短鏈脂肪酸通過免疫機制和內分泌環境影響骨代謝的機制進展

劉小峰 張賢 李超 邵家豪 劉智中

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023

2.南京中醫藥大學無錫附屬醫院，江蘇 無錫 214071

骨代謝是一個骨重建的動態平衡過程，即以成骨細胞為主導的骨形成和破骨細胞為主導的骨吸收。骨質疏松是由于骨形成減少，骨吸收增加，導致骨骼密度降低的一種疾病。近年來腸道菌群的主要代謝產物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)在骨代謝方面的研究已經成為熱點。本文通過國內外相關文獻就SCFAs是如何通過免疫機制和內分泌環境影響骨代謝進行綜述。

1 SCFAs的來源、代謝及分布

腸道菌群是多種微生物群落的總稱。人體攝入的營養物質大多在小腸中被吸收，剩余的難以被消化的碳水化合物(統稱為膳食纖維)被結腸中厭氧菌通過發酵形成SCFAs，SCFAs是含有不少于6個碳原子的飽和脂肪酸，最豐富的是乙酸、丙酸、丁酸，分別以大約3∶1∶1的比例存在于結腸中[1-2]。人體攝入的膳食纖維的數量和類型是腸道菌群產生SCFAs的數量和類型的主要決定因素之一[3]。乙酸鹽是由多種類型的細菌產生的，丙酸鹽和丁酸鹽是由數量有限的細菌產生，例如，艾克曼菌從腸黏液層的消化中產生乙酸和丙酸[4-5]，普拉梭菌和霍氏真桿菌從消化中產生丁酸[6]。其中大多數乙酸通過門靜脈到達肝臟被肝臟吸收，丁酸鹽被結腸細胞用作能量來源，乙酸鹽和丙酸鹽被代謝并部分氧化或用作糖異生和脂肪生成的底物。SCFAs可以影響機體的炎癥反應、免疫應答、內分泌調節和能量代謝等過程，來維持整個機體的代謝過程。

2 SCFAs通過免疫機制調節骨代謝

SCFAs具有免疫調節功能，T細胞和B細胞是免疫機制中重要的免疫細胞，T細胞是由胸腺中淋巴干細胞分化而成；B細胞是由骨髓中的造血干細胞分化發育而成，二者都參與骨代謝過程的調控，對骨形成和骨吸收發揮重要作用。研究顯示SCFAs可以影響T細胞和B細胞的分化發育調節骨代謝。

2.1 T細胞

SCFAs可以通過調節T細胞免疫機制影響骨代謝。Croes等[7]認為，保持促炎輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)和抗炎調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)之間的平衡狀態是調節骨代謝的重要因素。之前的研究顯示，SCFAs可以通過調控TH17 細胞的分泌刺激骨吸收，也可以通過調控Treg細胞的分泌刺激骨形成和抑制骨吸收。一方面，SCFAs可以增加腸道中TH17細胞的分泌，一部分TH17細胞向骨髓中遷移，分泌IL-17、IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)，誘導破骨細胞的生成[8]；另外，IL-17可以促進成骨細胞釋放核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)，當RANKL與破骨前體細胞上表達的核因子-κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)結合后，通過TNF受體相關因子-6激活下游分子如核因子κB、AP-1、P38和轉化生長因子激酶1[9]，啟動破骨細胞分化的信號的級聯反應，促進破骨細胞的生成[10]。另一方面，SCFAs誘導幼稚CD4+T細胞在骨髓中分化為Treg細胞，Treg細胞激活NFAT和SMAD信號轉導，NFAT和SMAD結合Wnt10b啟動子區(堿基為705～272)激活Wnt10b，誘導CD8+T細胞中Wnt10b的產生，CD8+T細胞是Wnt10b的主要來源，Wnt10b是Wnt信號傳導的有效激活劑，從而激活成骨細胞Wnt信號刺激骨形成[11]；另外，Zaiss等[12]也發現SCFAs可以抑制組蛋白脫乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)誘導Treg細胞的分化和下調破骨細胞代謝的重編碼，抑制破骨細胞的生成和分化；因此，保持TH17細胞和Treg細胞之間的平衡對調節骨代謝十分重要。最近研究顯示，SCFAs可增加幼稚CD4+T細胞的最大耗氧率，使其向Treg細胞分化增加，并減少向TH17細胞的分化[13]。機制是丁酸鹽激活PPARg重新編碼能量代謝，促使糖酵解減弱而糖化磷酸化增強，從而促進T細胞更多的分化為Treg細胞，對骨代謝發揮作用[14]。除此之外，Yang等[15]研究發現SCFAs可以促進CD4+T細胞產生IL-22。IL-22是IL-10家族一員，IL-22可作用于類風濕性關節炎患者的滑膜和纖維細胞中，提高單核細胞趨化因子的產生，有利于單核細胞分化為成骨細胞。另一項研究表明，丁酸可以通過作用于GPR41和GPR43受體，促進活化CD8+T細胞的代謝[16]。一方面，終末分化的效應記憶CD8+T細胞可表達IFN-γ，IFN-γ的增加可抑制骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化，Xu等[17]發現局灶性照射大鼠模型后，骨髓中的CD8+T淋巴細胞增加，通過減少MSCs的成骨分化，導致全身骨小梁減少和骨密度降低。另一方面，CD8+T細胞能夠大量表達骨保護素(osteoprotegerin，OPG)，OPG與RANK競爭結合RANKL，當OPG與RANKL結合之后，可抑制破骨細胞的分化；當RANK與RANKL結合之后，激活核因子κB，引起破骨細胞的基因表達，促進破骨細胞的生成。

2.2 B細胞

SCFAs可以通過調節B細胞免疫機制調節骨代謝。研究發現，B細胞家族可以產生骨髓中64%的OPG，其中40%來源于成熟B細胞，除此之外，T細胞通過CD40配體(CD40 L)到CD40共刺激，促進B細胞在體內產生OPG[18]。OPG可以抑制RANKL來促進成骨細胞的分化。另一項研究發現，B淋巴細胞通過結節性硬化癥復合體1(tuberous sclerosis complex 1，TSC1)/哺乳動物的雷帕霉素靶標(mTOR)/蛋白激酶B(AKT)信號轉導途徑控制RANKL/OPG比率，從而調節破骨細胞的形成。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)是mTOR的一個功能復合體。TSC1是mTORC1的上游負調控因子，Liu等[19]研究發現，在骨細胞TSC1缺失小鼠模型中，骨細胞mTORC1被激活，導致骨骼中的硬化素減少，促進了骨吸收，這說明TSC1/mTORC1對調節骨代謝發揮重要作用。另外，Xu等[20]研究證明，mTORC1在B細胞中被激活后，能刺激RANKL的轉錄，但會通過AKT/β-catenin通路負調控OPG的表達。mTORC1是通過抑制AKT和破壞β-catenin mRNA來下調β-catenin，β-catenin已被證明可以抑制RANKL的轉錄和促進OPG的轉錄，所以激活mTORC1會導致RANKL的轉錄增加，OPG表達下降。SCFAs通過影響mTOR轉錄因子的表達，影響RANKL/OPG比率，SCFAs還可影響OPG的產生，從而調節破骨細胞的分化。

3 SCFAs通過內分泌環境調節骨代謝

SCFAs可以通過內分泌環境參與骨代謝的調控，通過影響相關激素的分泌影響成骨細胞和破骨細胞的分化發育，目前研究較多的是胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)。

3.1 胰島素樣生長因子-1

IGF-1主要來源于肝臟，其他肌肉、組織或臟器通過旁分泌和自分泌方式發揮作用。IGF-1通過與成骨細胞、軟骨細胞、破骨細胞的同源受體結合，發揮調節骨代謝的作用。IGF-1通過激活AKT-mTOR通路，促進成骨細胞mRNA翻譯，刺激成骨細胞的活化、增殖[21]。成骨細胞又通過胰島素受體底物應答IGF-1信號，促進RANKL分泌增加，RANKL與RANK結合之后，激活核因子κB，引起破骨細胞的基因表達，促進破骨細胞的活化、增殖，使骨周轉率加快。

年齡、營養狀況等都會影響體內IGF-1的分泌，Schwarzer等[22]用同齡且喂食相同的小鼠做對比。研究發現，正常腸道菌群定植小鼠的生長速度比無菌(GF)小鼠生長速度快，且股骨長度和骨量都比GF小鼠高，表明腸道菌群影響骨骼的生長和重塑。另外，他們檢測了小鼠血清IGF-1水平，發現正常定植的小鼠血清IGF-1水平比GF小鼠升高兩倍，且成骨細胞中IGF-1的mRNA水平顯著高于GF小鼠，同時矮小相關轉錄因子(Runx2)(骨髓中IGF通路的下游靶標)水平也增加[23]。這與他們之后用BALB/C背景小鼠進行實驗的研究結果一致[24]，說明腸道菌群可以上調肝臟來源的IGF-1水平來調節骨骼的生長。然而在另外一項研究中，Yan等[25]用GF小鼠定植腸道菌群1個月后，骨小梁減少，體重減輕，檢測發現定植1個月小鼠，血清IGF-1水平增加，血清骨吸收標志物Ⅰ型膠原C端肽(CTX-1)增加，同時血清骨形成標志物前膠原I型N末端前肽(P1NP)也顯著增加，繼續定植8個月后骨小梁增加，體重增加，血清IGF-1水平仍明顯升高，這表明腸道菌群可以上調血清IGF-1的水平，腸道菌群短期定植可同時促進小鼠骨形成和骨吸收，但是骨小梁減少的原因可能是由于骨吸收的瞬時增加所致；長期定植的小鼠骨小梁增加，體重增加，原因可能是此時骨形成作用遠超過骨吸收。腸道菌群的發酵產物主要是SCFAs，正常定植小鼠體內SCFAs濃度比GF小鼠更高。為了探討腸道菌群影響IGF-1水平的中間介質，Yan等[26]的研究將常規小鼠用抗生素(廣譜抗生素或萬古霉素)治療后，小鼠盲腸中SCFAs的濃度顯著降低，血清IGF-1、PINP水平顯著下降。繼而在抗生素水中添加SCFAs進行4周處理后，SCFAs補充劑將小鼠體內的循環IGF-1水平恢復至非抗生素治療的小鼠水平，但骨小梁和骨量降低，血清胰島素樣生長因子結合蛋白3沒有變化，表明SCFAs可能增加了小鼠游離的IGF-1水平，IGF-1對骨代謝的作用類似于短期定植。因此，他們做了進一步實驗，發現SCFAs補充劑處理的小鼠體內肝臟和脂肪組織IGF-1水平升高。這表明腸道微生物群影響骨骼形成的一種機制是通過非消化性纖維生成SCFAs，直接或間接作用于宿主的肝臟和脂肪組織，促進宿主循環IGF-1的產生并調控機體的骨代謝。以上研究結果表明，SCFAs可以提高IGF-1水平，但腸道菌群短期定植和長期定植的小鼠骨小梁卻有顯著的差異，其中原因是否是由IGF-1分泌導致，或者是否存在其他的分泌物影響骨代謝，還需要進一步的探討。

3.2 胰高血糖素樣肽-1

GLP-1是一種氨基酸激素，由腸L細胞以酰胺肽的形式分泌。相關研究已證明GLP-1能促進骨形成，抑制骨吸收，能增加骨密度和改善骨質量。在促進骨形成方面，GLP-1與GLP-1受體結合后，激活蛋白激酶A，經由骨陷窩細胞上的Wnt/β-catenin通道介導，使骨陷窩分泌的硬化蛋白水平降低，對骨形成標志物堿性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型膠原合成抑制減弱，從而促進骨形成[27]。在抑制骨吸收方面，GLP-1與GLP-1受體結合后，破骨細胞的數量降低，骨吸收的標志物下降[28]。另外，研究顯示，GLP-1受體表達于甲狀腺C細胞，并能由cAMP介導促進降鈣素的分泌，從而間接抑制骨吸收[29]。

腸道菌群的代謝物SCFAs會影響GLP-1的分泌，影響成骨細胞和破骨細胞的活性從而影響骨代謝。眾所周知，SCFAs主要與腸道內分泌L細胞上的SCFAs受體FFAR2(GPR43)、FFAR3(GPR41)結合，促進GLP-1的分泌[30]。Psichas等[31]用生理濃度的丙酸注入到野生型小鼠的結腸中，發現實驗組小鼠體內的GLP-1水平明顯高于用生理鹽水處理的小鼠體內的GLP-1水平。繼而用丙酸處理FFAR2[-]小鼠，發現野生型小鼠體內的GLP-1水平明顯高于FFAR2[-]小鼠。說明SCFAs是通過與G蛋白偶聯受體FFAR2、FFAR3結合影響GLP-1的分泌。Tolhurst等[32]研究發現，SCFAs與L細胞上的SCFAs受體結合后，L細胞中Ca2+水平增加與GLP-1分泌增強之間存在直接聯系。除此之外，SCFAs似乎還可以通過上調胰高血糖素原以及前激素轉化酶1的表達來增加GLP-1的合成[33]。然而，Arora等[34]研究發現，GF小鼠體內的GLP-1分泌水平比常規飼養小鼠高2倍以上。腸道菌群定植的小鼠體內SCFAs水平較GF小鼠SCFAs水平高，但抑制L細胞的數量。Zhao等[35]做了進一步的研究，表明SCFAs驅動腸上皮細胞中蛋白質蛋白質O連接N-乙酰葡萄糖胺糖基化(O-GlcNAcylation)的水平，負調節L細胞發育。他們用廣譜抗生素(慶大霉素、萬古霉素、新霉素等)治療C57BL/6小鼠2周，通過16 s RNA測序發現小鼠體內腸道微生物群多樣性顯著下降，SCFAs的分泌水平顯著降低，同時伴有結腸O-GlcNAcylation水平的下降。此外，給小鼠口服SCFAs(乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽)的混合物之后，可以明顯恢復小鼠結腸O-GlcNAcylation水平。他們做了進一步的實驗，用OSMI-1(O-GlcNAcylation抑制劑)處理小鼠，發現可以逆轉SCFAs對GLP-1的抑制作用，增加了GLP-1的分泌。這些結果表明，SCFAs通過促進蛋白O-GlcNAcylation水平來抑制腸道L細胞的數量，從而影響腸道L細胞分泌GLP-1。同樣，Larraufie等[36]研究也發現，SCFAs特別是丙酸鹽、丁酸鹽都會抑制小鼠體內L細胞的數量，從而抑制GLP-1的分泌，從而影響骨代謝。出現以上差異的原因可能是由多方面導致的，不能排除其他微生物與宿主相互作用引起GLP-1水平的變化，或者SCFAs在與機體相互作用時，是否衍生出其他代謝物或信號分子來影響GLP-1的變化，還需要進一步探討SCFAs影響GLP-1分泌的內在機制。除此之外，法尼醇X受體也參與SCFAs誘導的GLP-1水平分泌。法尼醇X受體的激活，使FFAR2基因表達下調，抑制GLP-1水平的分泌,從而影響骨代謝[37]。

4 結語

在SCFAs通過免疫機制調節骨代謝方面，研究認為保持TH17細胞和Treg細胞之間的平衡狀態是調節骨代謝的重要因素。TH17細胞分泌增加會促進骨吸收。Treg細胞通過激活Wnt10b信號通路有助于骨形成，還可以下調破骨細胞代謝的重編碼過程抑制骨吸收。SCFAs能促進CD4+T細胞更多的向Treg細胞分化，并減少其向TH17細胞的分化，這有助于機體骨量的健康。SCFAs能促進CD8+T細胞的代謝，從而大量表達OPG，通過RANKL/RANK/OPG通路直接或間接調控骨代謝。SCFAs可以影響mTOR轉錄因子的表達，通過TSC1/mTOR/AKT信號轉導途徑控制RANKL/OPG比率，從而調節破骨細胞的水平，參與骨代謝的調節。在SCFAs通過內分泌環境調節骨代謝方面，SCFAs能促進宿主循環IGF-1水平的增加，并調控機體的骨代謝。SCFAs是通過與G蛋白偶聯受體FFAR2、FFAR3結合影響GLP-1的分泌，另外，SCFAs似乎還可以通過上調胰高血糖素原以及前激素轉化酶1的表達來增加GLP-1的合成，GLP-1分泌增加能促進骨形成，抑制骨吸收，從而影響機體的骨代謝。

綜上所述，本文就SCFAs如何通過免疫機制、內分泌環境影響骨代謝作了進一步的闡述。對于免疫機制，目前研究較多的是T細胞和B細胞；對于內分泌系統，目前研究較多的是IGF-1和GLP-1，它們都會對成骨細胞和破骨細胞的增殖和分化產生影響。隨著科學技術的不斷進步，SCFAs通過影響免疫機制、內分泌環境發揮調控骨代謝的作用已經取得了一些進步，但是這一領域仍然存在一些有待解決的問題。例如，SCFAs影響GLP-1分泌水平調節骨代謝的過程中，一部分研究者表明SCFAs可促進GLP-1分泌，另一部分研究者表明SCFAs抑制GLP-1分泌，不同研究者出現相對立的研究結果，這都需要進一步探討SCFAs影響GLP-1分泌的內在機制。進一步研究這些機制將從SCFAs途徑防治骨質疏松提供堅實的理論基礎。