CRISPR/Cas9系統簡介及其在瘧原蟲研究中的應用進展

崔令花 綜述，喬繼琛 審校

江西中醫藥高等專科學校，江西撫州 344000

成簇規律間隔短回文重復序列/Cas關聯蛋白9(CRISPR/Cas9)系統改造的基因編輯技術是繼鋅指核酸酶基因編輯技術和類轉錄激活因子效應物編輯技術后迅速發展起來的第3代基因編輯技術[1]。CRISPR/Cas9系統具有操作設計簡單，突變效率高，成本低廉等優點，迅速超越以往技術，成為當前最熱門的定點基因編輯工具。CRISPR/Cas9基因編輯技術已經在多種動植物細胞中成功應用，包括哺乳動物類甚至人類的細胞。目前已經報道在弓形蟲、瘧原蟲、隱孢子蟲、新桿狀線蟲、克氏錐蟲、利什曼原蟲等寄生蟲領域均有應用。瘧原蟲是瘧疾的病原體，瘧疾至今仍是全球面臨的傳染性疾病，因此，CRISPR/Cas9基因編輯技術被廣泛應用于瘧原蟲的研究。CRISPR/Cas9系統被《科學》雜志評為2013年度最重要的科學突破之一，JENNIFER和EMMANUELLE 2位技術先驅共同獲得了2020年諾貝爾化學獎的殊榮[2]。本文闡述了CRISPR/Cas9系統的發現、分類、作用機制等，重點分析在瘧原蟲研究領域的應用，希望能夠為瘧原蟲的基因修飾及其預防治療提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統簡介

1.1CRISPR/Cas9 系統的發現 最早在1987年，CRISPR由日本科學家在大腸埃希菌中發現，隨后在其他一些細菌的研究中這種類似基因結構也被陸續報道[3]。2002年，JANSEN等[4]將CRISPR序列正式命名為CRISPR，基因編碼的各類蛋白質統稱為CRISPR附屬蛋白(Cas蛋白)。2005年，3個研究小組同時發現了CRISPR 序列中的間隔序列與宿主菌的染色體外遺傳物質具有高度同源性[5-7]，推測其功能可能與細菌抵抗外源遺傳物質入侵有關[6]。MARRAFFINI等[8]在研究中發現，在細菌中CRISPR系統具有對抗噬菌體入侵，阻止外源質粒轉移的作用，并驗證了CRISPR系統的功能。2011年，DELTCHEVA等[9]揭示了CRISPR/Cas9系統的分子機制。2013年，CONG等[10]報道了CRISPR/Cas9系統可高效編輯基因組，實現了對小鼠細胞部分基因及人類細胞基因編輯，標志著CRISPR/Cas9 系統又一次革命性的飛躍，開啟了基因編輯的新紀元。

1.2CRISPR/Cas9 系統的分類 CRISPR系統共分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種類型[11]。3種類型均可以切割抵抗外源DNA入侵，均由Cas蛋白發揮切割作用，目前僅有Ⅱ型系統被開發利用，Ⅰ型系統中的Cas蛋白既復雜又多，Ⅲ型次之。CRISPR系統在發揮作用的過程中大概分為獲得適應、轉錄表達、干擾切割3個階段。在Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR系統中均有原間區相關基序即PAM 區。在適應階段識別外源DNA原間隔的時候，PAM區起重要作用。Ⅲ型CRISPR系統特有Cas10蛋白，主要作用是參與CRISPR RNA(crRNA)成熟、切割外源入侵的DNA[12]。Ⅱ型是CRISPR系統中最簡單的一類，僅包含4個Cas蛋白基因(Cas9、Cas1、Cas2、Cas4)，其中Cas9是最具特色的蛋白。Cas9蛋白相對分子質量較大，其作用與Cas10蛋白類似，既可以加工促進crRNA前體(pre-crRNA)成熟，又可以切割降解外源DNA[13]。在Ⅱ型CRISPR系統中，由Cas9核酸酶、crRNA、反式激活的 crRNA(tracrRNA)、核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)4種成分一起即可發揮作用，在此系統中，先由CRISPR序列的基因轉錄生成pre-crRNA，然后tracrRNA、tracrRNA與pre-crRNA的重復序列匹配；pre-crRNA會在RNaseⅢ及Cas9蛋白等作用下形成成熟的crRNA。crRNA-tracrRNA結構會與Cas9核酸酶一起形成一個復合體，介導Cas9蛋白對與間隔序列匹配的DNA序列進行切割[14]。

1.3CRISPR/Cas9 系統的作用原理及應用 2012年，JENNIFER和EMMANUELLE 2位科研技術先驅以化膿性鏈球菌作為基礎進行研究發現，其Ⅱ型CRISPR系統在發揮作用的過程中，成熟后的crRNA-tracrRNA可以指引Cas9核酸酶在目的基因發揮作用引起DNA雙鏈斷裂[15]。如果將crRNA-tracrRNA人工融合成一條單向向導的RNA，包含與目的DNA互補的20個堿基以上序列及與Cas9結合所需的二級結構序列，這段RNA序列依舊可以介導Cas9核酸酶尋找靶基因進行切割。后來，這段人工合成的RNA序列就是通常所說的向導RNA(sgRNA)，這一研究成果讓細菌的天然免疫系統轉變成了一種基因修飾工具。

近年來，CRISPR/Cas9系統已經廣泛應用于細菌、酵母、番茄、擬南芥、大米、小麥、高粱、青蛙、果蠅、蠶、斑馬魚等物種的基因編輯中，以及哺乳動物類的鼠、兔，甚至成功用于人類細胞的基因編輯。CRISPR/Cas9系統后來又被科研人員進行了多種改造，如dCas9、RCas9、nCas9等。dCas9是將Cas9蛋白進行突變，使其內切酶活性喪失而不具備切割作用。dCas9依舊保持在gRNA引導下與靶基因DNA序列結合的能力，特異性干擾轉錄延伸，阻礙RNA聚合酶結合或者是干擾轉錄因子結合，進而實現抑制基因的表達[16]。RCas9主要是針對RNA進行編輯和分析，nCas9是針對DNA的單鏈進行切割，可以分別在2條單鏈進行特定的編輯改造，同時單鏈設計sgRNA還可以起降低脫靶率的效果[17]。鑒于CRISPR/Cas9基因編輯技術的逐步成熟，該系統在寄生蟲領域也被廣泛應用，特別是在瘧原蟲研究中取得了較大進展。

2 CRISPR/CAS9系統在瘧原蟲中的應用

瘧疾每年大約引起2.19億人感染，66萬人死亡，全球有33億人受到瘧疾的威脅。自2017年以來，我國已連續5年無瘧疾本土病例發生，但輸入性瘧疾病例逐年增多，因此，我國面臨的瘧疾預防和控制壓力依然很大。在全球范圍內，形勢最嚴峻的就是惡性瘧原蟲，而缺乏疫苗和藥物抵抗是消除瘧疾的主要障礙。CRISPR/Cas9基因編輯技術可以幫助了解瘧原蟲基因的功能，為后續疫苗研究和抗瘧藥物篩選奠定基礎。

2.1人體瘧原蟲研究 感染人體的瘧原蟲有5種，其中對人體危害最大的就是惡性瘧原蟲，因此，CRISPR/Cas9系統在惡性瘧原蟲的研究最為廣泛。最早在人體瘧原蟲中使用CRISPR/Cas9系統的是法國的研究人員，率先嘗試惡性瘧原蟲的基因敲除和基因定點編輯[18]。在惡性瘧原蟲抗性株中，敲除了組氨酸豐富蛋白質編碼kahrp基因和egfp基因，證明了CRISPR/Cas9系統可以在惡性瘧原蟲中工作，說明此系統是一種高效率的基因編輯工具。與此同時，WAGNER等[19]應用CRISPR/Cas9系統針對kahrp基因和eba-175基因進行敲除，實現高效率的基因中斷可快速構建轉基因的寄生蟲，這是CRISPR/Cas9基因編輯技術在瘧原蟲領域的最早嘗試。

隨后，CRISPR/Cas9系統在瘧原蟲中的應用如雨后春筍般鋪展開來。有研究者對CRISPR/Cas9系統的質粒進行改良，并成功用于惡性瘧原蟲的基因編輯，為后續的連續基因操作和大基因敲除等研究奠定了堅實的基礎[20-21]。除了對基因進行敲除改造外，研究者還通過CRISPR/Cas9系統在惡性瘧原蟲基因組上融合GFP的基因片段，構建了會發出綠色熒光的新蟲株[22]。有研究顯示，通過CRISPR/Cas9系統對瘧原蟲基因編輯可以制造新的耐藥位點，為研究瘧原蟲耐藥性提供了參考[23-24]。還有研究者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對惡性瘧原蟲的基因組進行改造，添加了STK等多段序列，為后續瘧原蟲抗體研究奠定了基礎[25]。好的sgRNA是基因編輯的關鍵，如果引導RNA不合適就不可能正確完成基因編輯，2018年全球基因數據庫問世，為后續快速優質選擇sgRNA提供了參考[26]。這些研究成果對進行瘧原蟲基礎醫學方面的研究，以及臨床預防和治療均有較高的參考價值。

2.2鼠類瘧原蟲研究 鑒于瘧疾的流行主要是通過按蚊在人群中傳播，有科研工作者在亞洲斯氏按蚊進行人類瘧疾受體的改造[26]。應用CRISPR/Cas9系統插入2個基因，一個是抵抗惡性瘧原蟲的基因，另一個是標志基因。文獻[27]雖然沒有直接利用Cas9對瘧原蟲進行基因改造，但是也為消除瘧疾的目標做出了很大的幫助，展示了CRISPR/Cas9系統的強大性，同時也豐富了對寄生蟲的研究思路。

由于惡性瘧原蟲的體外培養成本較高，加上對技術和實驗室的硬性條件也有限制，進行大批量和廣泛試驗有一定難度。因此，鼠瘧是利用小鼠模型來進行瘧疾研究的最佳選擇，國內廈門大學袁晶的團隊運用CRISPR/Cas9系統對小鼠約氏瘧原蟲進行了基因修飾[28]。后來，該團隊又通過質粒改造成功對約氏瘧原蟲同時進行多個基因編輯，這大大加快了基因功能、瘧原蟲發育情況和瘧疾發病機制的研究[29]。目前對于約氏瘧原蟲基因編輯成果顯著，有研究者構建新的轉基因蟲株，有研究者制造新的突變位點，還有人嘗試對約氏瘧原蟲AP2整個基因家族進行敲除，都極大地豐富了對CRISPR/Cas9基因編輯技術及瘧原蟲基因功能的認識[30-31]。當然還有多個團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對于伯氏瘧原蟲進行基因編輯，充分展示了CRISPR/Cas9系統的實用性[32-33]。目前，在國內已經有多個瘧疾實驗室均可以用CRISPR/Cas9基因編輯技術對瘧原蟲進行基因編輯，多篇碩士、博士畢業論文詳細闡述了研究生使用CRISPR/Cas9系統對瘧原蟲基因編輯的實驗過程[34]，這充分展示了CRISPR/Cas9系統強大的基因修飾能力和實用性。

3 CRISPR/Cas9系統存在的不足與對策

目前來看，制約CRISPR/Cas9系統應用和發展的主要因素是脫靶效應。在設計sgRNA的時候，sgRNA對目標基因處的序列進行匹配的同時，有些不完全與sgRNA匹配的序列也存在因錯配引起被切割的風險，這就是Cas9允許錯配導致的脫靶效應。因為Cas9允許嚴重的基因錯配，使借助sgRNA的末端NGG處引發DNA序列切割，導致序列任意切割，嚴重損壞了基因組的完整性，使細胞、寄生蟲的基因組發生不可預測的堿基序列突變、重排，甚至引起細胞死亡。因此，避免或者減少脫靶效應是很有必要的。科研工作者通過篩選sgRNA的特異性，針對目的基因序列的2條單鏈分別設計sgRNA，以及改造Cas9序列來減少脫靶效應。有研究顯示，通過串聯sgRNA可以降低CRISPR/Cas9系統的脫靶效應風險[35]。在瘧原蟲領域的應用，除了面臨脫靶效應的風險外，還因瘧原蟲基因序列A、T堿基序列較多，為基因編輯帶來諸多困難。目前CRISPR/Cas9基因編輯技術只是單純的基因修飾和改造，對于基因功能分析有指導意義，還不能明確應用到臨床預防和治療方面，以及脫靶性不確定因素還需要繼續研究。

4 展 望

自從CRISPR/Cas9系統被當作一種基因編輯工具從細菌的固有免疫系統中解放出來，到今天的廣泛應用并取得飛速的進展，是一場基因編輯的革命，CRISPR/Cas9基因編輯技術迅速超越并逐步淘汰了以往的基因編輯技術，為逐個基因的功能研究及大批量的基因篩選提供了有力支持，使各個領域的基因研究取得了豐碩的成果。CRISPR/Cas9系統在瘧原蟲領域的應用，雖然已經取得了很大的成果，對明確基因功能、篩選抗藥基因及發現其致病性等方面均提供了依據，但目前CRISPR/Cas9基因編輯技術還只是單純的基因修飾和改造，而且面臨著脫靶效應的問題，還不能明確應用到臨床預防和治療方面，還需要繼續研究。況且CRISPR/Cas9基因編輯技術還面臨著倫理道德的討論，雖有報道稱其已經成功應用到臨床器官移植方面的研究，但對于人類胚胎的基因編輯依然存在倫理道德與安全性的壓力。期待隨著CRISPR/Cas9系統的逐步改進，會更有利于對未知基因功能的研究，也期待CRISPR/Cas9基因編輯技術有更廣闊的應用前景。