一例馬凡綜合征家系患者的臨床表現及遺傳學分析

孔志華，郭俊，王月麗，李小燕，張曉萍，陳麗

馬凡綜合征由法國醫師Antonie Marfan 于1896年首次報道，是一種常染色體顯性遺傳病；無種族特異性[1]。其可累及心血管、眼部及骨骼等多個系統。主要臨床表現為蜘蛛指/趾、脊柱側彎、主動脈病變、瓣膜病變、晶狀體脫位等[2]。人原纖維蛋白1基因（FBN1）是目前已經明確的馬凡綜合征的致病基因，包含66 個外顯子，位于染色體15q21.1 區，編碼原纖維蛋白-1[3]。原纖維蛋白-1 通過參與形成微纖維，在維持細胞外基質穩定性中起著重要作用[4]。目 前 為 止，ClinVar（https://www.clinicalgenome.org/data-sharing/clinvar/）數據庫中包含超過2 000 種馬凡綜合征相關的FBN1突變，研究表明FBN1突變無明顯熱點突變[5-6]。近期研究顯示，患者攜帶的突變類型與臨床表型有一定關聯，通過分析馬凡綜合征患者的FBN1基因突變，有助于輔助臨床診斷及治療決策；《遺傳性胸主動脈瘤/夾層基因檢測及臨床診療專家共識》闡述了基因檢測在遺傳性胸主動脈病診斷及篩查中的作用，并明確針對各種類型胸主動脈病患者提出醫療和生活方式管理方面的建議，從而實現對高危人群的早診斷及早預防[7]。本研究通過對1 例臨床表現為主動脈夾層的馬凡綜合征患者進行全外顯子測序，經過生物信息學分析，鑒定出一疑似致病突變，并在家系內對該位點進行驗證，探討了該馬凡綜合征家系的致病基因及致病突變，并為該家系相關成員的臨床診斷及進一步診療提供了理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019 年6 月因主動脈夾層于首都醫科大學附屬北京安貞醫院心外科就診的1 例26 歲女性馬凡綜合征患者（先證者）及其家屬為研究對象，患者家系圖見圖1。經影像學檢查（超聲心動圖、主動脈CT 血管造影、正位X 線胸片及彩色多普勒血管超聲）及相關輔助檢查，并依據2017 年中國醫師協會心血管外科分會發布的主動脈夾層診斷與治療規范中國專家共識[8]和歐洲心臟病學會發布的2014 年主動脈疾病診療指南診斷標準[9]，該患者臨床診斷為馬凡綜合征。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，通過了首都醫科大學附屬北京安貞醫院倫理委員會批準（批準函編號：2016017），患者及家系成員均簽署了知情同意書。

圖1 患者家系圖

1.2 方法

1.2.1基因組DNA 提取

采集先證者及所有入組家系成員外周血各2 ml[乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝]；每個樣本取200 μl 血樣使用全血DNA 提取試劑盒（康為世紀，江蘇泰州）提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳對DNA 提取質量進行檢測。

1.2.2全外顯子測序

基因組DNA 經過質控后，取1 μg 用于文庫構建；文庫構建使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB 公司，美國），外顯子區域富集使用Agilent SureSelect Human All Exon V6 試劑盒（安捷倫公司，美國），文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0 進行初步定量，使用實時熒光定量PCR 方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。使用Novaseq 進行高通量測序，將通過質控的測序數據比對至人類參考基因組（GRCh37/hg19），平均測序深度大于200 Ⅹ，檢測樣本的變異信息。利用ANNOVAR 對變異信息進行注釋，包括在dbSNP 數據庫、千人基因組、本團隊內部數據庫等數據庫的頻率信息，同時對變異的位置信息、類型、保守性等進行預測。

1.2.3Sanger 測序驗證

利用ABI 3730xl 測序儀（Applied Biosystems 公司，美國）對高通量測序得到的候選位點進行檢測。PCR擴增使用引物如下：正向：GGGCAATGGTCAATTCTA，反向：GTGTCTATTTCTGATGGCTTAT，測序使用正向引物。

1.2.4功能預測及變異的臨床注釋

使用ANNOVAR 軟件包Mutation taster（http://www.mutationtaster.org/）、phyloP46way_placenta、Swiss-model（https://swissmodel.expasy.org）等對變異位點進行功能及保守性分析；根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）遺傳變異分類標準與指南及中國2017 版《遺傳變異分類標準與指南》對基因變異進行分類[10]。

2 結果

2.1 臨床特點

先證者（Ⅲ-2）為26 歲女性，主訴“體檢發現降主動脈夾層2 個月”，無明顯胸、背及腹部疼痛，于當地醫院診斷為主動脈夾層。入院查體：脈搏70 次/min，血壓125/85 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），呼吸15 次/min，體溫37 ℃，身高170 cm，體重53 kg，身材瘦長、蜘蛛指、漏斗胸、關節活動度大、高度近視并伴有皮紋等馬凡綜合征相關體征與癥狀[1]。其母親（Ⅱ-2）及姨媽（Ⅱ-1）因急性主動脈夾層去世，姨媽（Ⅱ-3）因主動脈夾層（A 型）/動脈瘤行主動脈置換術；姐姐（Ⅲ-1）及表弟（Ⅲ-4）超聲心動圖結果提示主動脈根部增寬；其余家族成員超聲心動圖未見明顯異常。

先證者超聲心動圖提示主動脈竇部增寬39 mm，三尖瓣少量反流，各心腔內徑處于正常范圍，各室壁厚度及運動正常（圖2）。主動脈CT 血管造影提示主動脈夾層，累及右側腎動脈及髂總動脈（圖3、4）。診斷為主動脈夾層形成、胸主動脈瘤。

圖2 先證者超聲心動圖結果

圖3 先證者主動脈CT 成像圖

圖4 先證者主動脈CT 二維成像圖

患者后期接受全胸、腹主動脈置換術，預后較好。

2.2 全外顯子測序結果

先證者全外顯子測序共得到13.83 GB 有效測序數據，與參考基因組比對后得到14 909 個插入/缺失多態性，126 539 個單核苷酸多態性；依據《遺傳性胸主動脈瘤/夾層基因檢測及臨床診療專家共識》建議，篩選與綜合征型胸主動脈瘤/夾層相關的FBN1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD3、TGFB2、TGFB3、SMAD2共7 個基因的變異位點[7]，檢測到FBN1基因一雜合變異：FBN1，NM_000138.5：c.7412delC，位于基因第60 號外顯子上，為移碼突變（圖5）。其余6 個主動脈疾病相關基因未檢出變異位點。

圖5 變異位點c.7412delC 在FBN1 基因上位置示意圖

2.3 Sanger 測序結果

先證者的姨媽（Ⅱ-3）、姐姐（Ⅲ-1）、表弟（Ⅲ-4）均檢測出與先證者（Ⅲ-2）相同的移碼突變（FBN1，c.7412delC），而該家系中無臨床表型的健康者，包括先證者姨媽（Ⅱ-4）、弟弟（Ⅲ-3）、兩位表弟（Ⅲ-5、Ⅲ-7）、表妹（Ⅲ-6）及先證者之子（Ⅳ-2）及其姐姐之女（Ⅳ-1）均未攜帶該變異位點（圖6）。

圖6 Sanger 測序結果

2.4 變異位點功能預測及臨床注釋結果

該位點在dbSNP、ExAC、ESP6500 等數據庫中均未見頻率報道，在正常人群中發生的概率極低，提示該變異不是常見良性變異。生物信息學軟件預測結果顯示，該位點為第60 號外顯子區域單個堿基的缺失，該變異導致第2 471 位以后的氨基酸發生了移碼變異，造成翻譯的提前終止，組成蛋白質的氨基酸為2 681 個（野生型的蛋白質由2 871 個氨基酸組成），進而影響蛋白質的功能；多序列比對結果顯示，FBN1 蛋白第2 471 位點脯氨酸在人、黑猩猩、恒河猴、鼠中高度保守，提示該變異可能具有致病性；在該家系中，該位點與臨床表型共分離。在ClinVar 數據庫中，有一例來源于馬凡綜合征患者的該位點的報道，對該位點的注釋為致病變異。依據ACMG 指南，該位點為致病變異[致病變異分類非常強（PVS1）+中等證據2（PM2）+輔助證據1（PP1）]。

3 討論

馬凡綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，FBN1基因是唯一的致病基因[11]。馬凡綜合征的診斷標準一直在演進，1988 年柏林方案主要根據臨床表現，到1996 年Ghent 方案，直至最新的2010 年修訂版Ghent 方案，FBN1基因突變在疾病的診斷中越來越重要。修訂版Ghent 方案提出，無家族史患者若主動脈根部直徑Z 值≥2，并且合并晶狀體脫位及FBN1基因突變，系統評分＞7 等三項中的一項；或晶狀體脫位合并FBN1基因突變并主動脈病變，即可臨床診斷為馬凡綜合征[12]。本研究先證者體征包括身高過高、蜘蛛指、漏斗胸及關節活動過度；超聲心動圖提示主動脈根部增寬，A 型主動脈夾層，具有多項馬凡綜合征的臨床表現，臨床診斷為馬凡綜合征患者，家族中多位成員有胸主動脈夾層史并伴有馬凡綜合征體征，遂利用基因檢測技術探索該家系的致病原因。

FBN1基因位于15q21.1，包含66 個外顯子，編碼2 871 個氨基酸。目前已經報道的與馬凡綜合征患者相關的FBN1突變已超過2 000 種[6]。FBN1基因無明顯熱點突變，據報道約12%的突變位點重復出現；編碼區突變約占總突變的80%，非編碼區突變約占總突變的20%。常見編碼區突變有移碼突變、錯義突變和無義突變，移碼突變占FBN1突變的18%左右[5]。近年來有多項研究在逐步勾勒馬凡綜合征基因型與表型的關系。Faivre 等[13]發現半胱氨酸錯義突變與晶狀體異位有關；Aoyama 等[11]在1995 年的一項研究中已經證明，導致原纖維蛋白-1蛋白單倍劑量不足的突變（HI-FBN1）與無事件生存期縮短和更嚴重的心血管并發癥有關。此外，發生心血管事件的馬凡綜合征患者攜帶HI-FBN1突變頻率更高[14]。Franken 等[15]證實，相比于DNFBN1（顯性負效應）的患者，攜帶HI-FBN1突變的患者主動脈夾層和死亡的風險更高。2019 年，貢鳴等[16]對300 例中國馬凡綜合征患者的基因型與表型進行關聯研究，發現主動脈夾層患者相較于主動脈根部瘤患者，攜帶移碼突變頻率更高（17% vs.4%，P=0.017）。隨著越來越多基因型與臨床表型之間的關系被揭示，利用基因檢測技術在高危人群癥狀完全表現之前進行早期篩查，有助于疾病的早期診斷，對治療方案制定有指導作用。

本研究通過對疑似馬凡綜合征的家系行基因檢測，發現先證者及家系內存在相似臨床表現者FBN1基因均存在相同移碼突變（c.7412delC），該移碼突變可能會造成編碼蛋白的結構及功能改變，從而導致疾病發生。通過檢索公共數據庫，發現ClinVar 數據庫中存在該變異位點的報道；dbSNP、ExAC、ESP6500、GnomAD 以及本團隊內部數據庫（800 例孤立性主動脈瘤患者全外顯子測序數據庫）均無該變異位點的頻率報道；同時該變異存在家系共分離特點。依據ACMG 指南，該變異分級為致病變異。因此，根據該家系的臨床表現及FBN1變異特點，并依據2010 年的新Ghent 診斷標準，先證者及其家系內攜帶該變異的成員均可確診為馬凡綜合征；既往文獻報道，攜帶移碼變異的患者，更容易發生主動脈夾層，該先證者及家系內多位成年患者均發生主動脈夾層，提示該家系主動脈夾層高發，與以往研究報道一致。依據本研究的分子檢測結果及相關家族史，可幫助臨床醫師對家系相關成員尤其是未成年患者進行隨訪，并合理選擇治療時機和方法。對攜帶變異的家系成員血壓、血脂、血糖等心血管疾病危險因素的管理，有助于延緩急性事件的發生并改善預后[17]。樣本的組織學檢測對于疾病的病理特征分析有重要意義，本研究未獲得相應的組織學樣本并進行相關檢測，有所缺陷，后續相關研究應重視組織學樣本的收集。

本研究為該馬凡綜合征家系提供了分子診斷，為臨床診斷和后續治療選擇提供了遺傳學依據，進一步豐富了中國人群的馬凡綜合征遺傳圖譜。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突