基因檢測在兒童糖尿病中的研究進展及臨床評估

董國慶 黃秒 陸喜燕

南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院兒童內分泌科（廣東深圳 518028）

糖尿病是兒童時期第三常見的慢性疾病，是因環境及遺傳等多種因素導致的一種代謝紊亂，主要有1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）、2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）和其它類型糖尿?。?］。單基因型糖尿病作為其它類型糖尿病中的重要組成部分，包括新生兒糖尿病（neonatal diabetes mellitus，NDM）、青少年成人型糖尿?。╩aturity-onset diabetes of the young，MODY）、線粒體糖尿病（mitochondria diabetes mellitus，MDM）和綜合征相關糖尿病等，約占兒童糖尿病的1% ～6%［2-3］。然而，由于臨床表型異質性和缺乏糖尿病家族史，有一部分單基因糖尿病被誤診。近年來，隨著二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）及全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）的開展，糖尿病的遺傳學基礎越來越清楚。本文對兒童糖尿病基因檢測相關內容做如下綜述。

1 各類兒童糖尿病的遺傳學進展

1.1 T1DMT1DM 有關的遺傳變異不斷被發現，但其機制如何，待進一步研究［4］。GWAS 已經確定了50 多個導致T1DM 發病機制的遺傳風險區域，超過60% 的變異影響胰島β 細胞表達，表明這些基因可能在T1DM 發病機制中起關鍵作用［5］。最近研究表明，T1DM 遺傳風險評分（the type 1 diabetes genetic risk score，T1D-GRS）可篩查T1DM 遺傳風險，適用于新生兒［6-7］、成人糖尿病的分類和胰島自身免疫性疾?。?］。

1.2 T2DM2 型糖尿病是一種復雜的疾病，是遺傳、表觀遺傳和環境因素之間相互作用的結果［9］。自2007年開始進行T2DM-GWAS 研究后已發現約250 個基因組區域與T2DM 易感性相關［10］，其中幾個區域出現了基因突變和疾病的因果證據［11］。例如：KCNJ11、WFS1、HNF1A、HNF1B、ABCC8、GLIS3。長鏈非編碼RNA 在T2DM 患者中與胰島功能相關，并可促進胰島β 細胞的凋亡［12］。有關多基因結構與T2DM 研究取得了快速進展，但在疾病預測或預防的臨床應用很少［10］。

1.3 單基因糖尿病

1.3.1 MODY是指青少年發病的成年型糖尿病，代表了一組臨床異質性常染色體顯性遺傳疾病，由參與β 細胞發育和胰島素分泌的基因突變引起，是最常見的單基因糖尿病形式［1，13］。目前明確導致MODY 致病基因有14 個，其中GCK、HNF1A及HNF4A 突變在MODY 最常見［14］。MODY 在兒童人群中發病率因國家和地區而異，但以上基因致病突變約占所有MODY 病例的85% ～90%［15］。GCK 基因突變在中國MODY 患者中最為常見，其次是PAX4、FOXM1［16-18］。注意的是，具有MODY樣表型的患者中未發現在已知的MODY 基因突變，需考慮是否有其他基因致病突變導致。最近的研究將RFX6 確定為一種新的MODY 基因［19］，WFS1、PPARG 和GLIS3 可作為這些罕見MODY 形式的潛在候選基因［20］。

1.3.2 NDM是指出生后6 個月內發病的糖尿病，非常罕見疾病，發病率為1/10 萬～1/40 萬，目前發現至少有26 個致病基因［21］，其中編碼鉀ATP 通道亞單位的基因（KCNJ11、ABCC8），INS 基因與暫時性和永久性NDM 有關，而GCK 基因中的突變主要表現為永久性NDM。

1.3.3 MDM是指線粒體基因突變型和核基因突變型導致的特殊類型糖尿病，占糖尿病總數的3%。到目前為止，總共發現了54 個與不同類型糖尿病相關的mtDNA 突變［22］，其中m.3243A＞G 突變是MDM 中最常見的突變位點，約占所有MDM 的85%，m.3243A＞G 突變攜帶率高達1∶400。MDM 在兒童期發病較少，主要在成年發現。若兒童期先出現耳聾和發育遲緩（包括智力殘疾、自閉癥、矮?。?，后有糖尿病，要注意MDM。特別是在家系內發現糖尿病的傳遞符合母系遺傳，是高度需注意除外MDM［23］。

2 臨床基因檢測方法選擇及應用指征

2.1 臨床基因檢測方法選擇NGS 技術正迅速成為臨床實驗室對疑似遺傳疾病患者的常規臨床診斷工具。首選全外顯子測序（whole exome sequencing，WES），現在市面上提供的臨床外顯子測序大部分可檢測點突變外，還檢測染色體微缺失、編碼區的大片段缺失、部分線粒體基因。注意的是，臨床醫師在選擇基因檢測前，需結合臨床表型篩選感興趣的基因，并與檢測實驗室確認感興趣基因已充分覆蓋。經濟條件允許，可以做家系全外，可以提高致病基因新發突變的幾率。還有一些用全外測序不能檢出，例如6q24 暫時性新生兒糖尿病（TNDM）是一類罕見的單基因糖尿病，與染色體6q24 區基因印跡異常有關，需用甲基化特異性多重連接依賴性探針擴增法（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MSMLPA）［24］。對于MDM 臨床疑診患者時，首先篩查m.3243 位點，國內部分基因檢測公司開展m.3243位點口腔唾液篩查，必要時首取選皮膚組織（皮膚成纖維細胞），其次為血液（淋巴細胞）進行線粒體基因包檢測。目前用于mtDNA 突變分析的方法包括WES、線粒體基因包和全基因組測序（wholegenome sequencing，WGS）［25］。WGS 主要用于識別核突變的情況下很有用，但它的檢測效率和準確性需要提高［26］。

在進行基因檢測前，臨床醫師需收集完整的臨床信息，如人類表型本體（human phenotype ontology，HPO）規范表達，完整的家族史［27］。進行任何基因檢測前均需向受檢者簽署知情同意書，告知詳細閱讀理解。檢測都不能保證100%找到致病原因，基于現有的研究及認識、受送檢樣本的真實性、檢測局限性等因素限制。檢測只是輔助臨床診斷，不能替代臨床診斷。高精度的檢測方法仍然面臨可能發現一些臨床意義未明的結果，做好思想準備。

2.2 臨床應用指征對于以下幾類糖尿病患兒，建議進行分子遺傳學檢測［1，13，28］：（1）6 個月齡前發?。唬?）6 ～12 個月齡起病，自身抗體陰性；（3）合并胰腺外病變；（4）家族多代（三代以上）高血糖或糖尿病史；（5）診斷T1DM 5年后，胰島素需要量低，血清及尿C 肽在正常范圍或稍偏低；（6）穩定、輕度的空腹血糖升高（5.5 ～8.5 mmol/ L），糖化血紅蛋白穩定在5.6% ～7.6%之間，特別是非肥胖患者；（7）新生兒期高胰島素性低血糖癥；（8）與肥胖程度不符合的顯著黑棘皮病表現，可伴有高甘油三酯等脂代謝異常表現；（9）中心型肥胖。（10）有明確的糖尿病家族史。多項研究顯示［2，29-30］自身抗體陰性是MODY 的最強預測因子，另外兩個關鍵因素是診斷時糖化血紅蛋白＜7.5%和父母有糖尿病史。

1 歲至青春期前的兒童糖尿病主要是T1DM，在青春期前后，更多考慮T2DM 和單基因糖尿病，但T1DM 仍是一個考慮因素。診斷單基因糖尿病和T2DM 時，陽性家族史是重要的參考因素。因此必須要詢問每個兒童糖尿病的家庭成員的具體細節，包括糖尿病診斷時的年齡、診斷時的身體狀況和治療，以獲得有價值的家族史。

筆者給1 名生后有持續高血糖新生兒，予NGS測序基發現KCNJ11 c.679G/A p.（Glu227Lys）變異，家系驗證提示父母均未見此突變。先證者為孕39+4周，女孩，出生體質量2.12 Kg，生后因“足月小于胎齡兒，孕母妊娠期糖尿病兒”在新生兒科住院期間持續高血糖，血糖波動在8.8 ～17.4 mmol/L，基因確診后給予口服格列本脲［0.05 ～01 mg/（kg·d），Tid 或Biol］治療1 周后血糖逐漸恢復正常，在1 歲時?？诜幬?，現3 歲10月血糖定期監測正常。此患兒表現為暫時性新生兒糖尿病，借助分子診斷技術實現了精準治療。

3 基因報告臨床解讀

兒童糖尿病第二代測序發現的、或者臨床未證實的可疑致病突變均可依照美國醫學遺傳學和基因組學會以及美國分子病理學會遺傳變異標準分類與指南進行判別［31］。具體的遺傳變異分析流程（圖1）可參照美國國立衛生研究院臨床基因組資源基因注解工作組制定的標準操作流程（https：//clinicalgenome.org/，ClinGen），用于基因功能判斷的各種數據可從臨床相關變異數據庫（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/，ClinVar）、人類基因突變數據庫（HGMD?）中獲取。對于功能數據缺乏的遺傳變異，可用生物信息學預測法對其進行評估。

圖1 基因測序致病性的判斷流程圖Fig.1 Flow chart for determining the pathogenicity of gene sequencing

基因報告中經常出現的意義未明突變（VUS）使得情況更加復雜，確定VUS 是否與患者的臨床表現有關是糖尿病基因診斷中最具挑戰性的方面之一［32］。目前，國內大部分醫療機構無專門的遺傳咨詢師為遺傳病提供遺傳咨詢，因此，在建立臨床診斷后，臨床醫師需承擔為患者及家屬提供遺傳咨詢。臨床醫師收到基因報告后，可以參照中國2020年發表的《遺傳病二代測序臨床檢測全流程規范化共識探討》［33］中有關檢測報告解讀和遺傳咨詢部分進行臨床解讀?？赡軙霈F以下幾種情況：（1）檢出與先證者表型相關且符合遺傳規律的致病/疑似致病變異：臨床醫師應該查閱相關文獻，結合臨床表現與基因檢測結果謹慎的對先證者確診。通常遺傳報告不提供臨床指導，在建立了基因診斷后也需查閱相關文獻，對臨床管理進行適當的改變。例如：GCK 基因突變致MODY 無需降糖治療，HNF1A 基因突變致MODY可能對磺脲類藥物治療更敏感。筆者用定制糖尿病基因包檢測一位反復空腹高血糖10 歲8月女孩，發現HNF1A 基因c.599G＞A（p.R200Q）雜合突變，診斷MODY3，家系驗證變異來源于母親，母親也存在空腹血糖異常，予飲食控制可正常，同胞弟弟也存在同一位點的突變，但未進行血糖檢測。但本例先證者進行飲食控制后血糖控制理想，因此我們還應該注意到并非推薦MODY 最佳的治療方案適合所有患者，注意個體化治療。特別注意的是糖尿病線粒體DNA 突變分析，因MDM 常見致病m.3243A＞G 人群攜帶率高，有較低的臨床外顯率，且有明顯的臨床異質性，需謹慎對待。識別MDM 具有挑戰性，線粒體突變相關的致病表型取決于攜帶突變的mtDNA 拷貝的比例，并有組織特異性。另外T1DM 和T2DM 也存在線粒體功能障礙，線粒體糖尿病的表型也可能具有與T1DM 和T2DM 共同臨床表現。因此，臨床上注意區分由原發性線粒體疾病導致癥狀性糖尿病與原發性糖尿病對線粒體的繼發性影響非常重要。（2）檢出與先證者表型相關但不符合遺傳規律的致病/疑似致病變異：這種情況常見于染色體隱性遺傳性糖尿病檢測出一個致病雜合突變。若先證者臨床表型高度符合該基因相關疾病臨床表現，建議聯系基因報告實驗室做進一步評估、分析。（3）檢出VUS：若VUS 與先證者表型高度相關且遺傳模式符合，此類變異有可能構成糖尿病病因，建議結合先證者表型和家系驗證情況進一步分析，必要時組織遺傳糖尿病專家、基因報告實驗室、遺傳學等進行多學科討論，必要時做功能驗證。若檢出與先證者表型相關但不符合遺傳規律VUS，先證者臨床表型高度符合該基因相關疾病臨床表現，可考慮選擇其它檢測方法或者擴大檢測范圍，尋找該基因的另一個致病變異。

4 功能驗證

對于新發致病突變或者有臨床意義的VUS，有條件的可進行變異功能驗證。首先需建立合適的糖尿病疾病模型。近年來，利用人類干細胞建立疾病模型成為研究熱點。人類胚胎干細胞（human embryonic stem cell lines，hESCs）及患者特異性誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的整體分化模型為研究遺傳疾病對人類胰腺中β 細胞發育以及人類胰腺本身的胚胎發育的影響提供了有用的工具［34］。許多研究已成功地使用CRISPR/Cas9 工具通過單個遺傳變異對β 細胞分化和功能的影響［35］。因T1DM 和T2DM 患者受自身免疫、環境以及多遺傳因素影響，利用人類干細胞分化模型對T1DM 和T2DM 建立疾病模型具有挑戰性［36］，但是對于MODY 或PNDM 糖尿病表型糖尿病是一個理想的選擇［37］。

5 總結

在精準醫學時代，基因檢測已被證明是鑒定糖尿病遺傳原因重要工具。被診斷的遺傳性糖尿病，受益于精準的臨床管理、遺傳咨詢、新的治療藥物。不斷報道的已知基因的新突變和新基因，有助于糖尿病發病機制的了解。在這樣的背景下，應該重視遺傳因素在兒童糖尿病的致病作用，積極查閱相關文獻，做好與基因檢測方、患者溝通，對基因檢測的選擇與基因報告的臨床解釋需謹慎。

【Author contribution】DONG Guoqing and HUANG Miao designed，wrote and revised the article. DONG Guoqing，HUANG Miao and LU Xiyan Reviewed the literatures. All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.