不同濃度羅英化濁解毒方對胃癌大鼠病理改變、細胞凋亡及RegⅠ蛋白的影響

陳貴婧 張紈 孫建慧 王彩云 張亞麗 沙丹丹 董興娟

(河北省中醫院，河北 石家莊 050000)

胃癌由多種因素導致，最初癌細胞來源于胃黏膜上皮病變，常見的類型為腺癌。常見的誘發因素為癌前病變、環境、飲食等，早期胃癌患者無特異性癥狀，致使疾病的產生綠增加〔1〕。相關報道顯示，飲食不規律所引起的胃癌發病率逐年增加，確診時多為晚期，治療困難，因此，對于胃癌的治療至關重要。該病常見的治療胃手術治療，但手術易產生并發癥等，不利于患者的預后。根據近年來的研究發現中醫在治療胃癌方面效果顯著，中醫認為胃癌的病因在于濕濁和熱毒,羅英化濁解毒方是化解濁毒的一味中藥,已有研究表明其對胃癌前病變患者體內的濁毒具有一定的治療作用，但其對于治療胃癌的相關文獻較少，作用尚未完全掌握〔2〕。胃癌細胞的異常增加及向遠處轉移等可加快胃癌的發展。RegⅠ是Reg再生基因家族的一員，相關研究證實，RegⅠ在胃癌中水平較高,RegⅠ蛋白可作為促生長和抑凋亡因子，目前，已有相關學者證實其可抑制胃癌細胞的凋亡〔3〕。本研究不同濃度羅英化濁解毒方對胃癌大鼠病理改變、細胞凋亡及RegⅠ蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 選取健康ACL雄性大鼠80只，2～4月齡，體重210～225 g，平均(213.25±12.37)g，購自億鳴復興(北京)公司，7 d后開始實驗，大鼠常規飼養，室溫維持在23.3～27.2℃，相對濕度在51%～62%，保持0.5 d光照，正常飲食飲水。

1.2實驗藥物 羅英化濁解毒方用水浸泡0.5 h，煎煮3次后取汁(200 ml)，離心，取上清，濃縮至1.5 kg/L，殺菌備用。詳細藥材及劑量：莪術4 g，茵陳6 g，郁金9 g，砂仁10 g，冬凌草、石菖蒲、元胡、葉下珠、羅勒、紅景天各12 g，白英、蒲公英、藤梨根、八月札、隔山消各15 g。

1.3實驗試劑 胃癌SGC-7901細胞株(上海和元公司)、羅英化濁解毒方中中草藥材(亳州恒義公司)、阿糖胞苷(北京華邁科公司)、戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆公司)、TUNEL(邢臺潤聯公司)、酶標儀(山東恒美公司)、RegⅠ、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗(廣州瑞博奧公司)、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗(河北翰林公司)。

1.4模型建立 取64只大鼠于腹部注射阿糖胞苷(200 mg/kg)，2 d后全身照射 60℃至吸收10 Gy。照射后2 d，胰酶消化胃癌細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸(1×1010/L)，將細胞懸液(0.8 ml)注射大鼠右腋皮下位置。1 w后，腋下長出1 cm腫塊，建模成功64只。

1.5分組及給藥 剩余16只大鼠為正常組，無處理。建立模型的64只大鼠分為模型組16只無任何處理，低劑量組16只給予20 mg/kg羅英化濁解毒煎劑灌胃，1次/d，高劑量組16只給予40 mg/kg羅英化濁解毒煎劑灌胃1次/d，對照組(藥物對照組)給予225 mg/kg希羅達灌胃，2次/d，共12 w。

1.6檢測指標

1.6.1蘇木素-伊紅(HE)染色光鏡觀察法檢測各組大鼠胃黏膜組織形態 取各組大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后處死，取胃黏膜組織，置于4%甲醛緩沖液中固定，石蠟切片，脫蠟，乙醇水合處理，洗滌后進行染色，光鏡下觀察。

1.6.2TUNEL檢測各組大鼠胃黏膜組織中細胞凋亡 取大鼠胃黏膜組織，滴加蛋白酶 K工作液常溫反應 20 min，PBS 清洗，加入50 μl TUNEL工作液，常溫無光孵育60 min，清洗，加 50 μl convertr-POD，上述條件孵育。PBS洗滌，4次，5 min/次，加圖 DAB液顯色10 min后，沖洗，蘇木素復染，脫水透明，封片。隨機取5個視野，計算凋亡率。

1.6.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中胃動素、胃泌素水平 取各組大鼠頸部動脈血2 ml，離心5 min，1 250 r/min，取上清，采用ELISA檢測各組大鼠血清中胃動素、胃泌素水平。

1.6.4RT-PCR檢測胃黏膜組織中血管內皮生長因子(VEGF)、自噬蛋白(Beclin1)水平 取各組大鼠胃黏膜組織，裂解液裂解，0.25%胰蛋白酶消化，提高組織RNA進行反轉錄得到總cDNA，分離后采用Trizol法提取總RNA，無核酸酶溶解。進行逆轉錄后將cDNA進行熒光反應實驗。內參為β-actin，反應條件：5 min 94℃,變性30 s 94℃；55 s 64℃；50 s 72℃。共40個循環。計算方法用2-△△Ct法進行分析。引物序列：VEGF：上游引物：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′；下游：5′-TCACGCCACAGTTTCCCG-3′；Beclin1上游引物：5′-AATGAATGAGGGCGACAG-3′，下游：5′-TCAGGGACTCCAGATACGA-3′；β-actin上游引物：5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游5′-CAGGATTCCATACCCAAG-3′。

1.6.5Western印跡檢測胃黏膜組織中RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白表達 取各組大鼠胃黏膜組織，600 μl裂解液裂解并提取蛋白,測量蛋白濃度,分裝,-20℃保存。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按4∶1比例混均,將蛋白溶液煮沸，變性。將電泳后的50 μm蛋白樣品轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入1抗(1∶500)RegⅠ、Bcl-2、Bax后，清洗3次，間隔10 min/次,最后加入辣根過氧化物酶2抗對溶液稀釋,封閉1 h。取出PVDF膜,漂洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色后照相。嚴格按照試劑盒說明操作。

1.7統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1各組胃黏膜組織形態檢測結果 與正常組相比，模型組與低劑量組胃黏膜組織有炎性細胞浸潤產生，排列雜亂無章、胃壁增厚，高劑量組與對照組胃黏膜組織炎性細胞浸潤減少，排列較為有序。見圖1。

圖1 各組胃黏膜病理形態(HE染色，×200)

2.2各組胃癌細胞凋亡情況檢測結果 模型組胃癌細胞凋亡率〔(4.11±0.42)%〕明顯高于正常組〔(0.00±0.00)%；t=23.97，P<0.001〕。模型組明顯低于低劑量組〔(26.31±2.13)%；t=25.05，P<0.001〕。低劑量組明顯低于高劑量組〔(47.31±4.31)%；t=10.70，P<0.001〕。高劑量組明顯高于對照組〔(34.32±3.11)%；t=5.99，P<0.001〕。見圖2。

2.3各組血清中胃動素、胃泌素水平檢測結果 正常組胃動素、胃泌素水平明顯低于模型組(P<0.05)，模型組上述指標水平明顯高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組上述指標水平明顯高于高劑量組(P<0.05)，高劑量組上述指標水平與對照組無差異(P<0.05)，見表1。

2.4各組VEGF、Beclin1 mRNA水平檢測結果 與正常組相比，模型組VEGF mRNA水平明顯提升、Beclin1 mRNA水平明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組VEGF mRNA表達明顯降低、Beclin1 mRNA表達明顯提升(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組與對照組VEGF mRNA表達明顯降低、Beclin1 mRNA表達明顯提升(P<0.05)。高劑量組與對照組VEGF mRNA、Beclin1 mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.5各組RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白水平檢測結果 與正常組相比，模型組RegⅠ、Bcl-2水平明顯升高，Bax水平明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組RegⅠ、Bcl-2水平明顯下降，Bax水平明顯提升(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組與對照組RegⅠ、Bcl-2水平明顯下降，Bax水平明顯提升(P<0.05)。與高劑量組相比，對照組RegⅠ、Bcl-2水平明顯升高，Bax水平明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

圖2 各組胃癌細胞凋亡(TUNEL染色，×200)

表1 各組胃動素、胃泌素水平、VEGF、Beclin1 mRNA水平、RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白水平對比

圖3 各組RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

胃癌的發病率在世界范圍內位居第5，死亡率居于第3〔4〕。在我國，該病的發病率和死亡率分別位于第2、3位，高于世界平均水平。

胃腸激素可調節胃腸功能，胃動素與胃泌素是其中兩種，胃動素主要定位于小腸，具有促進胃腸運動的作用，胃泌素是一種肽類物質，可刺進胃腸功能的運動及分泌，可調節機體的消化道并維持其功能正常運轉〔5〕。中醫認為胃癌基本病機是濕濁和熱毒，羅英化濁解毒方中白英具有清熱解毒、消腫利濕、抗癌的功效；砂仁具有健脾化濕、溫脾止瀉的作用。本研究顯示胃泌素與胃動素水平較健康大鼠高，在經過藥物干預后水平有所降低且呈現劑量依賴性，目前研究表明希羅達治療胃癌效果較高，因此，本文選用希羅達作為藥物對照組，羅英化濁解毒方水平對胃癌具有一定的治療作用。在黎玉容等〔6〕對胃癌大鼠進行的實驗中提出，胃動素與胃泌素水平在胃癌大鼠中為高表達，降低其水平后，大鼠的胃腸功能得到一定的改善。砂仁是羅英化濁解毒方中的一味中藥材，在陶彥谷等〔7〕對胃潰瘍的實驗研究中提出，砂仁具有降低胃泌素及胃動素水平的作用。本研究結果與上述研究結果相似，且本文HE染色結果也表明在經過藥物干預后胃癌大鼠胃黏膜組織形態有所改善。

新血管的形成是腫瘤發展的基礎，VEGF具有促進血管新生的作用，是血管形成的關鍵因子，新生雪管的增加促進癌細胞遠處轉移，加重病情〔8〕。羅英化濁解毒方中冬凌草具有清熱解毒、活血止痛、抗腫瘤等作用；郁金具有活血止痛、行氣解郁等作用；石菖蒲理氣活血祛濕的作用。肖麟等〔9〕對胃癌大鼠進行的實驗提出，高水平的VEGF會增加腫瘤血管新生，促進胃癌發展，經過藥物干預后，其水平降低，病情有所改善。石菖蒲與郁金是羅英化濁解毒方中的兩味中藥材，田軍彪等〔10〕在實驗中提出石菖蒲、郁金可降低VEGF水平，改對腦缺血再灌注大鼠的病情嚴重程度。本文與上述研究結果相似。

Reg再生基因家族具有促有絲分裂、抗凋亡、抗炎癥等作用。已有研究證實其在結腸癌〔11〕、胃癌〔12〕等消化道腫瘤中均為高表達。RegⅠ是再生基因家族的成員之一，主要參與組織損傷與腫瘤的產生，相關研究表明〔13〕，RegⅠ表達與胃癌的分化程度、浸潤性生長及預后具有一定的相關性。RegⅠ在胃癌中具有抗凋亡的作用。Beclin1是一種與自噬相關的抑癌基因，對自噬具有正性調節作用，自噬誘導的自噬性細胞死亡能夠殺傷腫瘤細胞，進而抑制腫瘤發展〔14〕。已有學者證實〔15〕Bcl-2、Bax與細胞凋亡聯系密切，Bcl-2是抗凋亡因子之一，低表達的Bcl-2 可提高Bax 水平加快細胞凋亡。羅英化濁解毒方中藤梨根具有抗腫的功效；冬凌草與莪術具有清熱解毒、活血止痛、行氣破血、抗腫瘤的功效。徐平平等〔16〕對胃癌大鼠的實驗提出，通過提高胃動素與胃泌素的水平，改善了大鼠的胃功能，通過降低Bcl-2、提高水平加快癌細胞凋亡。朱飛葉等〔17〕對胃癌大鼠的實驗提出，與健康大鼠相比，胃癌大鼠Beclin1水平較低，在經過藥物干預后水平有所升高。張蕾等〔18〕在對胃癌細胞的實驗中提出，通過降低Bcl-2、提高Beclin1、BAX水平可促進癌細胞的凋亡。冬凌草與藤梨根是羅英化濁解毒方中的兩味中草藥，程珊等〔19〕對胃癌細胞的實驗提出，高表達的RegⅠ促進癌細胞的生長，通過降低RegⅠ、提高胃泌素水平可減少癌細胞增殖。王志坤等〔20〕對胃癌前病變大鼠的研究提出，冬凌草與藤梨根通過降低RegⅠ、PCNA水平抑制細胞增殖。本研究結果與上述醫學者研究結果相似，羅英化濁解毒方通過降低RegⅠ水平抑制了Bcl-2的表達，促進了Bax、Beclin1表達，降低了胃動素與胃泌素水平，從而增加胃癌細胞的凋亡，改善腸胃功能。且本文TUNEL檢測癌細胞凋亡的結果也可證實在經過羅英化濁解毒方治療后癌細胞凋亡增加，且具有劑量依賴性。

綜上所述，羅英化濁解毒方通過降低RegⅠ水平，改善了胃癌大鼠病理組織形態，促進了癌細胞的凋亡，且呈現明顯的藥物劑量依賴性。