miRNAs作為糖尿病腎臟疾病早期生物標志物的可行性及作用機制

邢晨皓，唐紅悅，趙子今 綜述，盧亞敏審校

1.河北北方學院研究生學院，河北張家口 075000；2.河北省人民醫院核醫學科，河北石家莊 050051

糖尿病腎臟疾病(DKD)是一種以持續性蛋白尿和腎功能進行性下降為特征的臨床綜合征，是一種典型的腎小球疾病，發病率逐年上升，已成為終末期腎病最常見的原因[1]，也是近幾年暴發的新型冠狀病毒感染嚴重結局的一項危險因素[2]。蛋白尿是目前臨床上評估和監測腎功能的指標之一，但是約有1/3的患者在蛋白尿發生前就已存在腎功能下降，因而僅檢測蛋白尿不足以監測DKD的發病率和進展[3]。事實上腎臟穿刺活檢仍然是正確診斷DKD的金標準，但其為有創檢查，不能被患者廣泛接受，而且不能完全做到早期診療，它通常局限于顯示非典型臨床表現的病例。因此，DKD的診斷仍然具有挑戰性，迫切需要高特異性、快速、非侵入性的生物標志物來診斷DKD[4]。微小核糖核酸(miRNAs)是普遍存在的內源性非編碼單鏈RNA轉錄物，最常見的長度為19～25個核苷酸，通過阻斷蛋白質翻譯和/或誘導信使RNA降解作為基因表達的轉錄后調節物。有研究結果表明，miRNAs通過提供復雜的反饋系統來保持基因表達的穩定性，從而影響心臟、腎臟、脂肪和免疫組織中的干細胞活性[5]，并且在血液和尿液中穩定存在，其水平的高低影響疾病的進程，由此表明miRNAs有可能成為DKD的早期生物標志物。

1 miRNAs作為DKD早期生物標志物的可行性

眾所周知，持續性高血糖是糖尿病并發癥的主要誘因，有研究報道顯示，不同濃度的葡萄糖對腎小球內皮細胞中miR-21表達水平的影響不同，提示腎小球內皮細胞miR-21表達水平明顯上調，且miR-21的表達水平隨葡萄糖濃度升高而逐漸升高，高濃度葡萄糖對miR-21表達水平的影響呈時間依賴性[6]。由此得出，檢測血清miR-21表達水平將為DKD早期腎小球內皮細胞損傷的診斷和臨床腎臟功能受損情況的評估提供更敏感而可靠的依據。

miR-638在DKD中表達水平下調，LIN等[7]研究證實，miR-638低表達可以將DKD患者與2型糖尿病患者及健康對照者區分開來，因此，miR-638可以作為DKD早期診斷的生物標志物。此外，miR-638可能通過調節增殖和炎癥參與DKD，為DKD的治療提供新的治療靶點。JIA等[8]評估了在腎臟中呈高度表達的幾種miR(miR-192、miR-194和miR-215) 在DKD早期診斷中的作用，比較了不同程度蛋白尿的2型糖尿病患者尿液中miR-192、miR-194和miR-215的表達水平，與微量清蛋白尿組比較，這3種miRNAs的表達水平均明顯增加，且miR-192在區分正常清蛋白組和微量清蛋白組方面優于miR-194和miR-215；人腎小管上皮細胞暴露于高濃度葡萄糖會增加細胞上清液囊泡miR-192、miR-194和miR-215的表達水平，表明這些標志物是一種潛在的內源性來源，因此，可作為DKD早期診斷的生物標志物。

在對2型糖尿病患者的研究中發現，無論正常蛋白尿還是過量蛋白尿患者，血清和尿液中白細胞介素(IL)-1α、IL-8、IL-18與miRNA譜之間均存在顯著相關性，miRNA-125a直接調控IL-6R，被認為參與了DKD的發病機制[9]。miRNA-126表達水平隨著蛋白尿加重而下調，在早期階段不能維持內皮細胞功能的完整性，與腎臟結構的改變密切相關。有研究報道血液中miR-377和miR-192作為DKD生物標志物的可能性，其受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析結果顯示這兩種miRNA能夠明顯區分DKD患者和健康受試者，具有區分正常清蛋白尿和微量清蛋白尿/大量清蛋白尿的能力，并且miR-377表達水平隨著清蛋白尿的嚴重程度加重而增加[10]。由此表明，在DKD早期血液中miR-377的表達水平就已經發生了變化，可以較早地提示DKD發生，可以作為DKD早期診斷的生物標志物。

2 miRNAs在DKD中的作用機制

導致DKD發生和發展的因素有很多種，其中高血糖狀態是DKD發生和發展的基礎環節,脂代謝紊亂是DKD發生的重要危險因素，炎癥和氧化應激激活是DKD病變的直接誘因。

2.1miRNAs與糖、脂代謝 近年來，miRNAs已被證明在糖代謝調節的所有生理和病理過程中發揮關鍵作用，包括胰島素利用、葡萄糖攝取和胰島素分泌。miRNAs可能是維持葡萄糖穩態有希望的靶點[11]。miR-21可以通過靶向叉頭框蛋白O1(FoxO1)通路介導的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶下調來降低糖異生，并且靶向3T3-L1脂肪細胞中的磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)，導致胰島素信號通路中PI3K-Akt激活的改變。miR-33a和miR-33b調節胰島素受體底物(IRS)-2的表達，可以進一步影響信號網絡中的下游蛋白，包括FoxO1細胞質定位和蛋白激酶B磷酸化(Akt磷酸化)。miR-155可以增強轉基因小鼠肝臟、脂肪組織和骨骼肌中的糖酵解、IRS-1磷酸化和胰島素刺激的Akt[12]。miR-185-5p通過靶向其 3′-非翻譯區直接抑制葡萄糖6磷酸酶表達，抑制db/db小鼠肝糖異生和減輕高血糖作用。

有研究結果表明，miRNAs在調節脂質代謝中起至關重要的作用[13]，過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)是脂質代謝的關鍵調控因子，糖尿病大鼠腎組織中miR-21表達水平明顯升高，PPAR-α mRNA的表達水平明顯降低，miR-21通過調控炎癥因子(IL-6和IL-18)及凋亡蛋白Bax途徑，進而抑制下游靶基因PPAR-α的表達水平，從而促進脂質代謝紊亂，加劇細胞炎癥與凋亡反應。

2.2miRNAs與炎癥 有研究報道顯示，高血糖誘導的miR-467a-5p可以抑制與調節炎癥有關的血栓反應蛋白-1產生[14]。給小鼠注射miR-467a-5p拮抗劑，抑制miR-467a-5p可導致脂肪組織中巨噬細胞浸潤增加，脂肪組織中IL-6水平升高，血漿胰島素水平升高和葡萄糖清除率降低；miR-467a-5p通過靶向血栓反應蛋白-1來調控炎癥。miRNAs在DKD發展過程中的調節作用尤為突出[15]，在不同嚴重程度的DKD中，miRNAs通過PTEN、PI3K/Akt和絲裂原活化蛋白激酶通路對轉化生長因子(TGF)-β進行調節，從而控制不同炎癥程度的表達。高糖通過己糖胺生物合成途徑代謝介導細胞外基質的產生和炎癥通路激活，刺激腎臟細胞中的TGF-β轉錄活性增加；同時己糖胺生物合成途徑產生活化的氨基糖UDP-N-乙酰基葡萄糖胺，催化蛋白質葡萄糖胺糖基化，影響一系列細胞過程，包括炎癥、新陳代謝、運輸和細胞骨架組織，在DKD的發展中起作用[16]。

有研究發現，miR-192在正常腎皮質中富集，且miR-192可能是腎臟病理改變過程TGF-β1/Smads信號傳導通路的重要下游介質[17]，所以miR-192對TGF-β1/Smads 炎癥信號通路具有調控作用。在DKD腎組織和高葡萄糖刺激的足細胞中miR-770-5p表達水平上調[18]，敲低miR-770-5p可以抑制足細胞凋亡和炎癥，表明miR-770-5p可能是DKD的潛在治療靶點。

晚期糖基化終產物(AGEs)/高級糖基化終產物受體相互作用可觸發活性氧(ROS)生成并激活下游信號通路，誘導內皮祖細胞凋亡，AGEs在體內積累會引起一系列氧化應激反應及炎癥[19]。有新的證據表明，miRNAs與DKD中AGEs介導的病理改變有關,經AGEs處理的內皮細胞通過上調RhoA/ROCK2信號通路抑制miR-200b/miR-200c的表達[20]。miR-92b-3p在AGEs對大鼠DKD模型中的表達水平變化最為明顯，miR-92b-3p可以與AGEs介導的Smad7的非編碼區相互作用，使Smad7成為DKD相關的miRNAs的下游靶點[20]。

在DKD大鼠組織和高葡萄糖處理的腎小管上皮(HK)-2細胞中均發現miR-365的表達水平升高[21]。miR-365可調節腦源性神經營養因子中的原肌球蛋白相關激酶B信號軸誘導DKD纖維化。而沉默miR-365抑制了HK-2細胞中細胞外基質(ECM)成分的積累和炎癥細胞因子的分泌，敲低miR-365可抑制脊髓性肌萎縮癥，降低膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1、腫瘤壞死因子-α和IL-6水平，由此表明敲低miR-365可抑制腎纖維化。

2.3miRNAs與氧化應激 miR-377在DKD的體外和體內模型中均被證實為過度表達，其水平增加抑制了p21活化激酶和錳超氧化物歧化酶1、2的翻譯，并增強了纖維連接蛋白產生[22]，其成分的增加可導致系膜基質增多、系膜區擴張,最后導致彌漫性腎小球硬化和間質纖維化。有研究報道顯示，miR-4449水平在DKD患者血清外泌體中呈高表達，通過調控IL-1β和IL-18水平，以及ROS水平和焦亡，從而在DKD的發病機制中起關鍵作用[23]。此外，無論在DKD患者還是HK-2細胞中癌癥超甲基化1(HIC1)蛋白的表達與miR-4449的表達均呈負相關，HIC1通過調控炎癥和miR-4449/HIC1通路促進細胞焦亡和氧化應激。

miR-21在對照組、DKD早期和中晚期表達水平依次降低，各組間均有明顯差異，miR-21與氧化應激指標丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、高級氧化蛋白質產物及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)均呈負相關，與血紅素加氧酶1呈正相關，進而使腎臟組織遭受氧化應激損傷,最終表現在氧化應激指標水平明顯異常[24]。miR-21參與發病進程的具體機制主要可能是由PTEN/Akt、TGF-β/Smads及基質金屬蛋白酶等有關信號途徑而實現，再次證實血清miR-21與其機體的氧化應激反應聯系緊密。同樣也有相似報道顯示，DKD患者miR-21與SOD、MDA、NOX4、胱抑素C均有明顯相關性，且ROC曲線分析結果顯示miR-21有較高的靈敏度和特異度[25]，由此提示，miR-21對早期DKD的診斷有較好的價值，其與糖尿病患者腎功能損傷、氧化應激狀態具有密切關系。

有報道顯示，miR-205協同高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在DKD發生和發展中起重要作用[26]，HMGB1被鑒定并證實是miR-205的靶標，miR-205通過靶向HMGB1對高葡萄糖誘導的細胞損傷起保護作用。過表達miR-205 或敲低脂蛋白受體6可抑制核因子κB信號通路，進一步調節高葡萄糖誘導的系膜細胞增殖、氧化應激、ECM積累和炎癥。

3 小 結

盡管DKD的發生機制還未完全闡明，但miRNAs的發現為DKD的分子水平研究提供了新的方向。miRNAs與DKD的關系還需要更多的臨床研究來證明，對miRNAs的深入研究及相關作用機制靶點的認識與探索，將為DKD的早期診斷和治療帶來新的思路和方法。