運動促SCFA生成調控Wnt信號通路增加骨形成的研究

鐘 麗，陶小平，張志斌

（廣州工商學院，廣東 廣州 510800）

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以機體骨量減少、骨小梁數量減少、變細、斷裂，同時骨皮質變薄、孔數增多為主要特征的衰老表現，與骨脆性增加、骨折風險增高密切相關，是臨床中骨科的多發病之一［1-2］。我國60歲以上人群中OP發病率可達50%以上，50歲以上的女性中，約25%患有OP，同時由OP而引起髖關節骨折的男性約為40%［3］。骨主要承擔支撐身體、保護內臟器官的作用，同時參與Ca代謝。在機體的全生命周期中，骨組織受內環境及遺傳、運動、生活方式等外界因素的影響，呈動態變化［4］。一方面，破骨細胞持續吸收骨，同時成骨細胞持續生成骨，維持動態平衡。人體的骨量在生長期時逐漸增加，在25歲成熟期時達到峰值，此后隨年齡的增加而逐漸降低。研究表明，運動產生的力學刺激可以有效調節骨發育，對骨生長和骨形狀、強度等解剖學結構產生影響，進而預防的OP發生［5］。 目前研究已知，Wnt通路、Notch通路、MAPK通路及Hedgehog通路是調節骨代謝的主要通路［6-7］，其中Wnt通路起主導作用，可通過減少細胞凋亡、促進骨細胞生成進而促進骨結構恢復，增加骨量。而研究證實，短鏈脂肪酸（Short Chain Fat Acid，SCFA）對OP可起到較好的防止作用，且運動可影響SCFA的表達，此外SCFA的表達與Wnt通路的激活有關?；诖吮尘?，本研究通過給予OP大鼠運動干預，探究運動對SCFA及Wnt通路的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物與主要儀器、試劑

1）實驗動物：選取SPF級雌性SD大鼠共45只，體重200±20g，購于中國科學院上海實驗動物中心，許可證號SCXK（滬）2008-0016。 每籠5只，常規喂養。 室溫（20±1）℃，遵循12h/12h晝夜交替，室內保持通風良好，自由進食進水。

2）主要實驗儀器：雙能X線骨密度儀器 （GE Lunar Prodigy，美國）；全自動組織脫水機（櫻花公司，日本）；組織包埋機（美康EC-350，德國）；電子萬能試驗機（INSTRON，美國）；熒光攝像系統（Leica，德國）；冷凍離心機（Eppendorf，德國）；

3）主要試劑：3%戊巴比妥鈉；定量試劑盒 （大連TAKARA，中國）；PCR引物（上海生工，中國）；反轉錄試劑盒（大連TAKARA，中國）。

1.2 動物分組與造模

將45只雌性SD大鼠按照隨機數字表法，隨機分為對照組、假手術組與實驗組，每組各15只。對照組與實驗組采用去卵巢法建立骨質疏松模型。將大鼠依照35mg/kg劑量注射戊巴比妥麻醉后，從腹正中線暴露腹腔，結扎雙側卵巢后依次縫合肌肉和皮膚。假手術組在打開腹腔后，僅切術卵巢周圍部分脂肪組織，隨后縫合皮膚。各組大鼠在造模后，于臀肌處注射慶大霉素（0.01ml/kg），連續注射3天。

1.3 干預方法

對照組大鼠與假手術組大鼠僅進行常規喂養，無運動干預。

實驗組大鼠進行跑臺運動干預：跑臺設定速度為0.8km/h，坡度為0°，每次訓練30min，每周訓練5天，共進行12周訓練。

1.4 實驗指標

1.4.1 大鼠一般情況比較

造模后1d，觀察記錄各組大鼠的精神狀態、活動狀態、毛發光澤度、飲水、睡眠、排便排尿情況。

1.4.2 骨密度測定

參考文獻的方法以L2作為骨密度和骨組織形態學的研究對象。

將大鼠麻醉后（7%水合氯醛，腹腔注射0.5ml/100g），斷頭處死。取出大鼠L2椎體和右側股骨，將軟組織清理干凈后，采用骨密度測量儀測定其骨密度。

1.4.3 骨組織形態學觀察

取大鼠L2椎體，軟組織清除干凈后，選用4%多聚甲醛液固定48h，隨后用14%EDTA液脫鈣處理2周，并進行脫水、透明、包埋、切片，制成3～4μm石蠟切面，HE染色處理后于鏡下觀察骨組織形態學變化。

1.4.4 骨生物力學測定

L2椎體骨密度測定完畢后，將棘突、橫圖、軟骨終板、椎板等修剪后，放置于試驗機上進行椎體壓縮實驗，壓縮速率為6mm/min，記錄各組大鼠的彈性模量和最大載荷。

1.4.5 相關mRNA水平

將大鼠左側股骨軟組織清楚后，使用DEPC浸泡的錫箔紙包裹，放入液氮中凍存。檢測時，將樣本從液氮中取出并制成粉末，向樣本中加入TRIzol300μl混勻，靜置5min。隨后加入氯仿0.2ml，混勻后靜置3min。選用高速離心機將樣本以4℃、5 000r/min離心20min，將上層水液取至另一離心管內，加入0.5ml異丙醇后混勻靜置10min，隨后以4℃、5 000r/min離心10min，棄掉上層清液，向樣本內加入75%乙醇1ml，洗滌后以4℃、5 000r/min離心5min，棄去上層清液，室溫下干燥約10min后加入DEPC水20μl溶解。將99μlDEPC加入至1μl樣品中，測定總RNA樣品的濃度和純度。

依照試劑盒說明書，進行逆轉錄：加入2μl第一鏈反應緩沖液、0.5μl逆轉錄酶、總RNA 2μl、Oligo dT引物0.5μl，隨后加入DEPC水補齊至10μl，混勻后靜置20min。隨后85℃加熱15s，與冰水中靜置備用。參考試劑盒操作說明 （大連TAKARA）開始PCR反應：按照94℃5min—94℃15s—60℃50s次序，循環擴增共40次。將β-actin作為內參，對目的基因進行定量。在60℃條件下檢測熒光值進而得出CT值，并計算相對定量。引物基因序列詳見表1。

表1 引物基因序列

1.4.6 SCFA含量測定

收集各組大鼠干預前后的糞便備用。取0.2g樣品置于離心管內，加入0.5ml純水溶解后，旋渦1min后以10 000r/min離心5min，過濾后移入2ml離心管內備用。向離心管內加入50μl 50%的H2SO4溶液，再加入750μl內標溶液，旋渦1min后以10 000r/min離心5min，置于4℃冰箱內冷卻30min，隨后選用氣相色譜分析法樣品中乙酸、丙酸、丁酸含量。選用16S rDNA法對SCFA含量進行測序分析。

1.5 統計學方法

選用SPSS 22.0對數據進行統計分析，計量資料選用均數±標準差表示，組間比較選用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。以p＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

各組大鼠在造模后均無死亡。對照組大鼠出現進食減少、活動減少、毛色失去光澤等表現。假手術組大鼠進食、活動及皮毛光澤無異常表現。實驗組大鼠的進食、活動較對照組有所改善，毛發光澤有所恢復。

2.2 各組大鼠骨密度比較

結果表明，與假手術組大鼠相比，對照組大鼠的L2椎體和股骨的骨密度明顯降低，同時實驗組大鼠的L2椎體密度和股骨的骨密度較對照組大鼠明顯提高，差異均具有統計學意義（p＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠骨密度比較（g/cm2，）

表2 各組大鼠骨密度比較（g/cm2，）

注：與假手術組相比，*p＜0.05；與對照組相比，#p＜0.05；下表同

組別 n假手術組150.165±0.014股骨骨密度 L2椎體0.178±對照組實驗組15 15 0.126±0.009*0.142±0.010#骨密度0.019 0.145±0.016*0.160±0.017#

2.3 各組大鼠骨組織形態學比較

結果表明，對照組小鼠可見骨小梁數目下降，同時骨小梁變薄變細且排列紊亂欠規則，同時骨髓腔擴大伴有微骨折等。假手術組大鼠骨小梁排列整齊規則，無間隙增大的情況。實驗組大鼠的骨小梁排列尚為規則整齊，骨小梁有所變細，且部分區域的骨小梁間隙稍微大。

2.4 各組大鼠骨生物力學比較

結果表明，與假手術組大鼠相比，對照組大鼠的L2椎體彈性模量及最大載荷明顯降低，同時與對照組大鼠相比，實驗組大鼠的L2椎體彈性模量及最大載荷明顯提高，差異均具有統計學意義（p＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠生物力學指標比較（）

表3 各組大鼠生物力學指標比較（）

組別 n假手術組對照組實驗組15 15 15 802.52±209.20 593.13±136.03*750.41±170.31#彈性模量（GPa） 最大載荷（N）192.12±57.05 132.81±41.02*179.18±51.60#

2.5 各組大鼠mRNA表達比較

結果表明，與假手術組相比，對照組大鼠股骨的βcatenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達明顯下降， 而與對照組相比，實驗組大鼠的 β-catenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達明顯升高，差異均具有統計學意義（p＜0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠mRNA表達比較（）

表4 各組大鼠mRNA表達比較（）

組別 n假手術組對照組實驗組15 15 15 1.20±0.18 0.87±0.16 1.22±0.21 β-catenin Lrp-5 2.17±0.40 1.80±0.33 2.12±0.37 Osx 1.15±0.17 0.93±0.09*1.13±0.16#Runx2 1.41±0.15 0.98±0.07*1.36±0.09#

2.6 各組大鼠治療前后SCFA含量比較

干預前，與假手術組相比，對照組、實驗組大鼠的乙酸、丙酸、丁酸含量均下降，干預后，實驗組大鼠的SCFA含量均較干預前升高，明顯高于對照組，差異均具有統計學意義 （p＜0.05）。 詳見表5。

表5 各組大鼠干預前后SCFA含量比較（mmol/l，）

表5 各組大鼠干預前后SCFA含量比較（mmol/l，）

短鏈脂肪酸組別 n乙酸 丙酸 丁酸假手術組15對照組15實驗組15干預前干預后干預前干預后干預前干預后0.68±0.19 0.63±0.13 0.47±0.14*0.33±0.13*0.46±0.15*0.41±0.13#0.26±0.07 0.27±0.06 0.15±0.04*0.14±0.05*0.16±0.05*0.19±0.05#0.25±0.07 0.26±0.06 0.14±0.04*0.13±0.04*0.14±0.05*0.19±0.05#

3 討論

OP是臨床中常見的骨科疾病，以機體的骨結構退化伴有單位體積內骨量下降及骨脆性增加為主要特征，易引起肌力下降、疼痛以及骨折等并發癥［8］。本研究中，對照組大鼠出現明顯的飲食不加、毛發光澤下降等改變，而實驗組大鼠上述癥狀較輕，提示運動可改善OP導致的飲食減退、活動減少等并發癥的發生風險?？紤]這可能與運動改善了大鼠骨質疏松病情進而提高肌力和緩解疼痛有關。早期OP起病較為隱匿，隨著病情進展可出現壓縮骨折、脊柱變形等形態改變，嚴重影響患者的日常生活［9］。OP的發生與機體的遺傳因素、內分泌水平、營養水平、免疫因素及生活方式等密切相關。機體的破骨-成骨是一動態平衡過程，針對這一過程，臨床中常采用加強抗骨吸收、促進骨形成等藥物治療，前者包括降鈣素、雌激素替代療法、選擇性雌激素受體拮抗劑等，后者常選用甲狀旁腺素、胰島素樣生長因子及氟化物等［10］。絕經后OP是原發性OP的一種證型。雌激素在調控骨骼系統中發揮重要作用，當女性絕經后，卵巢功能逐漸衰退，進而導致骨代謝改變［11］。本研究中，選用模擬絕經后的OP模型開展研究。HE染色結果示造模后大鼠出現明顯的OP病理改變，提示造模成功。

同時本研究中HE染色結果顯示，對照組大鼠出現骨小梁排列紊亂、數目下降、骨小梁變薄及骨髓腔增大伴少量微骨折等OP病理性表現，實驗組大鼠上述病理改變有所減輕，骨小梁排列尚整齊規則，間隙略有增加，提示運動能有效的減緩OP進程，改善骨組織形態。骨密度是OP的診斷標準之一，能夠有效的預測骨折風險，也是評價治療效果的參考［12］。雙能X線骨密度測定是一種廣泛認可的定量分析方法。結果表明，實驗組大鼠的骨密度明顯高于對照組，提示運動能有效的改善OP大鼠的骨質疏松狀態，延緩OP大鼠的骨密度下降。OP患者的骨折發生風險較普通人高，骨強度的下降與脆性骨折的發生關系密切，骨強度可有效反饋機體抗骨折的能力［13-14］。本研究中選用生物力學測試比較各組大鼠的骨強度，結果表明，實驗組大鼠的彈性模量與最大載荷均明顯高于對照組，提示運動能有效改善OP大鼠的骨強度，改善其骨生物力學參數，提高抗骨折能力。

Wnt/β-catenin通路是調控骨代謝的重要通路，在調節骨發育、形成、吸收重建中發揮重要作用［15］。β-catenin是Wnt通路的關鍵分子，在成骨細胞分化以及功能形成中發揮重要作用。Lrp-5是Wnt蛋白輔助受體之一，在骨量積累過程中發揮重要作用。Runx2是成骨細胞轉錄中的關鍵轉錄因子，通過上調軟骨細胞和成骨細胞中相關礦化蛋白基因的轉錄進而促進新骨形成［16］。Osx是成骨細胞分化的特異性轉錄因子之一，在骨形成和成骨細胞分化中發揮重要作用，是經典Wnt/βcatenin通路的下游基因［17］。當Wnt識別到輔助受體脂蛋白受體相關蛋白 （Lipoprotein Receptor Related Protein5/6，LRP5/6）后，促進β-catenin向核內遷移并與轉錄因子復合物結合，隨后激活Runx2并促進下游基因表達［18］。本研究結果表明，與假手術組相比，對照組大鼠股骨的 β-catenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達明顯下降，而與對照組相比，實驗組大鼠的βcatenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達明顯升高， 提示運動可能通過激活Wnt/β-catenin通路進而發揮緩解OP相關癥狀、改善OP表現的作用。

SCFA是由腸道有益菌產生的代謝物，既往研究表明，SCFA對OP有較好的防治作用，可以通過抑制破骨細胞分化、促進成骨等途徑進而改善OP相關癥狀。Xie等［19］研究結果顯示，SCFA的表達可靶向調控Wnt/β-catenin的表達。Tindaro［20］等最新一項研究證實，運動可通過調控SCFA的表達進而運動員免疫力和能量代謝過程。本研究結果表明，干預前，與假手術組相比，對照組、實驗組大鼠的乙酸、丙酸、丁酸含量均下降，干預后，實驗組大鼠的乙酸、丙酸、丁酸含量均較干預前升高，明顯高于對照組，提示運動能夠有效提高OP大鼠的SCFA含量，進而發揮改善OP的作用。而運動干預后SCFA含量的增加與Wnt通路的簽在關聯機制仍需進一步研究。

綜上，運動可能通過上調SCFA含量、激活Wnt/β-catenin通路改善大鼠的骨密度度、骨生物力學參數和骨組織形態，繼而改善OP相關癥狀。