長鏈非編碼RNA TUG1對鼻咽癌細胞生物學行為及放射敏感性的影響

廖志偉 朱建曼 周同沖 鄭榮輝

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放療科（廣州 510095）

鼻咽癌放射抗拒的機制尚不清楚，對放射抗拒鼻咽癌的識別和治療成為一個懸而未決的問題。預后評估對鼻咽癌患者做出更好的治療選擇至關重要，TNM 分期系統是決定鼻咽癌患者預后的關鍵因素。然而，相同疾病分期的患者在接受類似治療后，其臨床結果往往具有相當大的差異，這表明TNM 分期仍遠不能作為一個完美的預測指標。因此，尋找鼻咽癌潛在的預后分子生物標志物和放療相關的新靶點，對于發展有效的治療手段是必不可少的。

近年來，LncRNAs 及其在鼻咽癌發展中的作用備受關注［1］。其中一些lncRNA，如PVT1［2］、HOTAIR［3］和ANRIL［4］，被認為在鼻咽癌發生發展中起重要作用。TUG1（taurine upregulated 1）最早是在用牛磺酸處理小鼠視網膜細胞時發現的一種新的上調lncRNA［5］。越來越多的證據表明TUG1 在腫瘤發生和發展過程中起著重要的調節作用［6-8］。最近的一項研究［9］發現TUG1 參與了鼻咽癌細胞的生長和侵襲。然而，其在鼻咽癌放射敏感性調節中的作用尚未完全明確。

本研究利用TCGA 數據庫綜合分析了TUG1 在33 種人類癌癥中的表達特征和預后價值。隨后，通過檢測TUG1 在患者臨床標本中的表達，以及采用MTS 法、transwell 實驗和劃痕實驗、細胞克隆形成等實驗，進一步探討TUG1 在鼻咽癌中的作用及其潛在的預后價值。

1 材料與方法

1.1 基因表達分析本研究33 種癌癥的基因組和臨床病理信息來自癌癥基因組圖譜數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和Xena 數據庫（https：//xenabrowser.net/datapages/）。采用wilcox 檢驗檢測各種癌癥中TUG1 的表達水平。

1.2 泛癌中TUG1 生存預后分析使用TCGA 數據庫進行單因素Cox 回歸分析，研究TUG1 表達與總體生存（OS）、無病生存（DFS）、疾病特異性生存（DSS）、無進展生存（PFS）的關系。

1.3 病人資料和組織樣本本研究使用的鼻咽癌組織和相應的癌旁組織來源于2010-2012年廣州醫科大學附屬腫瘤醫院。所有鼻咽癌標本均在接受根治性放射治療（伴或不伴化療）前采集。本組鼻咽癌患者包括65 例男性和28 例女性，表1總結了他們的臨床病理特征。平均隨訪時間為74 個月（中位數為77 個月；范圍9 ～233 個月）。所有患者的疾病分期按照美國國際癌癥控制聯盟癌癥聯合委員會第八版分期進行重新分類。在這些臨床材料被用于研究之前，已經得到了廣州醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會的批準。

1.4 細胞培養和寡核苷酸轉染人鼻咽癌細胞株（5-8F，6-10B，CNE-1，CNE-2）和人永生化鼻咽上皮細胞系NP69，按常規方法采用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640（Gibco）培養基，37 ℃，5%CO2培養箱中靜置培養。用于敲除TUG1 的siRNA 及其陰性對照siRNA 購自Ambion 公司。siRNA 由Lipofectamine 2000 試劑（Invitrogen，Carlsbad，USA）按照說明書進行轉染。轉染48 h 后，檢測TUG1 表達水平。siRNA 的目標序列如下：

TUG1-siRNA sense 5′-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3′，antisense 5′-UAGAAUUGUUCUCUGGCUAUAUCCC-3′

1.5 RNA 提取和qPCR 分析使用TRIzol 試劑（Invitrogen）從組織或培養細胞系中提取總RNA。用M-MLV 逆轉錄酶試劑盒（Promega，M1705）從總RNA 中合成cDNA。在MiniOpticonTM實時PCR 檢測儀器（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）上進行qPCR 和數據收集。以GAPDH 作為TUG1 表達分析的內參。

引物序列：正向引物：5“-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3”，反向引物：5“-CACAAATTCCCATCATTCCC-3”。

1.6 細胞增殖實驗細胞增殖試劑盒（Cell proliferation Reagent Kit，MTS）檢測細胞在12、24、48、72 h 的增殖情況。按照生產商的方案，將轉染后的細胞置于96 孔板中（3 000 細胞/孔），每孔加入10 μL MTS 試劑，37 ℃孵育4 h，酶標儀檢測490 nm吸光值。繪制增殖速度變化曲線。

1.7 細胞侵襲遷移試驗為了進行基質入侵實驗，在聚碳酸酯過濾器的上端涂上Matrigel 基質。下室灌滿含血清培養基（600 μL）作為趨化劑。細胞被添加到Transwell 上室。培養48 h 后，用甲醇固定細胞，用結晶紫溶液染色。用棉簽擦去未侵入的細胞。隨機計數顯微鏡下6 個視野中的細胞數目，以侵襲細胞數目表示腫瘤侵襲能力。

1.8 細胞劃痕實驗實驗前1 d 將細胞接種于6 孔板形成單層細胞。用無菌200 μL 吸管頭損傷單層細胞形成人工劃痕，PBS 沖洗細胞，在5% CO237 ℃培養基中培養。分別于損傷后0、24、48 h 拍照觀察遷移情況。

1.9 細胞克隆形成實驗采用細胞克隆形成實驗測定放射敏感性。將細胞接種在6 孔板上，將細胞按照不同的照射劑量（2 ～10 Gy）分別進行射線照射。照射方法：使用6 MVX 射線（廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放療中心西門子PRIMUS 直線性加速器），劑量率為2 Gy/min。培養10 ～14 d 后，用甲醇固定、結晶紫染色。然后使用顯微鏡計數克隆數（＞50 細胞的群體）。采用GraphPad Prism 5軟件將數據擬合到線性二次模型。

1.10 細胞周期和細胞凋亡分析si-TUG1或對照轉染細胞24 h 后行細胞周期分析。胰酶消化細胞，培養基中和后離心細胞，用PBS 洗滌。用Annexin V 和7-AAD 染色，置于4 ℃暗室中15 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。細胞凋亡分析用胰酶法收集細胞，PBS 洗滌3 次。收集細胞于4 ℃70%乙醇中固定過夜。轉染48 h 后收集細胞，用凋亡檢測試劑盒進行染色。流式細胞儀測定細胞凋亡百分率。

1.11 統計學方法統計分析使用R v4.1.2 和SPSSv18.0 進行。實驗數據用GraphPad Prism 5 軟件計算后以平均值±標準差表示。實驗組和對照組的比較采用Student′t檢驗或單因素方差分析。TUG1 的表達與臨床病理特征參數的關系采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗進行生存分析，比較TUG1 高表達和低表達兩組生存率的差異。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA 數據庫中TUG1 的表達差異利用TCGA 在線數據庫發現，較正常組織來說，TUG1在廣泛腫瘤組織中水平升高（圖1A），包括BLCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、STAD 和THCA（圖1A）。TUG1 在TCGA 數據庫中的33 種癌癥類型中差異高表達；其中ESCA 最高，LIHC 表達最低（圖1B）。

圖1 TUG1 在TCGA 數據庫多種腫瘤的表達水平Fig.1 TUG1 in different cancers in TCGA database

2.2 TCGA 數據庫中TUG1 的表達與預后的相關性分析利用TCGA 在線數據庫，單變量cox 回歸分析發現：在ACC 和LIHC 中，TUG1 的高表達與較差的OS 呈正相關，而在BLCA 和LGG 中與較好的OS 相關（圖2A）。對于DFS，在ACC 中，TUG1 的高表達與較差的生存率顯著相關（圖2B）。對于DSS，ACC、LIHC 中TUG1 高表達與較差的預后顯著相關，而LGG 和THYM 與較好的預后相關（圖2C）。對于PFS，在ACC、LIHC 和UVM 中，TUG1 的高表達與較差的PFS 呈正相關，而在GBM 和LGG 中與較好的PFS 相關（圖2D）。

圖2 使用單變量COX 比例風險模型，TUG1 在TCGA 數據庫不同癌癥中的預后價值Fig.2 Prognostic value of TUG1 in different cancers in TCGA database using univariate COX proportional hazard model

2.3 TUG1 在鼻咽癌細胞系和組織中表達上調qRT-PCR 結果表明與非致瘤性NP69 細胞系相比，TUG1 的表達水平在5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2 四個鼻咽癌細胞系都明顯增加（圖3A）。進一步我們使用qRT-PCR 檢測TUG1 在鼻咽癌患者組織的表達水平。與配對的癌旁組織相比，TUG1在鼻咽癌原發組織標本中的表達均顯著上調（圖3B）。為了評估TUG1 在鼻咽癌細胞的功能作用，選擇TUG1 表達相對高水平的CNE-1 CNE-2 細胞，轉染si-TUG1后qRT-PCR 檢測發現TUG1 在CNE-1 和CNE-2 細胞明顯減少（圖3 C）。

圖3 TUG1 在鼻咽癌細胞系和臨床標本中表達情況Fig.3 TUG1 expression in nasopharyngeal carcinoma cell lines and clinical specimens

2.4 TUG1 高表達與鼻咽癌不良預后相關利用qRT-PCR 技術檢測了93 例鼻咽癌患者TUG1 的表達情況。相關性分析表明，TUG1 表達與pTNM 分期顯著相關（表1）。隨后的生存分析結果顯示，TUG1 高表達與總生存期（P= 0.02，圖4A）和無進展生存期（P= 0.02，圖4B）相關。

表1 TUG1 表達與鼻咽癌患者臨床病理參數的關系Tab.1 Relationship between TUG1 expression and clinicopathological parameters in patients with nasopharyngeal carcinoma 例

圖4 TUG1 的表達與鼻咽癌患者的預后關系.Fig.4 Relationship between expression of TUG1 and prognosis of patients with nasopharyngeal carcinoma

2.5 下調TUG1 抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移為了確定下調TUG1 對鼻咽癌細胞增殖的影響，進行了MTS 實驗。下調TUG1 后12、24、48 和72 h 檢測細胞活力，結果表明下調TUG1 顯著抑制CNE1 和CNE-2 細胞增殖（圖5A）。隨后通過Transwell 實驗檢測下調TUG1 對鼻咽癌細胞侵襲能力的影響。結果表明，下調TUG1 降低了CNE-1 和CNE-2 細胞的侵襲能力（圖5B）。傷口愈合實驗則顯示，下調TUG1 抑制了CNE-1 和CNE-2 的遷移能力（圖5C）。

圖5 TUG1 對鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig.5 TUG1 on the proliferation，migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells

2.6 下調TUG1 誘導鼻咽癌細胞凋亡但不影響細胞周期分布為檢測下調TUG1 對CNE-1、CNE-2細胞凋亡的影響，采用流式細胞術檢測細胞凋亡百分率。結果表明與未轉染的CNE-1、CNE-2 細胞相比，轉染si-TUG1 后CNE-1、CNE-2 細胞凋亡率明顯高于轉染了scramble siRNA 的CNE-1、CNE-2 細胞（si-control 組）（圖6A）。隨后使用流式細胞術檢測下調TUG1 是否改變細胞周期分布。與si-control組相比，轉染si-TUG-1 的CNE-1、CNE-2 細胞處于S 期的比例與對照組大致相同（圖6B）。

圖6 采用流式細胞術分析TUG1 對鼻咽癌細胞凋亡和細胞周期的影響Fig.6 TUG1 on apoptosis and cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cells was analyzed by flow cytometry

2.7 下調TUG1 增加鼻咽癌細胞放射敏感性為了明確TUG1 對鼻咽癌細胞放射敏感性的作用，進行了克隆形成實驗。見圖7，與對照組相比，轉染si-TUG1 后，CNE1 和CNE-2 細胞的存活率隨著輻射劑量的增加顯著降低。

圖7 采用集落形成實驗檢測TUG1 對CNE1 和CNE2 細胞放射敏感性影響Fig.7 TUG1 on radiosensitivity of CNE1 and CNE2 cells was detected by colony formation test

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNA 可能在調控基因表達、細胞應激反應、DNA 修復和代謝等環節發揮重要作用［10］。近年來，lncRNA 與鼻咽癌發生發展的相關研究受到了人們的關注，如HOTAIR［11-12］、MALAT1［13］、NEAT1［14］等已被證實參與鼻咽癌的發生。既往研究表明TUG1 可以促進乳腺癌［15］、卵巢癌［16］、前列腺癌［17］和黑色素瘤［18］等多種腫瘤的發生發展。然而，TUG1 在鼻咽癌中的表達模式和功能作用尚未得到全面的研究。泛癌分析結果顯示，TUG1 的表達在大多數癌癥中顯著上調，且其高表達在多種癌癥中預后較差，表明TUG1 在腫瘤的發生和發展中具有重要作用。臨床相關性試驗結果顯示，TUG1 在鼻咽癌組織和細胞系中顯著上調；與QIAN 等［9］最近的一項研究一致。然而，有研究發現TUG1 在非小細胞肺癌［19］和膠質瘤［20］組織中表達下調。TUG1 表達水平的差異反映了TUG1可能具有組織特異性，其在不同腫瘤發生發展中的作用及其表達調控機制尚未明確，有待于進一步研究探討。

本研究進一步分析了TUG1 在鼻咽癌中的臨床意義，結果表明TUG1 在鼻咽癌中的高表達與腫瘤T 分期、N 分期、遠處轉移及臨床分期密切相關。此外，我們發現組織中TUG1 的高表達可能預示著鼻咽癌患者預后較差。這些發現表明TUG1 可能是鼻咽癌診斷和個性化治療的潛在標記物。推測TUG1 低表達的局部晚期鼻咽癌患者也許可以選擇減免化療的低毒治療方式。相反，TUG1 高表達的局部晚期鼻咽癌患者可能需要更高強度的治療。

為深入研究TUG1 對鼻咽癌細胞惡性生物學行為的影響，進行了MTS 實驗、Transwell 實驗和傷口愈合實驗，與既往報道類似［21-23］，本研究發現TUG1 能夠顯著促進鼻咽癌細胞株的增殖、侵襲和遷移活性。表明TUG1 的表達與鼻咽癌的惡性程度相關，并參與了該疾病的發生和進展。后續有必要深入探討TUG1 參與鼻咽癌細胞癌侵襲轉移的分子調控機制。

放射治療是鼻咽癌的主要治療方式。腫瘤細胞對放射治療的敏感性對疾病局部控制至關重要。在過去的十年中，大量研究表明lncRNA 參與調節細胞放射敏感性［24-26］。國內劉秀玲等［27］的研究表明，下調TUG1 表達可增強宮頸癌細胞放射敏感性。為研究TUG1 對鼻咽癌細胞放射敏感性的影響，照射轉染si-TUG1 或陰性對照的鼻咽癌細胞后進行細胞克隆形成實驗。實驗數據顯示，下調TUG1 表達可以有效增加鼻咽癌細胞的放射敏感性。

細胞對放射線的反應與細胞周期和凋亡有關［28］。此前有研究報道下調TUG1 所致的放射敏感性增加與凋亡信號的激活相關［29］。本研究結果與以上研究結果相類似，流式細胞術分析顯示下調TUG1 后人鼻咽癌細胞凋亡增加。然而流式細胞術分析顯示，轉染si-TUG1 抑制CNE-1 和CNE-2細胞中TUG1 表達均不影響細胞周期分布。可見TUG1 在人鼻咽癌發病中潛在的致癌功能有待進一步研究，其直接獲益的確切機制仍有待探索。

盡管本研究提高了我們對TUG1 在鼻咽癌中作用的認識，但仍存在一些局限性。首先，樣本量相對較小，可能產生一定的偏差，后續評估TUG1與鼻咽癌預后關系，應該通過更多數據集進行交叉驗證。其次，公共數據庫中缺乏臨床因素，如患者用藥和（或）手術治療的具體細節，也會影響患者的預后。第三，沒有構建TUG1 過表達載體，并進一步探討TUG1 過表達對鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移的調控作用。第四，TUG1 在鼻咽癌進展和轉移中的直接作用有待于體外實驗進一步驗證，其在鼻咽癌生長、轉移中的分子機制和作用有待進一步研究。雖然本研究存在一定的局限性，但確實為研究TUG1 在鼻咽癌中的作用提供了線索，提示TUG1 在鼻咽癌發生發展過程中發揮重要作用，靶向TUG1 可能為鼻咽癌患者的臨床治療提供一種新的策略。

【Author contribution】LIAO Zhiwei：Conceptualization，Methodology，Writing-Original Draft，Funding Acquisition；ZHU Jianman：Formal Analysis，Writing-Original Draft；ZHOU Tongchong：Resources，Supervision；ZHENG Ronghui：Conceptualization，Writing-Review & Editing. All authors read and approved the final manuscript as submitted.