Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選貴州產(chǎn)青椒精油提取工藝*

羅忠圣，黎浪，嚴(yán)艷芳，鄭前方，吳紅，徐昌艷，覃容貴△

（1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550014；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州省德江縣民族中醫(yī)院，貴州 銅仁 565200）

花椒為蕓香科植物青椒Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim.的干燥成熟果皮，為常用食品調(diào)味料，且藥食兩用，收載于歷版《中國藥典》，其性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有溫中散寒、除濕、殺蟲、止癢等功效［1］。藥理學(xué)研究表明，花椒具有鎮(zhèn)痛、抗炎、局部麻醉、抗菌等作用［2-3］，主要成分為揮發(fā)油、生物堿、酰胺、黃酮、香豆素、三萜等化合物［4-6］。花椒精油的主要提取方法有有機溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界萃取法等［7-8］，其中水蒸氣蒸餾法所得花椒提取物中揮發(fā)性物質(zhì)種類最多［9］，且操作簡便，故本研究中采用水蒸氣蒸餾法。貴州省德江縣萬進花椒種植專業(yè)合作社創(chuàng)建于2015年，地處德江縣東北部穩(wěn)坪鎮(zhèn)，所產(chǎn)青椒粒大飽滿、香味濃郁、口感良好，于2020 年被評為國家級花椒示范基地。本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取該基地所產(chǎn)青椒的精油，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法考察粉碎粒度、料液比、浸泡時間和蒸餾時間對精油得率的影響，優(yōu)選最佳提取工藝，為貴州省花椒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QE-500 克搖擺式高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；DP-500 mL 磨口揮發(fā)油提取器（南京康洛達實驗科技有限公司）；ZNCL-GS190/90 型智能磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；AL204 型電子天平（梅特勒-托利多＜上海＞有限公司，精度為萬分之一）；Thermo Varioskan LUX 型多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

無水乙醇（分析純，重慶萬盛川東化工有限公司，批號為20201101）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為20220211）；甲醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號為20200611）；青椒樣品于2021 年采自貴州省德江縣萬進花椒種植專業(yè)合作社，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院覃容貴教授鑒定為青椒Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.的干燥成熟果皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

取青椒樣品30 g，用水蒸氣蒸餾法提取精油，并計算得率（%）。精油得率（%）=精油體積（mL）/青椒樣品質(zhì)量（g）×100%。

2.2 單因素試驗［10-13］

粉碎粒度：取青椒樣品，粉碎粒度分別為原藥材（未粉碎，0 目）、20 目、40 目、60 目、80目，分別稱取30 g青椒粉，加入料液比1∶25的純化水，在浸泡時間40 min、提取溫度140 ℃、蒸餾時間60 min 工藝條件下提取，每隔15 min 收集精油，記錄精油體積。每個粉碎粒度平行試驗3次，以確定最佳粉碎粒度。結(jié)果見圖1 A。可見，當(dāng)粉碎粒度由原藥材到40目時，精油得率明顯升高；當(dāng)由40 目升至60 目時，精油得率升高趨勢逐漸平緩；當(dāng)由60目升至80目時，精油得率只增加了0.06%，升高趨勢接近平緩。綜合實際，選擇60目為最佳粉碎粒度。

料液比：稱取粉碎粒度項下粉碎粒度為60目的青椒粉，按料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL）加入純化水，在提取溫度140 ℃、浸泡時間40 min、蒸餾時間60 min 工藝條件下提取，每隔15 min 收集精油，記錄精油體積。每個料液比平行試驗3次，以確定最佳料液比。結(jié)果見圖1 B。可見，料液比從1∶10 到1∶20，隨著料液比的增加，精油得率逐漸升高，隨著料液比的繼續(xù)增加，精油得率逐漸降低，料液比為1∶20時精油得率最高，故選擇1∶20為最佳料液比。

浸泡時間：稱取粉碎粒度項下粉碎粒度為60 目的青椒粉，加入料液比為1∶20 的純化水，分別浸泡0，10，40，70，100 min，140 ℃溫度下蒸餾60 min，每隔15 min收集精油，記錄精油體積。每個浸泡時間平行試驗3次，以確定最佳浸泡時間。結(jié)果見圖1 C。可見，浸泡時間從0 min到40 min，精油得率逐漸升高，隨著浸泡時間的繼續(xù)增加，精油得率逐漸降低，浸泡40 min 時的精油得率最高，故選擇40 min為最佳浸泡時間。

蒸餾時間：稱取粉碎粒度項下粉碎粒度為60 目的青椒粉，在浸泡時間40 min、料液比1∶20 和提取溫度140 ℃條件下，蒸餾45，120，195，270，345 min，每隔15 min 收集精油，記錄精油體積。每個蒸餾時間平行試驗3次，以確定最佳蒸餾時間。結(jié)果見圖1 D。可見，當(dāng)蒸餾時間從45 min 增加到120 min時，精油得率逐漸升高，隨后，精油得率降低并趨于平穩(wěn)，故選擇120 min 為最佳蒸餾時間。

圖1 單因素試驗結(jié)果A.Grinding granule size B.Solid/liquid ratio B.Soaking time D.Distillation time Fig.1 Results of the single factor test

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗［14-16］

試驗設(shè)計：在2.2項下篩選出的最佳單因素試驗條件基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案，以影響顯著的粉碎粒度（因素A）、料液比（因素B）、浸泡時間（因素C）和蒸餾時間（因素D）4 個因素為自變量，以精油得率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計四因素三水平進行Box-Behnken 試驗，確定最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素與水平Tab.1 Factors and their levels of Box-Behnken response surface test

試驗結(jié)果：結(jié)果見表2。采用Design Expert V8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析，得青椒精油得率對上述4 個影響因素的二次多項回歸方程Y=11.57 +0.25A-0.21B-0.21C+0.64D-0.18AB+0.25AC+0.21AD-0.055BC-0.090BD-0.14CD-0.92A2-1.01B2-0.76C2-1.02D2。為驗證回歸方程的有效性，對青椒精油提取的數(shù)學(xué)模型進行方差分析，結(jié)果見表3。該模型F=18.89，顯著性水平P＜0.000 1 ＜0.05，具有顯著性。模型的失擬項F=1.03，顯著性水平P=0.533 7 ＞0.05，不具有顯著性，說明該回歸模型與試驗數(shù)據(jù)擬合度良好，未知因素對試驗結(jié)果干擾小。粉碎粒度（A）、料液比（B）、浸泡時間（C）、蒸餾時間（D）4 個因素對青椒精油得率的影響均顯著（P＜0.05），各因素的交互項對青椒精油得率的影響均不顯著（P＞0.05），各因素的二次項對青椒精油得率的影響均極顯著（P＜0.01）。對精油得率的影響程度為蒸餾時間（D）＞粉碎粒度（A）＞浸泡時間（C）＞料液比（B）。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.949 7，說明預(yù)測值與試驗值有較好的相關(guān)性，故該模型可用于對青椒精油提取條件的分析與預(yù)測。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果Tab.2 Results of the Box-Behnken response surface test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the ANOVA

結(jié)果分析：應(yīng)用Design-Expert V8.0.6 軟件分析試驗結(jié)果，得青椒精油得率與各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖與二維等高線圖（圖2）。在響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭則該因素對青椒精油得率的影響越大［17］。由圖2可知，曲面均較平緩，表明這些因素相互作用的影響不明顯，與方差分析結(jié)果一致（AB，AC，AD，BC，BD，CD 項的P＞0.05）。

2.4 驗證試驗

通過建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測青椒精油的最佳提取工藝條件為粉碎粒度63.43目、料液比1∶19.35、浸泡時間35.86 min、蒸餾時間146.23 min，在此條件下的精油得率為11.74%。以節(jié)流為出發(fā)點，結(jié)合實際損耗，將預(yù)測提取工藝條件修正為粉碎粒度60 目、料液比為1∶20（g∶mL）、浸泡時間36 min、蒸餾時間146 min。按修正后的條件進行3 次驗證試驗，平均青椒精油得率為11.76%（n=3），與理論值相差0.02%，表明此條件預(yù)測性好且較穩(wěn)定，可用于青椒精油的提取。

3 討論

目前，青椒精油提取方法的研究熱點主要集中在超臨界CO2萃取、超聲波輔助蒸餾、有機溶劑浸漬提取、微波輔助提取等現(xiàn)代提取工藝方法［18-20］，提取設(shè)備要求高，工藝復(fù)雜，提取成本較高，不利于工業(yè)化大生產(chǎn)，而傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取法的設(shè)備要求較低，經(jīng)濟適用，操作簡單，精油提取率較高，較現(xiàn)代提取方法更適于工業(yè)化大生產(chǎn)。響應(yīng)面法可通過較少的試驗設(shè)計完成多因素、多水平考察，較正交試驗法和均勻設(shè)計法更全面，可用于預(yù)測試驗范圍內(nèi)任何試驗點的理論值［21］。本研究中采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選青椒精油的水蒸氣蒸餾提取工藝，為青椒精油的產(chǎn)品研發(fā)奠定了試驗基礎(chǔ)。

采用水蒸氣蒸餾法提取精油工藝主要影響因素多為粉碎粒度、料液比、浸泡時間、蒸餾時間，針對青椒精油的水蒸氣蒸餾研究基本未考慮粉碎粒度，預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，粉碎粒度對精油得率影響較大，故對粉碎粒度、料液比、浸泡時間、蒸餾時間4個因素進行單因素考察，確定最佳單因素，并以此為基礎(chǔ)確定Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計各因素與水平。

A.粉碎粒度-液料比 B.粉碎粒度-浸泡時間 C.粉碎粒度-蒸餾時間 D.液料比-浸泡時間 E.液料比-蒸餾時間 F.浸泡時間-蒸餾時間圖2 青椒精油得率與各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖與二維等高線圖A.Grinding granule size-liquid/solid ratio B.Grinding granule size-soaking time C.Grinding granule size-distillation time D.Liquid/solid ratio-soaking time E.Liquid/solid ratio-distillation time F.Soaking time-distillation timeFig.2 Three-dimensional response surface diagram and two-dimensional contour diagram of the interaction between the yield of volatile oil from Zanthoxylum schinifolium and various factors

經(jīng)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得貴州產(chǎn)青椒精油最佳提取工藝為粉碎粒度60 目、料液比1∶20（g∶mL）、浸泡時間36 min、蒸餾時間146 min，精油得率為11.76%（n=3）。該優(yōu)選工藝提取效率較高，且穩(wěn)定可靠，初步說明貴州省德江縣國家級花椒示范基地所產(chǎn)青椒品質(zhì)較優(yōu)良。本研究為高值化花椒精油產(chǎn)品的研發(fā)和貴州省花椒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了良好的理論依據(jù)。