兩種常見大鼠心肌缺血再灌注損傷模型造模方法比較

胡建春

(貴州工業職業技術學院，貴陽 551400)

心肌缺血再灌注損傷模型(MIRI)是在動物體內阻斷左冠狀動脈前降支(LAD)造成的急性心肌缺血，并在預定時間內恢復血供予以再灌注，是模擬人類缺血性心臟病恢復供血治療必需的實驗方法。由于大鼠在進化關系上比較接近人類，冠狀動脈側支循環少，心肌壞死出現早，心律失常發生率高，穩定性好且制作模型費用低，成為了制作心肌缺血再灌注損傷模型的首選。

結扎大鼠LAD形成心肌梗死是目前國內外公認的模型制備方法[1]。通用的造模方法為常規開胸法和快速手術法，但MIRI模型制備過程中存在諸多難點，如常規手術需要斷肋骨，造成實驗動物嚴重創傷，術后預后不良，死亡率升高。手術時反復多次將心臟牽拉到胸腔外，造成動物死亡率增加。術后胸腔空氣未排盡，引發氣胸，導致死亡率升高，再灌注時結扎線不易解開(剪斷)，輕者再灌注失敗，重則可能導致左心耳破裂，造成大出血，動物死亡。文獻[2-4]報道了冠狀動脈的定位部位不一，造成模型缺血損傷部位及損傷程度不一致等。

通過對常規開胸手術和快速手術兩種造模方式作橫向對比，對模型成功率、死亡率、手術時間等進行統計分析，為科研提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

實驗動物：健康SD大鼠，雄性，250±20 g，購買自重慶騰鑫生物技術有限公司，動物許可證號SCXK(渝)2012-0008。

主要儀器與試劑：BL-420生物機能實驗系統，水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司生產，批號20191011)，TTC(SIGMA，批號BCBP3272V)，DW-20002小動物呼吸機(上海嘉鵬科技有限公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與模型建立

20只SD大鼠隨機分為快速操作組和常規開胸手術組，每組10只。由專人飼養管理，以標準飼料喂養并每日更換新鮮純凈水。動物室光照充足，通風良好，室溫18℃～25℃，相對濕度50%～70%，動物飼養室定期消毒。

常規開胸手術組[2-4]：健康大鼠0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術臺上，連接生物機能實驗系統，二導聯下實時測心電圖。經口插氣管，連接呼吸機，設置潮氣量12，呼吸比1∶2，呼吸頻率90次/分。從胸中線到左腋下斜開口(5～6 cm)，分離皮膚和肌肉，見肋骨。在左側3～4肋間用手術刀輕輕劃開肌肉，再用止血鉗分開肋間隙，使用擴胸器擴開胸腔。用鑷子撕開心包膜，暴露心臟。采用6-0縫合線，在心臟中下部穿線用于牽引固定心臟位置，左手輕輕牽拉牽引線，固定心臟位置，右手從左心耳下沿稍靠右的位置進針，結扎LAD。觀察心電圖ST段是否抬高，若抬高，則結扎成功。 將牽引線拔出，撤出擴胸器，閉合胸腔，縫合肋骨，用手擠壓大鼠胸腔排除腔內空氣，縫合肌肉和皮膚。結扎LAD時，將結扎線打活節，一段露在皮膚表面。60 min后，輕拉線頭，將活結打開，減掉外露線頭，實現再灌注。

快速操作組[5-6]：健康SD大鼠按0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術臺上，連接生物機能實驗系統，二導聯下實時測心電圖。左胸部備毛，消毒，于胸骨左緣心臟搏動處縱行切開皮膚約2 cm，用止血鉗逐層分離皮下組織、肌肉，再用拉鉤拉開剝離開的肌肉，暴露手術視野。在心臟搏動明顯的3～4肋間打開胸腔，左手從右前區沿心臟跳動方向擠壓，同時右手用止血鉗深入胸腔引導，使心臟彈出胸腔，左手拇指、食指和中指輕捏住心臟，在左心耳下方以心臟表面左冠狀靜脈主干為標志，用6-0無創縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針，作一活結以結扎左冠脈前降支，迅速將心臟塞回胸腔，用力擠壓胸腔排空腔內空氣，觀察心電圖，Ⅱ導聯下ST段抬高，表明缺血成功，縫合皮膚。60 min后松結扎線，心電圖ST段下降表明心肌組織恢復再灌注。

1.2.2 觀測指標

造模存活率。以手術成功且再灌注24 h仍存活的大鼠計算兩組的造模存活率。

ST段抬高幅度。通過觀察二導聯下大鼠心電圖ST段的變化，確認大鼠是否存在心肌缺血現象，以ST段抬高幅度作為判定指標之一。

心臟TTC染色結果[7-8]。手術再灌注24h后，股動脈采血，立即取心臟，經0.9%氯化鈉溶液清洗干凈，于-20℃冷凍20 min，取出切片，置于1%TTC PBS溶液中，37℃水浴避光染色10 min，可見缺血灶呈蒼白色，正常組織為紅色肌肉組織，取出置4%多聚甲醛中固定24 h，以梗死區域重量除以心肌組織總重，計算梗死率。

心臟HE染色結果[8-9]。手術結束，再灌注24 h后，股動脈采血，立即取心臟，冷凍后進行HE染色。

2 結果

A.造模存活率。常規開胸組10只大鼠中，造模成功9只，存活的共5只，造模存活率50%；快速操作手術組10只大鼠中，存活8只，造模成功7只，造模存活率70%。

B.大鼠心電圖變化。通過二導聯監測，兩種方法造模成功的大鼠心電圖均呈現ST段抬高的現象。

圖1 MIRI大鼠心電圖變化(A：心肌缺血，ST段抬高；B：正常心電圖)Fig.1 MIRI rats ECG changes(A: myocardial ischemia, ST segment elevation; B: normal ECG)

對比兩種造模方法ST段抬高幅度，常規開胸組ST段平均抬高0.158 mV，快速操作手術組ST段平均抬高0.154 mV，無明顯差異，具體數據見表1。

表1 兩種造模方法下大鼠ST段變化統計表Tab.1 Statistics of ST segment changes in rats under two modeling methods

C.TTC染色結果[10]。TTC染色時，梗死區域心肌組織呈蒼白色，正常心肌組織呈紅色，具體見圖2。以梗死區域心肌組織重量/心肌總重量計算梗死率，兩組大鼠梗死率見表2。經統計，常規操作組平均心肌梗死率為36.84%，快速操作組為37.49%。結果中個別大鼠心肌梗死率相較更高，可能是由于結扎手法、位點不統一，引發心臟缺血位置不一致導致的。

D.HE染色結果。 HE染色可見正常心肌細胞形態規則、排列整齊。病變區肌纖維排列紊亂，部分區域性變性壞死，部分核固縮，心肌間質可見灶性水腫及炎癥細胞浸潤。

圖2 MIRI大鼠心臟TTC染色結果(左為常規手術法，右為快速操作法)Fig.2 Results of MIRI rats heart TTC staining(the left is the conventional operation, and the right is the rapid operation)

表2 兩種造模方法下大鼠心肌梗死率統計表Tab.2 Statistics of myocardial infarction rate in rats under two modeling methods

圖3 MIRI大鼠心臟HE染色結果(左為正常心肌組織，右為病變區域)Fig.3 Results of MIRI rats heart HE staining(the left is normal cardiac muscle tissue, and the right is lesion region)

3 討論

兩種手術操作比較：常規手術組直接在胸腔結扎LAD，不牽拉心臟，不變動心臟位置，利于準確結扎LAD位點。但其操作時間長(約15～20 min)，必須氣管插管或經口插管，采用呼吸機輔助手術，才能保證存活率。手術過程步驟多，較復雜。快速手術組需要將心臟牽拉出胸腔，快速結扎后將心臟返回胸腔，整個過程在1～2 min完成，難以保證結扎位置的重復性和準確性，對實驗人員熟練度要求更高。快速操作法由于手術時間短，熟練操作后可不需要呼吸機輔助手術操作，快速結扎后擠壓胸腔排氣、縫合皮膚即可獲得較好的手術效果。

大鼠術后恢復：常規手術組胸部開口較大，肌肉和肋骨是經銳器(刀片)分離，不能自主閉合，必須縫合。快速手術組開口小，肌肉經鈍器分離，無需縫合即可閉合。二者相比，快速手術組更利于動物術后傷口愈合和恢復。

對后續研究的影響：常規手術組縫合時會使用頭孢類等消炎藥抗感染，確保動物存活率，可能會因為藥物相互作用而影響后續的實驗結果。快速手術組鈍性分離肌肉，無需使用消炎藥即可獲得較高的存活率，且對后續實驗影響較小。

通過同步實驗，對常規開胸手術和快速操作手術兩種造模方法成功的大鼠進行造模存活率、心機梗死率、心電圖ST段變化等指標的比較，發現二者在存活率、梗死率及心電圖變化上無顯著差別，但快速操作組在手術時間、造模存活率、對后續實驗的影響等方面顯著優于常規操作組，因此經過反復練習、熟練手術操作的情況下，選擇快速操作法，可快捷、有效地完成MIRI模型的制備。