土大黃根提取物對銀屑病模型小鼠血清代謝組學指標的影響*

巴合沙拉·馬乃甫，尤力都孜·買買提，玉素甫江·艾力，阿布都帕塔爾·阿布迪熱扎克，熱比姑麗·伊斯拉木△

（1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆 烏魯木齊 830000）

土大黃是蓼科酸模屬RumexL.植物，產于新疆各地。民間調查發現，維吾爾族常用土大黃根、莖和全草水煎煮液治療銀屑病等各種皮膚病，且療效較好。本課題組分別用小鼠尾部鱗片角化不全模型、雌鼠陰道上皮模型［1］、普萘洛爾誘導耳部角化模型［2］、咪喹莫特誘導小鼠模型［3-4］等銀屑病樣模型開展土大黃治療銀屑病的藥理學研究，以驗證民間用藥的合理性和科學性。本研究中以土大黃干預銀屑病角化異常的傳統天然模型（小鼠尾部鱗片角化不全模型），從小鼠血清代謝組學、尾部皮膚組織病理學角度探討了土大黃根治療銀屑病的作用機制，為開發及利用維吾爾民間藥材土大黃奠定基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：DW-86L338J 型海爾超低溫冰箱（海爾集團公司）；5415D 型低溫高速離心機（德國Eppendorf 股份公司）；Inova 600 兆超導核磁共振波譜儀（美國Varian公司），配有核磁共振波譜儀工作站；LEICA TP1020 型生物組織脫水機，LEICA RM2235 型切片機，LEICA DM4000型生物顯微鏡，LEICA LAS V4.5版顯微成像系統，均購自德國萊卡公司；KD-BMⅢ型生物組織包埋機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）。

試藥：土大黃根（新疆華安中藥飲片有限責任公司，批號為12110），經新疆大學資源與環境科學學院努爾巴依·阿不都沙力克教授鑒定為正品；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33020822，批號為140670）；消銀顆粒（陜西康惠制藥股份有限公司，國藥準字Z20000019，批號為130809）；異常黏液質成熟劑浸膏粉［新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院制劑室提供，木尼孜其白里海密，維吾爾語命名為Munziq Balgam（MB），批準文號M20052633］；重水（D2O，Cambridage Isotop Laboratories，Inc.）。

動物：KM 小鼠80只，雄性，體質量18～22 g，由新疆實驗動物研究中心提供。實驗動物生產許可證號為SCXK（新）2011-0001，實驗動物使用許可證號為SYXK（新）2011-0005。實驗開始前檢疫2 d，觀察一般狀況，最終選用符合要求的70只小鼠用于實驗。本實驗已通過新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所藥物安全性評價中心審核，均符合動物倫理委員會的管理準則。

1.2 方法

土大黃根提取物制備［1-5］：稱取適量土大黃根，加8 倍量70%乙醇溶液室溫密閉浸泡1 h，回流提取3次，每次1.5～2.0 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，真空干燥，得干膏粉。

小鼠給藥劑量計算［2-8］：消銀顆粒臨床服用量為0.175 g/（kg·d），根據人與實驗小鼠體質量比例計算，本研究中的用量與臨床等效劑量相當，設定為1.577 g/（kg·d）。同公式換算得地塞米松的臨床等效量為1.05 mg/（kg·d），異常黏液質成熟劑浸膏粉的臨床等效量為2 g/（kg·d）［6］。土大黃根提取物用藥劑量根據小鼠單次給藥毒性實驗和大鼠反復給藥毒性實驗的有效劑量設置為1，2，4 g/kg（低、中、高劑量）［7-8］。

建模、分組與給藥：小鼠尾部鱗片角化不全模型［9-10］于20 世紀70 年代初被應用于探討藥物抗銀屑病樣作用。正常情況下，小鼠尾部鱗片的表皮角質層角質形成細胞保留有細胞核，而顆粒層細胞缺失，其天然的角化形式與人類銀屑病表皮相似，可模擬銀屑病角化不全的特點，故可作為銀屑病角化異常的傳統天然模型。將70 只KM 小鼠按體質量隨機分為模型對照組（CON 組），化學藥陽性對照組（DXM組，1.05 mg/ kg醋酸地塞米松片），中藥制劑陽性對照組（XYKL組，1.577 g/ kg 消銀顆粒），維吾爾醫藥陽性對照組（MB組，2 g/kg 異常黏液質成熟劑浸膏粉），土大黃根提取物低、中、高劑量組（RE-L 組、RE-M 組、RE-H組，1，2，4 g/kg），各10只。CON 組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉（0.5%CMC-Na），其余各組小鼠以每10 g體質量灌胃0.2 mL相應藥物，每天1次，連續15 d。實驗過程中，觀察小鼠一般狀況，每周測1次體質量，根據體質量變化調整給藥劑量。

樣品收集與處理：末次給藥2 h后，采用摘眼球法取血，4 ℃離心（轉速為3 000 r/ min）10 min，分離血清，保存于-80 ℃低溫冰箱。測試時室溫解凍，取血樣200 μL，加400 μL 磷酸鹽生理鹽水緩沖液，混勻，放置10 min，低溫高速離心機離心（轉速為10 000 r/min，離心半徑為5 cm）10 min，取上清液550 μL，置5 mm 核磁管內，取鼠尾距離根部3 cm 皮膚標本，用15%甲醛水溶液固定、脫水、石蠟包埋，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察尾部皮膚組織病理學變化。

核磁共振氫譜測試：將裝有血樣的5 mm核磁管置核磁共振儀進行1H-NMR譜測定，本實驗均在Inova 600兆核磁共振波譜儀上用ID探頭以弛豫編輯（CPMG）脈沖序RD-90°-τ-180°-2τ-180°-2τ-180°-…-ACQ進行。設置參數1H 核磁共振頻率599.15 MHz，掃描累積128次，采樣數據點32 768，譜寬20×10-6，采樣延遲2 min，采樣時間（AQ）1.64 min，測試溫度25 ℃，采用預飽和方法壓制水峰。為了解譜工作的順利進行，選取質量較高的1H-NMR 譜樣品進行二維核磁共振圖譜測試，包括1H-1H 同核相關譜（1H-1H COSY）、質子全相關譜（TOCSY）和J-分解譜（J-RES）等，用于譜圖中各峰的指認，以便鑒定代謝成分。

1.3 統計學處理

受原始1H-NMR 圖譜數據量龐大、數據點具有高度相關性、溶劑峰等因素影響，需對1H-NMR 圖譜數據進行預處理。本研究中血樣1H-NMR 圖譜數據采用0.3 Hz 線寬的指數窗函數，先進行傅里葉變換后進行基線及相位調整。血清圖譜以α-葡萄糖δ5.233×10-6質子信號作為參考定標，在δ9.0～0.5 范圍內對每段δ0.003 積分段自動積分。同時，排除血清1H-NMR 譜水信號范圍為δ5.22～4.66的積分數據，對剩余積分值進行歸一化處理。積分值導入Microsoft Excel軟件，采用SIMCA-P+11.0 軟件包進行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），根據所得代謝物相關系數確定對照組與給藥組的差異性代謝成分，檢驗水準α=0.05，以R2X，R2Y，Q2為所建模型的質量評價指標。本研究中通過Pearson 相關系數顯著性檢驗的r與R的臨界值確定有統計學意義（P＜0.05）的代謝產物臨界值。

2 結果

2.1 OPLS-DA 模式分析

利用OPLS-DA 建立模型的方法評估各組小鼠的代謝物差異，結果顯示，CON 組與各給藥組間均有一定分離趨勢，小鼠尾部鱗片角化不全模型的區分程度和預測程度均可達到要求，CON 組與DXM 組、XYKL 組、MB組、RE-L組、RE-M組、RE-H組的模型預測參數見圖1。結果表明，醋酸地塞米松，消銀顆粒，異常黏液質成熟劑浸膏粉，低、中、高劑量土大黃根提取物對尾部鱗片角化不全模型小鼠均有一定治療作用。

2.2 血清標記物的發現與鑒定

2.2.1 CON 組與各陽性對照藥組血清差異性代謝物組分

注：模型預測參數分別為R2X=0.40，R2Y=0.87，Q2=0.71；R2X=0.36，R2Y=0.81，Q2=0.51；R2X=0.37，R2Y=0.91，Q2=0.71；R2X=0.27，R2Y=0.94，Q2=0.76；R2X=0.33，R2Y=0.96，Q2=0.85；R2X=0.22，R2Y=0.95，Q2=0.80。圖1 各組小鼠血清OPLS-DA得分圖Note：Predictive parameters of the model are as follows：R2 X=0.40，R2 Y=0.87 and Q2=0.71；R2 X=0.36，R2 Y=0.81 and Q2=0.51；R2 X=0.37，R2 Y=0.91 and Q2=0.71；R2 X=0.27，R2 Y=0.94 and Q2=0.76；R2 X=0.33，R2 Y=0.96 and Q2=0.85；R2 X=0.22，R2 Y=0.95 and Q2=0.80.Fig.1 Scoring plot of OPLS-DA of serum in each group

通過數據分析，CON 組與DXM 組、XYKL 組、MB 組小鼠血清中共發現23 種差異性代謝物，詳見表1。與CON 組比較，DXM 組、XYKL 組、MB 組小鼠血清丙氨酸、甘氨酸、乳酸水平均顯著升高，不飽和脂類、低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）水平均顯著降低（P＜0.05）；DXM 組、XYKL 組小鼠血清亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、膽堿、蛋氨酸、乙酸、苯丙氨酸水平均顯著升高（P＜0.05）；DXM 組小鼠血清肌醇、鯊肌醇、乙酰半胱氨酸、檸檬酸水平均顯著升高，糖蛋白和丙酮水平均顯著降低（P＜0.05）；XYKL組小鼠血清瓜氨酸和肌酸水平均顯著升高（P＜0.05）；MB 組小鼠血清肌醇和丙酮水平均顯著降低，肌酸水平顯著升高（P＜0.05）。

表1 模型對照組與陽性對照組小鼠血清主要差異性代謝物及相關系數Tab.1 Main differential metabolites and correlation coefficients in serum in the CON group and the positive control groups

2.2.2 CON 組與土大黃根提取物組血清差異性代謝物組分

通過數據分析，CON 組與RE-L 組、RE-M 組、RE-H 組小鼠血清中共發現13 種差異性代謝物，詳見表2。與CON組比較，RE-L組、RE-M組、RE-H 組小鼠血清丙氨酸、乳酸、甘氨酸、膽堿、肌酸水平均顯著升高，LDL和VLDL水平均顯著降低（P＜0.05）；RE-M 組、RE-H 組小鼠血清α-葡萄糖和β-葡萄糖水平均顯著升高，糖蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；RE-H 組小鼠血清不飽和脂類和苯丙氨酸水平均顯著升高，丙酮水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 模型對照組與土大黃根提取物組小鼠血清主要差異性代謝物及相關系數Tab.2 Main differential metabolites and correlation coefficients in serum in the CON group and the RE groups

2.3 皮膚組織病理學變化

CON 組小鼠皮膚完全角化，顆粒層變薄或缺乏。與CON 組比較，DXM 組、XYKL 組、MB 組小鼠均出現不同程度的顆粒細胞層增厚或促進形成顆粒細胞層，相互間略有差異，但不顯著；RE-L組、RE-M組、RE-H組小鼠也均出現不同程度的顆粒細胞層增厚或促進顆粒細胞層形成，且呈劑量規律性。與DXM組、XYKL組、MB組比較，RE-L 組、RE-M 組、RE-H 組小鼠尾部皮膚組織病理學變化略有差異，但不顯著。詳見圖2。

圖2 各組尾部鱗片角化不全模型小鼠皮膚組織病理變化（HE染色，×40，n=10）Fig.2 Histopathological changes of skin of mouse tail model in each group（HE staining，×40，n=10）

3 討論

銀屑病為常見慢性復發性炎性皮膚病，全球發病率為2%～3%，歐洲南部國家發病率為8%～11%［11］。近年來，銀屑病與代謝綜合征的相關性成為皮膚病領域的研究熱點，代謝組學技術為證候本質的研究提供了強有力的手段［12-17］。文獻［18-22］報道，代謝組學用于新藥篩選、作用機制、中樞神經系統疾病治療等的研究。動物模型是研究人類疾病病因、發病機制、治療方法的一種重要工具，其中銀屑病罕見于任何非人類動物，且自然出現的病例極少見，不適于進行科學研究。因此，建立銀屑病動物模型顯得尤為必要［23］。作為研究銀屑病的可用模型，應具備相應的組織病理學特征、類似發病機制、對抗治療藥物的相似反應。其中，小鼠尾部鱗片角化不全模型操作簡單，經濟易得，國內外公認，并普遍使用。本研究中利用銀屑病角化異常的傳統天然模型（小鼠尾部鱗片角化不全模型），經血清代謝組學、皮膚組織病理學檢查，初步探討了土大黃根提取物對實驗性銀屑病的作用機制。

研究結果顯示，灌胃給藥15 d后，對模型小鼠血清化學成分的影響，DXM 組、XYKL 組、MB 組主要表現為上調血清氨基酸（丙氨酸、甘氨酸）、乳酸，下調血清不飽和脂類、脂類（LDL 和VLDL）；DXM 組、XYKL 組主要表現為上調血清氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸）、膽堿、乙酸；DXM組主要表現為上調血清肌醇、鯊肌醇、乙酰半胱氨酸、檸檬酸，下調血清糖蛋白和丙酮；XYKL 組主要表現為上調血清瓜氨酸和肌酸；MB 組主要表現為上調血清肌酸，下調肌醇和丙酮。結果表明，地塞米松、消銀顆粒、異常黏液質成熟劑浸膏粉對模型小鼠血清化學成分的影響主要表現在上調血清氨基酸和乳酸，下調不飽和脂類、脂類（LDL和VLDL）水平而起作用，尤其是對血清丙氨酸、甘氨酸影響普遍。提示DXM組、XYKL組、MB組抗銀屑病作用代謝標記物主要為丙氨酸、甘氨酸、乳酸、不飽和脂類、脂類（LDL和VLDL），這與文獻［12-17］報道結論相似，但不同的陽性對照藥物代謝產物不同。

研究結果顯示，灌胃給藥15 d后，對模型小鼠血清化學成分的影響，RE-L 組、RE-M 組、RE-H 組主要表現為上調血清氨基酸（丙氨酸、甘氨酸）、肌酸、乳酸、膽堿，下調血清脂類（LDL和VLDL）；RE-M組、RE-H組主要表現為上調血清α-葡萄糖和β-葡萄糖，下調血清糖蛋白；RE-H 組主要表現為上調血清不飽和脂類和苯丙氨酸，下調血清丙酮。結果表明，土大黃根提取物對模型小鼠血清化學成分的影響主要表現在上調血清氨基酸和下調血清脂類（LDL 和VLDL）而起作用。提示土大黃根提取物（1，2，4 g/kg）抗銀屑病作用代謝標記物主要為丙氨酸、甘氨酸、肌酸、乳酸、膽堿、脂類（LDL 和VLDL），這與文獻［12-17］報道結論相似，但不同劑量土大黃根提取物的代謝產物不同。

研究結果顯示，灌胃給藥15 d后，HE 染色結果表明，CON 組小鼠皮膚完全角化，顆粒層變薄或缺乏；與CON組比較，DXM組、XYKL組、MB組、RE-L組、RE-M組、RE-H 組均可出現不同程度的顆粒細胞層增厚或促進顆粒細胞層形成。提示陽性對照藥物和土大黃根提取物均能改變其天然的角化形式與人類銀屑病表皮相似的小鼠尾部鱗片角化不全模型，具有治療銀屑病的作用。

綜上所述，地塞米松、消銀顆粒、異常黏液質成熟劑浸膏粉和土大黃根提取物均能調節尾部鱗片角化不全模型小鼠血清氨基酸及小分子物質代謝紊亂，升高血清丙氨酸、甘氨酸、乳酸水平，降低血清脂類（LDL和VLDL）水平，改善該模型小鼠的皮膚完全角化、顆粒層變薄或缺乏，達到治療銀屑病的作用。不同藥物對其模型的影響有差異，其中地塞米松臨床作用最強烈、血清差異性代謝物最多；其次為消銀顆粒、異常黏液質成熟劑浸膏粉、土大黃根提取物，但其優勢、實際作用價值有待深入研究。