖液、微孔板標記液、封閉緩沖液、稀釋緩沖液和酶標二抗）進行了差異化研究，發現中性和堿性包被緩沖液的檢測結果之間存在差異[43]。這些結論也證實了pH 會影響β2-GP1的變構，導致結果偏差。不同品牌的微孔板之間、不同稀釋緩沖液之間存在差異，這些差異的本質也是在不同環境下導致了β2-GP1的結構差異。此外酶標二抗也存在差異：如抗人IgG 按亞型可分為抗IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，按結構可分為抗重鏈（H），輕鏈（L）以及抗恒定區（Fc）和可變區（Fab）抗體，IgG、IgM、IgA 均有保守的輕鏈結構域，抗輕鏈抗體還會出現交叉反應。因此不同的二抗選擇對靈敏度及特異度均會產生影響。想要明確anti-β2-GP1檢測的真正臨床意義，必須以檢測結果的準確性為前提，即特異性地檢測到靶物質（正確性），且檢測結果可重現（可重復性）。最初檢測anti-β2-GP1的方法以ELISA 為主，但其易受人工因素影響，其定量結果在室內和室間的可重復性極差，檢測結果的變異度可高達90%[44]；而全自動檢測方法（如CLIA）可大大提升定量結果的可重復性。在檢測正確性方面，不同廠家試劑盒的制備工藝和方法學差異較大，尤其是β2-GP1抗原的處理會影響其空間構象及位點的暴露，進而影響與抗體的結合，造成結果的差異化。因此，檢測結果的正確性需要依靠針對β2-GP1各個位點的參考品或標準物質。